미마리 지방 패드탈세포: 매머 지방 패드에서 세포외 매트릭스 하이드로겔을 제거

Overview

이 비디오는 체외 연구에 대한 전 생체 조사 다음 murine mammary 지방 패드를 탈세포화하여 세포외 매트릭스 하이드로겔을 유도하는 기술을 설명합니다. 이 하이드로겔은 종양 세포 행동을 연구하기 위해 방사선 후 생체 내 유방 조직 환경을 모방하는 데 도움이됩니다.

Protocol

1. 세포 탈세포화

참고: 이 절차는 DNA를 효율적으로 제거하기 위해 도데실 황산나트륨보다는 탈옥염 이온 세제 나트륨을 포함하는 지방 탈세포화에 초점을 맞춘 이전에 발표된 방법에서 채택되었다.

1. 1일째에는냉동 유방 지방 패드 또는 MFP를 -80°C에서 제거하고 실온에서 해동하십시오.
2. 일단 해동, 섬세한 작업 닦아에 잠시 건조 MVP. 분석 척도를 사용하여 MP의 무게를 측정합니다.
3. 가위 또는 메스가있는 집게 쌍을 사용하여 조직을 3mm x 3mm x 3mm 샘플로 나누어 그대로 ECM및 하이드로겔 생산을위한 나머지 조직을 연구하십시오.
   참고: 샘플의 수는 테스트 방법의 수에 따라 달라집니다, 예를 들어 두 샘플의 수집은 아래에 설명되어 있습니다 : 파라핀 포함 (단계 1.5) 및 원하는 경우 극저온 임베드 매체에서 동결을위한 하나 (재료의 표 및 단계 1.6 참조).
4. 조직의 무게를 측정합니다. 단면에 파라핀에 포함하는 경우 1.5단계를 계속합니다. 단면에 대한 극저온 에 동결 배지를 포함, 단계를 계속 1.6.
5. 화학 적 후드에서, 4 °C에서 24 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린 포르말린 (NBF)(재료의 표참조)에 조직을 침수. PBS에서 3회 3회 세척하여 각각 5분 동안 세척합니다. 4°C에서 48시간 동안 30% 자당에 조직을 담급한다.
   1. 이 조각이 제거된 지금 조직을 무게. 1.6 단계를 계속합니다.
6. 화학 후드에, 냉동 내장 매체로 준비 라벨 카세트에 MFP 조각을 배치합니다. 조직을 커버하기 위해 더 많은 극저온 포함 매체를 추가합니다.
   1. 액체 질소로 미리 냉각되는 2-메틸부탄(재료 표 참조)의비커에 카세트를 놓습니다. 비커는 바닥을 덮기에 충분한 2-메틸부탄을 가져야하지만 극저온 내장 매체가 2-메틸부탄을 만지지 않아야하기 때문에 카세트를 침수하기에충분하지 않아야합니다. 카세트가 저울질 포함 매체가 동결되고 불투명해질 때까지 2-메틸부탄에 앉게 하십시오.
   2. 카세트(들)를 호일, 라벨로 감싸고 단면에 사용될 때까지 -80°C로 둡니다.
      참고: 저온질 임베딩 배지에 즉시 배치된 조직은 5 μm에서 단면화되었고, 자당에서 배양된 조직은 30 μm에서 분리되어 형포세포 형태를 유지하였다.
7. 집게를 사용하여 나머지 조직을 수동으로 마사지하십시오.
   참고: 조직 조각은 또한 24-48 h에 대한 10 % NBF에 배치 될 수있다, PBS에서 헹구고, 파라핀에 포함 될 때까지 70 % 에탄올에 남아. 포함 후, 5 μm 섹션은 헤마톡시린과 에오신 (H & E) 염색에 사용할 수 있습니다 (아래 섹션 2 참조).
8. 5mL 0.02% 트립신/0.05% EDTA 솔루션으로 6cm 요리에 MVP를 배치합니다. 1 h에 대한 37 °C에서 인큐베이션. 인큐베이터에 넣기 전에 70% 에탄올로 접시를 뿌리고 닦으신다.
9. 0.7mm 스트레이너를 사용하여 조직에 물을 세 번 부어 탈이온화 (DI) 물로 MPP를 씻어. 집게를 사용하여 세차 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
10. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다. 적절한 크기의 교반 바가 들어 있는 사전 오토클레이브 비커에 조직을 배치합니다. 조직 1g당 3%t-옥티펜옥시폴리에톡시에탄올(재료표 참조)의 60mL로 조직을 덮고 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 최소 20mL를 사용합니다.
11. 조직과 내용을 여과기에 덤프합니다. 비커를 DI 물로 헹구고 조직에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 집게를 사용하여 헹기 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
12. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다. 조직을 놓고 바를 같은 비커에 넣고 조직 1 g당 4 % 탈옥산60mL로 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 최소 20mL를 사용합니다.
13. 메쉬 여과기에 조직과 내용을 덤프합니다. 비커를 DI 물로 헹구고 조직에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 집게를 사용하여 헹기 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
14. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다.
15. 1% 페니실린-연쇄 절제술로 보충된 신선한 DI 물로 동일한 비커에 티슈를 배치합니다. 파라핀 필름으로 단단히 덮습니다. 4 °C에서 하룻밤 을 둡니다.
16. 다음 날 사용 시 스트레이너와 비커를 씻으세요.
17. 2일째에는비커 내용물을 여조로 배출합니다. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다.
18. 적절한 크기의 교반 바를 가진 동일한 비커에 MPPs를 배치합니다. 60 mL 4% 에탄올/0.1% 백내장 용액으로 1g의 조직당 커버하십시오. 최소 20mL를 사용합니다. 실온에서 2시간 동안 저어줍니다.
19. 0.7mm 여과기에 조직과 내용을 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용내용을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1 g 당 1 x PBS의 60 mL로 덮어 조직을 씻어. 최소 20mL를 사용합니다. 실온에서 15분 간 저어줍니다. 한 번 반복합니다.
20. 0.7mm 여과기에 조직과 내용을 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1 g 당 60 mL DI 물로 덮어 조직을 씻어. 최소 20mL를 사용합니다. 실온에서 15분 간 저어줍니다. 한 번 반복합니다.
21. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다. 조직과 내용을 여과기에 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오.
22. 내용을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1 g 당 100 % n 프로파놀의 60 mL로 조직을 덮습니다. 최소 20mL를 사용합니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.
23. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다. 0.7mm 여과기에 조직과 내용을 덤프합니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오.
24. 내용을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1 g 당 60 mL의 DI 물로 덮어 조직을 씻으시면 조직을 씻으시면 됩니다. 최소 20mL를 사용합니다. 실온에서 15분 간 저어줍니다. 세 번 반복합니다.
25. 조직과 내용을 여과기에 덤프합니다. 2.3-2.6단계를 반복하여 자당 배양을 위한 조직 조각을 수집하고 극저온 포함 매체로 동결한다.
26. 섬세한 작업에서 간단히 건조한 조직을 닦고 무게를 측정합니다. 라벨이 부착된 15mL 튜브에 놓습니다. 하룻밤 -80 °C에서 동결하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5