मैमेरी फैट पैड्स को डिसेल्युलराइज करना: मैमरी फैट पैड्स से एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स हाइड्रोगेल प्राप्त करना

Overview

यह वीडियो इन विट्रो अध्ययनों के लिए पूर्व वीवो विकिरण के बाद मुरीन मैमरी फैट पैड को डीसेल्युलर करके एक्ससेलेलुरल मैट्रिक्स हाइड्रोगेल्स प्राप्त करने की तकनीक का वर्णन करता है। यह हाइड्रोगेल ट्यूमर सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए वीवो स्तन ऊतक पर्यावरण के बाद विकिरण उपचार में नकल करने में मदद करता है।

Protocol

1. डिसेलुलराइजेशन

नोट: इस प्रक्रिया को पहले प्रकाशित तरीकों से अनुकूलित किया गया था जो एडीपोस डिसेलुलराइजेशन पर केंद्रित था, जिसमें डीएनए को कुशलतापूर्वक हटाने के लिए सोडियम डीऑक्सीकोटल आयनिक डिटर्जेंट के बजाय सोडियम डिऑक्सीकोटल आयनिक डिटर्जेंट शामिल था।

1. 1 दिनपर, जमे हुए मैमेरी फैट पैड या एमएफपी को -80 डिग्री सेल्सियस से हटा दें और कमरे के तापमान पर गल जाएं।
2. एक बार गल, सूखी MFPs संक्षेप में एक नाजुक काम पर पोंछ । एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग कर MFPs वजन।
3. कैंची या स्केलपेल के साथ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, बरकरार ईसीएम के अध्ययन के लिए ऊतक को 3 मिमी x 3 मिमी x 3 मिमी नमूनों में विभाजित करें और हाइड्रोजेल उत्पादन के लिए शेष ऊतक।
   नोट: नमूनों की संख्या परीक्षण विधियों की संख्या पर निर्भर करती है, उदाहरण के लिए दो नमूनों का संग्रह नीचे वर्णित है: पैराफिन एम्बेडिंग (चरण 1.5) के लिए एक और क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम में ठंड के लिए एक, यदि वांछित हो (सामग्री की तालिका देखें और चरण 1.6)।
4. ऊतकों का वजन करें। यदि सेक्शनिंग के लिए पैराफिन में एम्बेडिंग करते हैं, तो 1.5 चरण जारी रखें। यदि खंड के लिए क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम में ठंड, 1.6 कदम जारी रखें।
5. एक रासायनिक हुड में, ऊतक को 10% तटस्थ बफर फॉर्मेलिन (एनबीएफ) (सामग्री की तालिकादेखें) में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए जलमग्न करें। पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 30% सुक्रोज में ऊतक जलमग्न करें।
   1. अब टिश्यू का वजन करें कि इस टुकड़े को हटा दिया गया है। 1.6 कदम जारी रखें।
6. एक रासायनिक हुड में, एमएफपी के टुकड़ों को एक लेबल वाले कैसेट में रखें जो क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम के साथ प्रीपेड होता है। ऊतक को कवर करने के लिए अधिक क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम जोड़ें।
   1. कैसेट को 2-मिथाइलबुटेन (सामग्री की तालिकादेखें) की एक बीकर में रखें जो तरल नाइट्रोजन के साथ पूर्व-ठंडा है। बीकर के पास नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त 2-मिथाइलबुटेन होना चाहिए लेकिन कैसेट को जलमग्न करने के लिए पर्याप्त नहीं होना चाहिए क्योंकि क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम को 2-मिथाइलबुटेन को नहीं छूना चाहिए। कैसेट को 2-मिथाइलबुटेन में तब तक बैठने दें जब तक क्रायोस्टेट एम्बेडिंग मीडियम जमा नहीं हो जाता और अपारदर्शी हो जाए।
   2. कैसेट (एस) को पन्नी, लेबल में लपेटें, और सेक्शनिंग के लिए उपयोग किए जाने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
      नोट: क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम में तुरंत रखे गए ऊतकों को 5 माइक्रोन पर खंडित किया गया था जबकि सुक्रोज में इनक्यूबेटेड ऊतकों को एडिपोसाइट आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए 30 माइक्रोन पर अनुभागित किया गया था।
7. शेष ऊतकों की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
   नोट: ऊतक के टुकड़ों को 24-48 घंटे के लिए 10% एनबीबीएफ में भी रखा जा सकता है, पीबीएस में धोया जाता है, और पैराफिन में एम्बेड होने तक 70% इथेनॉल में छोड़ दिया जाता है। एम्बेडिंग के बाद, हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन (एच एंड ई) धुंधला (नीचे अनुभाग 2 देखें) के लिए 5 माइक्रोन सेक्शन का उपयोग किया जा सकता है।
8. एमएफपी को 5 सेमी व्यंजनों में 5 एमएल 0.02% ट्राइपसिन/0.05% ईडीटीए समाधान के साथ रखें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। स्प्रे और इनक्यूबेटर में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ व्यंजन पोंछें।
9. तीन बार टिश्यू के ऊपर पानी डालकर एमएफपी को डियोनाइज्ड (डीआई) पानी से धोने के लिए 0.7 एमएम स्ट्रेन का इस्तेमाल करें। वॉश के बीच में ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
10. एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक। ऊतकों को एक पूर्व-ऑटोक्लेवेड बीकर में रखें जिसमें उचित आकार का हलचल बार होता है। 3% टी-ऑक्टाइलफेनोक्सीपॉलीथेथोक्सीथेथेनॉल के 60 एमएल के साथ ऊतकों को कवर करें (सामग्री की तालिकादेखें) प्रति 1 ग्राम ऊतक और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हलचल करें। कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें।
11. एक छलनी में ऊतक और सामग्री डंप। डीआई पानी के साथ बीकर कुल्ला और ऊतकों पर डालना। दो बार और दोहराएं। कुल्ला के बीच में ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
12. एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक। ऊतकों को रखें और सलाखों को एक ही बीकर्स में वापस हिलाएं, और 1 ग्राम ऊतक प्रति 4% डिऑक्सीकोलिक एसिड के 60 एमएल के साथ कवर करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हिलाओ । कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें।
13. एक जाल छलनी में ऊतक और सामग्री डंप। डीआई पानी के साथ बीकर कुल्ला और ऊतकों पर डालना। दो बार और दोहराएं। कुल्ला के बीच में ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
14. एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक।
15. 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ताजे डीआई पानी के साथ एक ही बीकर में ऊतकों को रखें। पैराफिन फिल्म के साथ कसकर कवर करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
16. अगले दिन उपयोग के लिए छन्नी और बीकर्स धोएं।
17. दूसरे दिन,एक छलनी में नाली बीकर सामग्री। एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक।
18. एक उचित आकार हलचल बार के साथ एक ही बीकर में सांसदों प्लेस । ऊतक के 1 ग्राम प्रति 60 मिलील 4% इथेनॉल/0.1% पेरासेटिक एसिड समाधान के साथ कवर करें। कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए हिलाओ ।
19. ऊतक और सामग्री को 0.7 मिमी छलनी में डंप करें। ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें। सामग्री को वापस बीकर में रखें। ऊतक के प्रति 1 ग्राम 1x पीबीएस के 60 एमएल के साथ कवर करके ऊतक धोएं। कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिलाओ । एक बार दोहराएं।
20. ऊतक और सामग्री को 0.7 मिमी छलनी में डंप करें। ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें। सामग्री को वापस बीकर में रखें। ऊतक के प्रति 1 ग्राम 60 एमएल डीआई पानी के साथ इसे कवर करके ऊतक धोएं। कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिलाओ । एक बार दोहराएं।
21. एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक। एक छलनी में ऊतक और सामग्री डंप। ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
22. सामग्री को वापस बीकर में रखें। ऊतकों के प्रति 1 ग्राम 100% एन-प्रोपनॉल के 60 एमएल के साथ ऊतकों को कवर करें। कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हिलाओ ।
23. एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक। ऊतक और सामग्री को 0.7 मिमी छलनी में डंप करें। ऊतक की मैन्युअल रूप से मालिश करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
24. सामग्री को वापस बीकर में रखें। ऊतक के प्रति 1 ग्राम डीआई पानी के 60 एमएल के साथ इसे कवर करके ऊतक धोएं। कम से कम 20 एमएल का प्रयोग करें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिलाओ । तीन बार दोहराएं।
25. एक छलनी में ऊतक और सामग्री डंप। सुक्रोज इनक्यूबेशन के लिए ऊतक के टुकड़े एकत्र करने और क्रायोस्टेट एम्बेडिंग माध्यम में ठंड के लिए चरण 2.3-2.6 दोहराएं।
26. एक नाजुक कार्य पोंछ और वजन पर संक्षेप में सूखी ऊतक। एक लेबल 15 एमएल ट्यूब में रखें। रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5