Overview
וידאו זה מתאר טכניקה של נגזרת הידרוג'ל מטריצה חוץ-תאית על ידי decellularizing רפידות שומן mammary מורין בעקבות הקרנת ex vivo למחקרים במבחנה. הידרוג'ל זה מסייע לחקות את סביבת רקמת השד in vivo לאחר הקרינה כדי ללמוד התנהגות תאים סרטניים.
Protocol
1. דקלולריזציה
שים לב: הליך זה הותאם משיטות שפורסמו בעבר התמקדו decellularization שומן, שכלל את חומר ניקוי יוני נתרן deoxycholate ולא נתרן דודקיל סולפט כדי להסיר DNA ביעילות.
- ביום הראשון, להסיר רפידות שומן Mammary קפוא או MFPs מ -80 מעלות צלזיוס ולהפשיר בטמפרטורת החדר.
- לאחר הפשרה, MFPs יבש לזמן קצר על ניגוב משימה עדין. שקלו את ה-MFPs באמצעות סולם אנליטי.
- באמצעות זוג מלקחיים עם מספריים או אזמל, לחלק את הרקמה עד 3 מ"מ x 3 מ"מ x 3 מ"מ דגימות למחקר של ECM שלם ואת הרקמה הנותרת לייצור הידרוג'ל.
שים לב: מספר הדגימות תלוי במספר שיטות הבדיקה, למשל איסוף שתי דגימות מתואר להלן: אחת להטמעת פרפין (שלב 1.5) ואחת להקפאה במדיום הטבעה קריוסטטי, אם תרצה (ראה טבלת החומרים ושלב 1.6). - שוקל את הרקמות. אם הטבעה בפרפין לצורך חתך, המשך לשלב 1.5. אם הקפאה במדיום הטבעה cryostat עבור חתך, להמשיך לשלב 1.6.
- במכסה המנוע הכימי, להטביע את הרקמה 10% ניטרלי אגירה פורמלין (NBF) (ראה את שולחן החומרים)עבור 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד. להטביע את הרקמה ב 30% סוכרוז עבור 48 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשקול את הרקמה עכשיו כי חתיכה זו הוסרה. המשך לשלב 1.6.
- במכסה המנוע הכימי, מניחים חתיכות MFP בקלטת מסומנת מוכנה עם מדיום הטבעה cryostat. הוסף עוד מדיום הטבעה cryostat כדי לכסות את הרקמה.
- מניחים את הקלטת לתוך של 2-מתילבוטאן (ראה שולחן החומרים)כי הוא מקורר מראש עם חנקן נוזלי. הכומתה צריכה להיות מספיק 2-מתילבוטאן כדי לכסות את החלק התחתון אבל לא מספיק כדי להטביע את הקלטת כי מדיום הטבעה cryostat לא צריך לגעת 2-מתילבוטאן. תן את הקלטת לשבת 2-מתילבוטן עד ההקפאה cryostat בינוני קופא והופך אטום.
- לעטוף את הקלטות בנייר כסף, תווית, ולהשאיר ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עבור חתך.
שים לב: רקמות שהונחו מיד במדיום הטבעה cryostat היו חתוכים ב 5 מיקרומטר בעוד רקמות דגירה סוכרוז היו חתוכים ב 30 מיקרומטר כדי לשמור על מורפולוגיה adipocyte.
- השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה הנותרת.
שים לב: חתיכות רקמה יכול גם להיות ממוקם 10% NBF עבור 24-48 שעות, שטף PBS, והשאיר 70% אתנול עד הטמעה פרפין. לאחר ההטבעה, ניתן להשתמש ב-5 מיקרומטרים עבור כתמי המטוקסילין ואאוסין (H & E) (ראה סעיף 2 להלן). - מניחים את ה-MFPs במנות 6 ס"מ עם 5 מ"ל 0.02% טריפסין/0.05% פתרון EDTA. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעות. לרסס ולנגב את הכלים עם 70% אתנול לפני הצבת באינקובטור.
- השתמש מסננים 0.7 מ"מ לשטוף את MFPs עם deionized (DI) מים על ידי שפיכת מים על הרקמה שלוש פעמים. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין שוטף.
- רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול. מניחים רקמות בכומתה טרום אוטוקלאב המכילה בר ערבוב בגודל מתאים. מכסים רקמות עם 60 מ"ל של 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (ראה את שולחן החומרים)לכל 1 גרם של רקמה ומערבבים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל.
- לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת. לשטוף את הכומתה עם מים DI ויוצקים על רקמות. חזור על הפעולה פעמיים נוספות. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין שטיפות.
- רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול. מניחים רקמות ומערבבים ברים בחזרה באותם כוסות, ומכסים עם 60 מ"ל של 4% חומצה deoxycholic לכל 1 גרם של רקמה. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל.
- לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת רשת. לשטוף את הכומתה עם מים DI ויוצקים על רקמות. חזור על הפעולה פעמיים נוספות. השתמש מלקחיים כדי לעסות באופן ידני את הרקמה בין שטיפות.
- רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול.
- מניחים רקמות באותו כיף עם מים DI טריים בתוספת 1% פניצילין סטרפטומיצין. מכסים בחוזקה עם סרט פרפין. להשאיר לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף מסננים ו beakers לשימוש למחרת.
- ביום 2, מסננים את תכולת הכף לתוך מסננת. רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול.
- מניחים MFPs באותה מזווה עם בר ערבוב בגודל מתאים. מכסים עם 60 מ"ל 4% אתנול/0.1% תמיסת חומצה peracetic לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
- לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. הנח את התוכן בחזרה לתוך הבוקוס. לשטוף רקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מ"ל של 1x PBS לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור פעם אחת.
- לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני. מחזירים את התוכן לתוך הכף. לשטוף רקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מ"ל DI מים לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור פעם אחת.
- רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול. לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת. השתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני.
- מחזירים את התוכן לתוך הכף. לכסות רקמות עם 60 מ"ל של 100% n-propanol לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך שעה בטמפרטורת החדר.
- רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול. לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת 0.7 מ"מ. השתמש מלקחיים כדי לעסות את הרקמה באופן ידני.
- מחזירים את התוכן לתוך הכף. לשטוף רקמה על ידי כיסוי זה עם 60 מ"ל של מים DI לכל 1 גרם של רקמה. יש להשתמש במינימום של 20 מ"ל. מערבבים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה שלוש פעמים.
- לזרוק רקמה ותכולה לתוך מסננת. חזור על שלבים 2.3-2.6 כדי לאסוף חתיכות של רקמה עבור דגירה סוכרוז והקפאה במדיום הטבעה cryostat.
- רקמה יבשה לזמן קצר על משימה עדינה לנגב ולשקול. מניחים בצינור שכותרתו 15 מ"ל. להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס לילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-5 |
