Decellularisere mammary fett pads: Deriving Extracellular Matrix Hydrogels fra Mammary Fat Pads

Overview

Denne videoen beskriver en teknikk for å utlede ekstracellulære matrisehydrgeler ved å decellularisere murine mammary fettputer etter ex vivo bestråling for in vitro studier. Denne hydrogelen bidrar til å etterligne in vivo brystvevsmiljøet etter strålingsbehandling for å studere tumorcelleadferd.

Protocol

1. Decellularisering

MERK: Denne prosedyren ble tilpasset fra tidligere publiserte metoder fokusert på fettdecellularisering, som inkluderte natriumdeoksycholat ionisk vaskemiddel i stedet for natriumdodecylsulfat for å fjerne DNA effektivt.

1. På dag 1fjerner du frosne mammaryfettputer eller MFPer fra -80 °C og tiner ved romtemperatur.
2. Når de er tint, tørk MFPer kort på en delikat oppgaveserviett. Vei MFP-ene ved hjelp av en analytisk skala.
3. Bruk et par tang med saks eller en skalpell, del vev opp i 3 mm x 3 mm x 3 mm prøver for studier av intakt ECM og det gjenværende vevet for hydrogelproduksjon.
   MERK: Antall prøver avhenger av antall testmetoder, for eksempel samlingen av to prøver er beskrevet nedenfor: en for parafininnbygging (trinn 1.5) og en for frysing i kryostat innebyggingsmedium, om ønskelig (se materialtabellen og trinn 1.6).
4. Vei vevet. Hvis du bygger inn parafin for seksjonering, fortsetter du til trinn 1.5. Hvis du fryser i kryostatinnbyggingsmedium for seksjonering, fortsetter du til trinn 1.6.
5. I en kjemisk hette, senk vevet i 10% nøytral bufret formalin (NBF) (se materialtabellen) i 24 timer ved 4 °C. Vask 3 ganger i PBS i 5 min hver. Senk vevet ned i 30% sukrose i 48 timer ved 4 °C.
   1. Vei vevet nå som dette stykket er fjernet. Fortsett til trinn 1.6.
6. I en kjemisk hette plasserer du MFP-deler i en merket kassett preppet med kryostat innebygd medium. Tilsett mer kryostat innebyggingsmedium for å dekke vevet.
   1. Plasser kassetten i et beger med 2-metylbutan (se materialtabellen) som er forhåndskjølt med flytende nitrogen. Begeret skal ha nok 2-metylbutane til å dekke bunnen, men ikke nok til å senke kassetten fordi kryostatinnbyggingsmediet ikke skal berøre 2-metylbutane. La kassetten sitte i 2-metylbutane til kryostat-innebyggingsmediet fryser og blir ugjennomsiktig.
   2. Vikle kassetten(e) i folie, etikett og la den stå ved -80 °C til den brukes til seksjonering.
      MERK: Vev plassert umiddelbart i kryostat innebyggingsmedium ble seksjonert på 5 μm mens vev inkubert i sukrose ble seksjonert på 30 μm for å beholde adipocyttmorfologi.
7. Bruk tang til å massere det gjenværende vevet manuelt.
   MERK: Vevsstykker kan også plasseres i 10% NBF i 24-48 timer, skyllet i PBS, og igjen i 70% etanol til innebygging i paraffin. Etter innebygging kan 5 μm seksjoner brukes til hematoksylin og eosin (H & E) farging (se avsnitt 2 nedenfor).
8. Plasser MFP-ene i 6 cm retter med 5 ml 0,02% trypsin / 0,05% EDTA-løsning. Inkuber ved 37 °C i 1 time. Spray og tørk oppvasken med 70% etanol før du legger i inkubatoren.
9. Bruk 0,7 mm siler til å vaske MFPs med deionisert (DI) vann ved å helle vann over vevet tre ganger. Bruk tang til å massere vevet manuelt mellom vaskene.
10. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei. Legg vev i et forhåndsreklavert beger som inneholder en rørestang i riktig størrelse. Dekk vev med 60 ml 3% t-oktylfenoksypolyetoksyetanol (se materialtabellen) per 1 g vev og rør i 1 time ved romtemperatur. Bruk minst 20 ml.
11. Dump vev og innhold i en sil. Skyll begeret med DI-vann og hell på vev. Gjenta to ganger til. Bruk tang til å massere vevet manuelt mellom skyllinger.
12. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei. Legg vev og rør barer tilbake i samme beger, og dekk med 60 ml 4% deoksykolsyre per 1 g vev. Rør i 1 time ved romtemperatur. Bruk minst 20 ml.
13. Dump vev og innhold i en nettingsil. Skyll begeret med DI-vann og hell på vev. Gjenta to ganger til. Bruk tang til å massere vevet manuelt mellom skyllinger.
14. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei.
15. Legg vev i samme beger med friskt DI-vann supplert med 1% penicillin-streptomycin. Dekk tett med parafinfilm. La over natten ved 4 °C.
16. Vask siler og beger til bruk neste dag.
17. På dag 2, tøm begerinnholdet i en sil. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei.
18. Plasser MFPer i samme beger med en rørestang i riktig størrelse. Dekk med 60 ml 4% etanol / 0,1% peracetisk syreoppløsning per 1 g vev. Bruk minst 20 ml. Rør i 2 timer ved romtemperatur.
19. Dump vev og innhold i en 0,7 mm sil. Bruk tang til å massere vevet manuelt. Plasser innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 ml 1x PBS per 1 g vev. Bruk minst 20 ml. Rør i 15 min ved romtemperatur. Gjenta én gang.
20. Dump vev og innhold i en 0,7 mm sil. Bruk tang til å massere vevet manuelt. Legg innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 ml DI-vann per 1 g vev. Bruk minst 20 ml. Rør i 15 min ved romtemperatur. Gjenta én gang.
21. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei. Dump vev og innhold i en sil. Bruk tang til å massere vevet manuelt.
22. Legg innholdet tilbake i begeret. Dekk vev med 60 ml 100% n-propanol per 1 g vev. Bruk minst 20 ml. Rør i 1 time ved romtemperatur.
23. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei. Dump vev og innhold i en 0,7 mm sil. Bruk tang til å massere vevet manuelt.
24. Legg innholdet tilbake i begeret. Vask vevet ved å dekke det med 60 ml DI-vann per 1 g vev. Bruk minst 20 ml. Rør i 15 min ved romtemperatur. Gjenta tre ganger.
25. Dump vev og innhold i en sil. Gjenta trinn 2.3-2.6 for å samle vevsstykker for sukroseinkubasjon og frysing i kryostatinnbyggingsmedium.
26. Kort tørt vev på en delikat oppgave tørk og vei. Plasser i et merket 15 ml rør. Frys ved -80 °C over natten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5