Tampons graisseux mammaires décellularisants : Hydrogels extracellulaires de matrice de mammary

Overview

Cette vidéo décrit une technique de dérivant des hydrogels extracellulaires de matrice en dcellularisant des garnitures mammaires murines de graisse suivant l’irradiation ex vivo pour des études in vitro. Cet hydrogel aide à imiter l’environnement in vivo tissu mammaire post-radiothérapie pour étudier le comportement des cellules tumorales.

Protocol

1. Décellularisation

REMARQUE: Cette procédure a été adaptée à partir de méthodes précédemment publiées axées sur la décellularisation adipeuse, qui comprenait le détergent ionique de désoxycholate de sodium plutôt que le sulfate de dodecyl de sodium pour enlever l’ADN efficacement.

1. Le jour 1,retirer les tampons de graisse mammaire congelés ou les MPF de -80 °C et décongeler à température ambiante.
2. Une fois décongelés, séchez brièvement les MPF sur un chiffon de tâche délicat. Pesez les MPF à l’aide d’une échelle analytique.
3. À l’aide d’une paire de forceps avec ciseaux ou d’un scalpel, diviser les tissus en échantillons de 3 mm x 3 mm x 3 mm pour l’étude de l’ECM intact et du tissu restant pour la production d’hydrogel.
   REMARQUE: Le nombre d’échantillons dépend du nombre de méthodes d’essai, par exemple la collecte de deux échantillons est décrite ci-dessous : l’un pour l’intégration de la paraffine (étape 1.5) et l’autre pour la congélation dans le milieu d’intégration cryostat, si désiré (voir le tableau des matériaux et l’étape 1.6).
4. Pesez les tissus. Si vous vous intégriez dans la paraffine pour la section, continuez à marcher 1,5. Si vous gèlez dans le milieu d’intégration cryostat pour la section, continuez à marcher 1.6.
5. Dans une hotte chimique, submerger le tissu dans de la formaline tamponnée neutre (NBF) (voir le tableau des matériaux)pendant 24 h à 4 °C. Laver 3 fois en PBS pendant 5 min chacun. Submerger le tissu dans 30% saccharose pendant 48 h à 4 °C.
   1. Pesez le tissu maintenant que cette pièce a été enlevée. Continuez à l’étape 1.6.
6. Dans une hotte chimique, placer les pièces MFP dans une cassette étiquetée préparé avec un milieu d’intégration cryostat. Ajouter plus de cryostat embedding milieu pour couvrir le tissu.
   1. Placez la cassette dans un bécher de 2 méthylbutane (voir la Table des matériaux)qui est pré-refroidi avec de l’azote liquide. Le bécher devrait avoir suffisamment de 2 méthylbutane pour couvrir le fond, mais pas assez pour submerger la cassette parce que le milieu d’intégration cryostat ne doit pas toucher le 2-méthylbutane. Laissez reposer la cassette dans le 2-méthylbutane jusqu’à ce que le cryostat intégrant moyen gèle et devienne opaque.
   2. Envelopper la cassette (s) dans du papier d’aluminium, l’étiquette et laisser à -80 °C jusqu’à ce qu’elle soit utilisée pour le décapage.
      REMARQUE: Les tissus placés immédiatement dans le milieu d’intégration de cryostat ont été sectionnés à 5 μm tandis que les tissus incubés dans le saccharose ont été sectionnés à 30 μm pour retenir la morphologie d’adipocyte.
7. Utilisez des forceps pour masser manuellement le reste du tissu.
   REMARQUE: Les morceaux de tissu peuvent également être placés dans 10% NBF pendant 24-48 h, rincés dans PBS, et laissés dans 70% d’éthanol jusqu’à intégrer dans la paraffine. Après l’intégration, des sections de 5 μm peuvent être utilisées pour la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) (voir la section 2 ci-dessous).
8. Placez les MFPs dans des plats de 6 cm avec une trypsine de 5 mL 0,02%/0,05% EDTA. Incuber à 37 °C pendant 1 h. Vaporiser et essuyer la vaisselle avec 70% d’éthanol avant de le placer dans l’incubateur.
9. Utilisez des passoires de 0,7 mm pour laver les MPF avec de l’eau déionisée (DI) en versant de l’eau sur le tissu à trois reprises. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus entre les lavages.
10. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser. Placez les tissus dans un bécher pré-autoclavé contenant une barre de remue-remous de taille appropriée. Couvrir les tissus de 60 mL de 3 % de t-octylphénoxypolyethoxyéthanol (voir le tableau des matériaux)par 1 g de tissu et remuer pendant 1 h à température ambiante. Utilisez un minimum de 20 mL.
11. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire. Rincer le bécher avec de l’eau DI et verser sur les tissus. Répétez deux fois de plus. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus entre les rinçages.
12. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser. Remettre les tissus et les barres remuer dans les mêmes bechers, et couvrir de 60 mL d’acide désoxycholic de 4 % par 1 g de tissu. Remuer pendant 1 h à température ambiante. Utilisez un minimum de 20 mL.
13. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire à mailles. Rincer le bécher avec de l’eau DI et verser sur les tissus. Répétez deux fois de plus. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus entre les rinçages.
14. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser.
15. Placez les tissus dans le même bécher avec de l’eau di fraîche complétée par 1% de pénicilline-streptomycine. Couvrir hermétiquement de film de paraffine. Laisser passer la nuit à 4 °C.
16. Laver les passoires et les bechers pour les utiliser le lendemain.
17. Le jour 2,égoutter le contenu du bécher dans une passoire. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser.
18. Placez les MPF dans le même bécher avec une barre d’agitation de taille appropriée. Couvrir de 60 mL 4 % d’éthanol/0,1 % de solution d’acide périacétique par 1 g de tissu. Utilisez un minimum de 20 mL. Remuer pendant 2 h à température ambiante.
19. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus. Remettre le contenu dans le bécher. Lavez les tissus en le couvrant de 60 mL de 1 x PBS par 1 g de tissu. Utilisez un minimum de 20 mL. Remuer pendant 15 min à température ambiante. Répétez une fois.
20. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus. Remettre le contenu dans le bécher. Lavez les tissus en les couvrant de 60 mL d’eau DI par 1 g de tissu. Utilisez un minimum de 20 mL. Remuer pendant 15 min à température ambiante. Répétez une fois.
21. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus.
22. Remettre le contenu dans le bécher. Couvrir les tissus de 60 mL de 100% n-propanol par 1 g de tissu. Utilisez un minimum de 20 mL. Remuer pendant 1 h à température ambiante.
23. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire de 0,7 mm. Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus.
24. Remettre le contenu dans le bécher. Lavez les tissus en les couvrant de 60 mL d’eau DI par 1 g de tissu. Utilisez un minimum de 20 mL. Remuer pendant 15 min à température ambiante. Répétez trois fois.
25. Jeter les tissus et le contenu dans une passoire. Répétez les étapes 2.3-2.6 pour recueillir des morceaux de tissu pour l’incubation du saccharose et la congélation dans le milieu d’intégration cryostat.
26. Sécher brièvement les tissus sur une tâche délicate essuyer et peser. Placer dans un tube de 15 mL étiqueté. Congeler à -80 °C pendant la nuit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5