Dezellularisierung von Mammary Fat Pads: Ableiten von extrazellulären Matrix-Hydrogelen von Mammary Fat Pads

Overview

Dieses Video beschreibt eine Technik der Ableitung extrazellulärer Matrixhydrogele durch Dezellularisierung muriner Brustfettpolster nach ex vivo Bestrahlung für In-vitro-Studien. Dieses Hydrogel hilft, die in vivo Brustgewebe-Umgebung nach der Strahlenbehandlung zu imitieren, um das Verhalten von Tumorzellen zu untersuchen.

Protocol

1. Dezellularisierung

HINWEIS: Dieses Verfahren wurde von zuvor veröffentlichten Methoden angepasst, die sich auf die Adipo-Dezellularisierung konzentrierten, die das Natriumdeoxycholat-Ionikumsaner statt Natriumdodecylsulfat umfasste, um DIE DNA effizient zu entfernen.

1. Am 1. Taggefrorene Mammary Fat Pads oder MFPs von -80 °C entfernen und bei Raumtemperatur auftauen.
2. Nach dem Auftauen, trocknen MFPs kurz auf einem empfindlichen Aufgabenwischen. Wiegen Sie die MFPs mit einer analytischen Skala.
3. Teilen Sie gewebe mit einem Zangenpaar mit Schere oder skalpell in 3 mm x 3 mm x 3 mm Proben auf, um das intakte ECM und das restliche Gewebe für die Hydrogelproduktion zu untersuchen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Proben hängt von der Anzahl der Prüfverfahren ab, z.B. wird die Entnahme von zwei Proben nachfolgend beschrieben: eine für Paraffineinbettung (Schritt 1.5) und eine für das Einfrieren in Kryostateinbettungsmedium, falls gewünscht (siehe Materialtabelle und Schritt 1.6).
4. Wiegen Sie das Gewebe. Wenn Sie paraffin zum Schnitt in Paraffin einbetten, fahren Sie mit Schritt 1.5 fort. Wenn das Einfrieren in Kryostat-Einbettungsmedium für Schnitte, fahren Sie mit Schritt 1.6 fort.
5. In einer chemischen Haube das Gewebe in 10% neutral gepuffertes Formalin (NBF) (siehe Materialtabelle)für 24 h bei 4 °C untertauchen. Waschen Sie 3 mal in PBS für 5 min jeder. Tauchen Sie das Gewebe in 30% Saccharose für 48 h bei 4 °C.
   1. Wiegen Sie das Gewebe jetzt, da dieses Stück entfernt wurde. Fahren Sie mit Schritt 1.6 fort.
6. In einer chemischen Kapuze mandlassen, mFP-Stücke in eine beschriftete Kassette geben, die mit Kryostat-Einbettungsmedium versehen ist. Fügen Sie weitere Kryostat-Einbettungsmittel hinzu, um das Gewebe zu bedecken.
   1. Legen Sie die Kassette in ein Becherglas aus 2-Methylbutan (siehe Materialtabelle), das mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt ist. Der Becher sollte genug 2-Methylbutan haben, um den Boden zu bedecken, aber nicht genug, um die Kassette zu untertauchen, da das Kryostat-Einbettmedium das 2-Methylbutan nicht berühren sollte. Lassen Sie die Kassette im 2-Methylbutan sitzen, bis das Kryostateinbettungsmedium gefriert und undurchsichtig wird.
   2. Die Kassette in Folie, Etikett wickeln und bei -80 °C lassen, bis sie zum Schnitt verwendet wird.
      HINWEIS: Gewebe, die sofort in Kryostat-Einbettungsmedium gelegt wurden, wurden auf 5 m geschnitten, während in Saccharose inkubierte Gewebe auf 30 m geschnitten wurden, um die Adipozytenmorphologie beizubehalten.
7. Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende Gewebe manuell zu massieren.
   HINWEIS: Gewebestücke können auch in 10% NBF für 24-48 h platziert werden, in PBS gespült und in 70% Ethanol bis zur Einbettung in Paraffin gelassen werden. Nach der Einbettung können 5 m Abschnitte für Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E) verwendet werden (siehe Abschnitt 2 unten).
8. Legen Sie die MFPs in 6 cm Geschirr mit 5 ml 0,02% Trypsin/0,05% EDTA-Lösung. Bei 37 °C für 1 h inkubieren. Sprühen und wischen Sie das Geschirr mit 70% Ethanol, bevor Sie es in den Inkubator legen.
9. Verwenden Sie 0,7 mm Siebe, um die MFPs mit deionisiertem (DI) Wasser zu waschen, indem Sie dreimal Wasser über das Gewebe gießen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Wärten manuell zu massieren.
10. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Legen Sie Gewebe in einen vorautoklavischen Becher, der einen entsprechend großen Rührstab enthält. Gewebe mit 60 ml 3% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (siehe Materialtabelle)pro 1 g Gewebe abdecken und 1 h bei Raumtemperatur umrühren. Verwenden Sie mindestens 20 ml.
11. Gewebe und Inhalt in ein Sieb werfen. Spülen Sie den Becher mit DI-Wasser und gießen Sie auf Gewebe. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
12. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Gewebe und Rührstäbe wieder in die gleichen Becher legen und mit 60 ml 4% Desoxycholsäure pro 1 g Gewebe abdecken. 1 h bei Raumtemperatur umrühren. Verwenden Sie mindestens 20 ml.
13. Gewebe und Inhalt in ein Netzsieb werfen. Spülen Sie den Becher mit DI-Wasser und gießen Sie auf Gewebe. Wiederholen Sie dies noch zwei Mal. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe zwischen den Spülungen manuell zu massieren.
14. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen.
15. Legen Sie Gewebe in den gleichen Becher mit frischem DI-Wasser, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin. Dicht mit Paraffinfolie bedecken. Über Nacht bei 4 °C lassen.
16. Waschen Sie sich Sie und Becher für den nächsten Tag.
17. Am 2. Tagbecheren Sie den Inhalt des Bechers in ein Sieb ab. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen.
18. Legen Sie MFPs in den gleichen Becher mit einer entsprechend großen Rührstange. Abdeckung mit 60 ml 4% Ethanol/0,1% Peressigsäurelösung pro 1 g Gewebe. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 2 h bei Raumtemperatur umrühren.
19. Gewebe und Inhalt in ein 0,7 mm Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Waschen Sie Gewebe, indem Sie es mit 60 ml 1x PBS pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie dies einmal.
20. Gewebe und Inhalt in ein 0,7 mm Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Waschen Sie Gewebe, indem Sie es mit 60 ml DI-Wasser pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie dies einmal.
21. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Gewebe und Inhalt in ein Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren.
22. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Gewebe mit 60 ml 100% n-Propanol pro 1 g Gewebe abdecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 1 h bei Raumtemperatur umrühren.
23. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. Gewebe und Inhalt in ein 0,7 mm Sieb werfen. Verwenden Sie Zangen, um das Gewebe manuell zu massieren.
24. Legen Sie den Inhalt wieder in den Becher. Waschen Sie Gewebe, indem Sie es mit 60 ml DI-Wasser pro 1 g Gewebe bedecken. Verwenden Sie mindestens 20 ml. 15 min bei Raumtemperatur umrühren. Wiederholen Sie dies dreimal.
25. Gewebe und Inhalt in ein Sieb werfen. Wiederholen Sie die Schritte 2.3–2.6, um Gewebestücke für die Saccharoseinkubation und das Einfrieren im Kryostateinbettungsmedium zu sammeln.
26. Kurz trockenes Gewebe auf einer empfindlichen Aufgabe wischen und wiegen. In ein beschriftetes 15 ml-Rohr geben. Über Nacht bei -80 °C einfrieren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5