Decellularizing Mammary Fat Pads: Afledning ekstracellulære Matrix Hydrogels fra Mammary Fat Pads

Overview

Denne video beskriver en teknik til at udlede ekstracellulære matrixhydrogels ved at decellularisere murine mammary fedtpuder efter ex vivo bestråling til in vitro-undersøgelser. Denne hydrogel hjælper med at efterligne in vivo brystvæv miljø post-strålebehandling for at studere tumor celle adfærd.

Protocol

1. Decellularisering

BEMÆRK: Denne procedure blev tilpasset fra tidligere offentliggjorte metoder med fokus på fedtdecellularisering, som omfattede natriumdeoxycholationisk ioniske vaskemiddel snarere end natrium dodecyl sulfat for at fjerne DNA effektivt.

1. På dag 1fjernes frosne Mammary Fat-puder eller MFP'er fra -80 °C og optøs ved stuetemperatur.
2. Når optøet, tør MFPs kort på en delikat opgave tørre. Afvej MMFP'erne ved hjælp af en analytisk skala.
3. Ved hjælp af et par pincet med saks eller skalpel opdeles vævet i 3 mm x 3 mm x 3 mm prøver til undersøgelse af den intakte ECM og det resterende væv til hydrogelproduktion.
   BEMÆRK: Antallet af prøver afhænger af antallet af testmetoder, f.eks.
4. Vej vævene. Hvis indlejring i paraffin til sektionsopdelning, skal du fortsætte til trin 1.5. Hvis der fryses i kryostatintegreringsmediet til sektionsindretning, skal du fortsætte til trin 1.6.
5. I en kemisk emhætte nedsænkes vævet i 10% neutral buffer formalin (NBF) (se materialetabellen)i 24 timer ved 4 °C. Vask 3 gange i PBS i 5 min hver. Nedsænk vævet i 30% saccharose i 48 timer ved 4 °C.
   1. Vej vævet nu, hvor dette stykke er blevet fjernet. Fortsæt til trin 1.6.
6. I en kemisk hætte, placere MFP stykker i en mærket kassette prepped med kryostat indlejring medium. Tilsæt mere kryostat indlejring medium til at dække vævet.
   1. Kassetten anbringes i et bægerglas med 2-methylbutan (se materialetabellen),som er forkølet med flydende nitrogen. Bægeret skal have nok 2-methylbutan til at dække bunden, men ikke nok til at nedsænke kassetten, fordi kryostatintegreringsmediet ikke bør røre ved 2-methylbutanen. Lad kassetten sidde i 2-methylbutanen, indtil kryostatindlejringsmediet fryser og bliver uigennemsigtigt.
   2. Kassetten eller kassetterne ombrydes i folie, etiket og efterlades ved -80 °C, indtil de bruges til sektionsopdele.
      BEMÆRK: Væv, der straks blev anbragt i kryostatintegreringsmedium, blev sektionsopdelt ved 5 μm, mens væv, der inkuberes i saccharose, blev sektioneret ved 30 μm for at bevare adipocytmorfologi.
7. Brug pincet til manuelt at massere det resterende væv.
   BEMÆRK: Vævsstykker kan også placeres i 10% NBF i 24-48 timer, skylles i PBS, og efterlades i 70% ethanol indtil indlejring i paraffin. Efter indlejring kan der anvendes 5 μm sektioner til hematoxylin og eosin (H & E) farvning (se punkt 2 nedenfor).
8. Sæt MFP'erne i 6 cm retter med 5 ml 0,02% trypsin/0,05% EDTA-opløsning. Inkuber ved 37 °C i 1 time. Spray og tør opvasken med 70% ethanol, før du placerer i inkubatoren.
9. Brug 0,7 mm sien til at vaske MMFP'erne med deioniseret (DI) vand ved at hælde vand over vævet tre gange. Brug pincet til manuelt at massere vævet i mellem vasker.
10. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje. Placer væv i et præ-autoklaveret bægerglas, der indeholder en passende størrelse rørestang. Dæk væv med 60 mL på 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (se materialetabellen)pr. 1 g væv og rør i 1 time ved stuetemperatur. Brug mindst 20 mL.
11. Dump væv og indhold i en si. Skyl bægeret med DI vand og hæld på væv. Gentag to gange mere. Brug pincet til manuelt at massere vævet i mellem skylninger.
12. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje. Placer væv og rørstænger tilbage i de samme bægerglas, og dække med 60 mL af 4% deoxycholic syre pr 1 g væv. Rør i 1 time ved stuetemperatur. Brug mindst 20 mL.
13. Dump væv og indhold i en mesh si. Skyl bægeret med DI vand og hæld på væv. Gentag to gange mere. Brug pincet til manuelt at massere vævet i mellem skylninger.
14. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje.
15. Placer væv i samme bægerglas med frisk DI vand suppleret med 1% penicillin-streptomycin. Dæk tæt med paraffin film. Lad natten over ved 4 °C.
16. Vask sien og bægerglas til brug den følgende dag.
17. På dag 2skal du dræne bægerindholdet i en si. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje.
18. Placer MFP'er i samme bægerglas med en rørestang i passende størrelse. Dæk med 60 ml 4% ethanol/0,1% perdikesyreopløsning pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 2 timer ved stuetemperatur.
19. Dump væv og indhold i en 0,7 mm si. Brug pincet til manuelt at massere vævet. Placer indholdet tilbage i bægeret. Vask væv ved at dække det med 60 mL 1x PBS pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag én gang.
20. Dump væv og indhold i en 0,7 mm si. Brug pincet til manuelt at massere vævet. Placer indholdet tilbage i bægeret. Vask væv ved at dække det med 60 mL DI vand pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag én gang.
21. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje. Dump væv og indhold i en si. Brug pincet til manuelt at massere vævet.
22. Placer indholdet tilbage i bægeret. Dæk væv med 60 mL på 100% n-propanol pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 1 time ved stuetemperatur.
23. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje. Dump væv og indhold i en 0,7 mm si. Brug pincet til manuelt at massere vævet.
24. Placer indholdet tilbage i bægeret. Vask væv ved at dække det med 60 mL DI vand pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag tre gange.
25. Dump væv og indhold i en si. Gentag trin 2.3-2.6 for at indsamle vævsstykker til saccharoseinkubation og frysning i kryostatintegreringsmedium.
26. Kort tørt væv på en delikat opgave tørre og veje. Placer i et mærket 15 mL rør. Frys ved -80 °C natten over.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5