通过颅窗口在新皮层的血流量为双光子成像方法

Biology

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Summary

皮质血流动力学,可以研究在体内注入尾静脉鼠类与双光子显微镜的成像荧光葡聚糖染料。本视频演示了如何通过玻璃覆盖的颅窗口准备在小鼠大脑皮层的图像血液血流动力学。

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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678, doi:10.3791/678 (2008).

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Abstract

生活的啮齿类动物的完整的大脑图像的脑血管(毛细血管大型船舶)并记录血流动力学的能力是一个强大的技术。使用双光子显微镜,在体内通过颅窗口,它是可能的形象静脉注射荧光染料。这允许一个形象皮质血管,也获得血流量的测量。这种技术最初是由大卫柯菲德和温弗里德Denk。该方法可用于研究脑缺血期间或之后的血流动力学,神经退行性疾病,脑肿瘤,脑生理学或正常。例如,它已被用来研究如何中风导致血流方向转移和血红细胞的速度或梗塞和周围的磁通的变化。在这里,我们将演示如何使用双光子显微镜图像血流动力学生活用小鼠尾静脉注射荧光染料的大脑皮层。

Protocol

尾静脉注射的右旋糖酐荧光染料

  1. 在以图像脑血管,动物必须静脉注射用荧光染料。我们用右旋糖酐标记的染料,因为右旋糖酐基团,防止过大脑的血液屏障和血管渗出的染料。
  2. 小鼠麻醉与异氟醚(归纳为4%,在注射1.5-2%)。
  3. 尾巴是用70%酒精消毒。
  4. 以26号针头,注入75-100微升5%V / V罗丹明右旋糖酐,生理盐水溶解的解决方案是通过尾静脉,沿尾轴的中间。
  5. 直到尿液排出体外,这将变成粉红色,在约2小时,如果使用一个罗丹明染料,染料,动物可能会尾静脉注射后立即成像。

使用双光子显微镜的血液流成像(总工期每节30-60分钟,取决于成像船只数量)

  1. 右旋糖酐的荧光染料注射后,鼠标麻醉与异氟醚(归纳为4%,成像1-1.5%)。
  2. 鼠标是使用钛棒牢固地附着在显微镜阶段,其中包含一个热调节的加热垫保持动物温暖。被应用到一些眼膏保持眼睛湿润。
  3. 颅窗口的玻璃盖是用70%酒精清洗。
  4. 窗口的位置平行于焦平面,为本视野下的4X目标。
  5. 最好是用数码相机的大脑水面舰艇的照片。这张照片将被用来作为参考的形象,在下面的成像会找到成像地区从每天反复。
  6. 4倍的目标是取代水浸泡不动阶段的40倍的目标。再次是数码照片的视野。在舞台操纵的坐标设置为零。
  7. 我们使用的图像采集软件ScanImage。这是由汤姆Pologruto和贝尔纳多萨巴蒂尼在卡雷尔斯沃博达(Pologruto等,2003)的实验室在Matlab。我们接下来对所有其他的设备有:激光,功率计,照片乘法器管,放大器等。
  8. 窗口适合进行成像面积是简单地在低倍率扫描,找到最好的地区。一旦确定,一个低倍率栈所选择的区域拍摄图像,其XY坐标注释。
  9. 要记录在小血管或毛细血管血流动力学,我们一起使用船只的利益至少有40微米的线扫描。这些单一的“扫荡”持久一秒钟,用尽可能少的激光功率和扫描坐标和角度写下做。
  10. 成像会议结束后,动物移动到温暖室,在那里可以从麻醉中恢复过来。

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Discussion

皮质血流动力学,可以研究在体内注入尾静脉鼠类与双光子显微镜的成像荧光葡聚糖染料。录像显示了如何通过玻璃覆盖的颅窗口准备在小鼠大脑皮层的图像血液血流动力学的方法。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich FD500S mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich R9379 mol wt ~70,000

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References

  1. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
  2. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
  3. Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Hi Carlos

    What is the thickness of the coverslip?thanks!

    Reply
    Posted by: Niloufar K.
    January 18, 2016 - 12:04 PM

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