Децеллюляризация молочных жировых колодок: вывод внеклеточных матричных гидрогелей из молочных жировых колодок

Overview

Это видео описывает метод получения внеклеточных матричных гидрогелей путем децеллюляризации мурин молочных жировых подушечек после облучения ex vivo для исследований in vitro. Этот гидрогель помогает имитировать in vivo ткани молочной железы окружающей среды после лучевой терапии для изучения поведения опухолевых клеток.

Protocol

1. Децеллюляризация

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура была адаптирована из ранее опубликованных методов, ориентированных на жировой децеллюляризации, которая включала деоксихолат натрия ионных моющих средств, а не додецил сульфат натрия для эффективного удаления ДНК.

1. На 1 день, удалить замороженные Mammary жира колодки или MFPs от -80 градусов по Цельсию и оттепели при комнатной температуре.
2. После размораживания, сухие MFPs кратко на деликатной задаче протрите. Взвешивание МФП с использованием аналитической шкалы.
3. Используя пару типсов с ножницами или скальпелем, разделите ткани на 3 мм х 3 мм х 3 мм образцов для изучения нетронутой ЭКМ и оставшейся ткани для производства гидрогеля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов зависит от количества методов тестирования, например, сбор двух образцов описан ниже: один для встраивания парафина (шаг 1.5) и один для замораживания в криостат встраивания среды, при желании (см. таблицу материалов и шаг 1.6).
4. Взвесь ткани. Если встраивается в парафин для секции, продолжайте шаг 1.5. При замораживании криостата встраивания среды для секций, продолжайте шаг 1.6.
5. В химическом капюшоне погрузите ткань в 10% нейтральный буферный формалин (NBF) (см. таблицу материалов)на 24 ч при 4 градусах Цельсия. Вымойте 3 раза в PBS в течение 5 минут каждый. Погрузим ткань в 30% сахарозы на 48 ч при 4 градусах Цельсия.
   1. Взвесь ткань теперь, когда эта часть была удалена. Продолжайте шаг 1.6.
6. В химическом капюшоне поместите части MFP в помеченную кассету, подготовленную криостацией, встраиваемой средой. Добавить больше криостата встраивания среды для покрытия ткани.
   1. Поместите кассету в стакан из 2-метилбутана (см. таблицу материалов),который предварительно охлаждается жидким азотом. Стакан должен иметь достаточно 2-метилбутана, чтобы покрыть дно, но не достаточно, чтобы погрузить кассету, потому что криостат встраивания среды не должны касаться 2-метилбутана. Пусть кассета сидеть в 2-метилбутан до криостата встраивания среды замерзает и становится непрозрачным.
   2. Оберните кассету (ы) в фольгу, этикетку, и оставить при -80 градусов по Цельсию до тех пор, пока используется для секции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ткани, помещенные непосредственно в криостат встраивания среды были секционированы на 5 мкм в то время как ткани инкубировали в сахарозе были секционированы на 30 мкм, чтобы сохранить адипоцитов морфологии.
7. Используйте типсы для ручного массажа оставшейся ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань части также могут быть помещены в 10% NBF для 24-48 ч, промыть в PBS, и оставили в 70% этанола до встраивания в парафин. После встраивания для окрашивания гематоксилина и эозинов (H и E) может быть использовано 5 секций мкм (см. раздел 2 ниже).
8. Поместите МФП в 6 см посуды с 5 мл 0,02% трипсина/0,05% раствора ЭДТА. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч. Спрей и протрите посуду 70% этанола перед размещением в инкубаторе.
9. Используйте 0,7 мм ситечко для мытья MFPs с деионизированной (DI) воды, обливая водой ткани в три раза. Используйте типсы, чтобы вручную массировать ткани между моет.
10. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите. Поместите ткани в предварительно автоклавный стакан, содержащий соответствующую по размеру бар перемешать. Обложка тканей с 60 мл 3% т-octylphenoxypolyethoxyethanol (см. Таблицу материалов) на 1 г ткани и перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
11. Свалить ткань и содержимое в ситечко. Промыть стакан с водой DI и залить на ткани. Повторите еще два раза. Используйте типсы для ручного массажа тканей между полосканиями.
12. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите. Поместите ткани и перемешать баров обратно в те же стаканы, и накрыть 60 мл 4% дезоксихольной кислоты на 1 г ткани. Перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре. Используйте минимум 20 мл.
13. Свалить ткань и содержимое в сетчатый ситечко. Промыть стакан с водой DI и залить на ткани. Повторите еще два раза. Используйте типсы для ручного массажа тканей между полосканиями.
14. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите.
15. Поместите ткани в тот же стакан с пресной водой DI, дополненной 1% пенициллин-стрептомицин. Обложка плотно с парафиновой пленкой. Оставьте на ночь при 4 градусов по Цельсию.
16. Вымойте ситечко и стаканы для использования на следующий день.
17. На 2-йдень слейте содержимое стакана в ситечко. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите.
18. Поместите MFPs в тот же стакан с соответствующим размером перемешать бар. Обложка с 60 мл 4% этанола / 0,1% ператетической кислоты раствор на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 2 ч при комнатной температуре.
19. Свалить ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте типсы для ручного массажа тканей. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл 1x PBS на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
20. Свалить ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте типсы для ручного массажа тканей. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл DI воды на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите один раз.
21. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите. Свалить ткань и содержимое в ситечко. Используйте типсы для ручного массажа тканей.
22. Поместите содержимое обратно в стакан. Обложка тканей с 60 мл 100% n-пропанола на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 1 ч при комнатной температуре.
23. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите. Свалить ткань и содержимое в 0,7 мм ситечко. Используйте типсы для ручного массажа тканей.
24. Поместите содержимое обратно в стакан. Вымойте ткань, покрыв ее 60 мл воды DI на 1 г ткани. Используйте минимум 20 мл. Перемешать в течение 15 минут при комнатной температуре. Повторите три раза.
25. Свалить ткань и содержимое в ситечко. Повторите шаги 2.3-2.6 для сбора кусочков ткани для инкубации сахарозы и замораживания в криостат встраивания среды.
26. Кратко высушите ткани на деликатной задаче протрите и взвесите. Поместите в помеченную трубку 15 мл. Заморозить при -80 градусов по Цельсию на ночь.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5