Almohadillas de grasa mammary descelularizantes: Derivando hidrogeles matrix extracelulares de almohadillas de grasa mammary

Overview

Este video describe una técnica de derivar hidrogeles de matriz extracelular mediante la descelularización de almohadillas de grasa mamaria murina después de la irradiación ex vivo para estudios in vitro. Este hidrogel ayuda a imitar el ambiente in vivo del tejido mamario después del tratamiento con radiación para estudiar el comportamiento de las células tumorales.

Protocol

1. Descelularización

NOTA: Este procedimiento fue adaptado a partir de métodos publicados previamente centrados en la descelularización adiposa, que incluía el detergente iónico desoxicolato de sodio en lugar de sulfato de dodecilo sódico para eliminar el ADN de manera eficiente.

1. El día 1,retire las almohadillas de grasa mammary congeladas o los MFP de -80 °C y descongele a temperatura ambiente.
2. Una vez descongelado, seque brevemente los MFP en una delicada toallita de tarea. Pesar los MFP utilizando una escala analítica.
3. Utilizando un par de fórceps con tijeras o un bisturí, divida el tejido en muestras de 3 mm x 3 mm x 3 mm para el estudio del ECM intacto y el tejido restante para la producción de hidrogel.
   NOTA: El número de muestras depende del número de métodos de ensayo, por ejemplo, la recolección de dos muestras se describe a continuación: una para la incrustación de parafina (paso 1.5) y otra para la congelación en el medio de incrustación criostato, si se desea (ver la Tabla de Materiales y el paso 1.6).
4. Pesar los tejidos. Si se incrusta en parafina para la sección, continúe con el paso 1.5. Si se congela en el medio de incrustación criostato para la sección, continúe con el paso 1.6.
5. En una campana química, sumerja el tejido en formalina tamponada (NBF) 10% neutro (ver tabla de materiales)durante 24 h a 4 °C. Lave 3 veces en PBS durante 5 minutos cada uno. Sumerja el tejido en 30% sacarosa durante 48 h a 4 °C.
   1. Pesar el tejido ahora que esta pieza ha sido removida. Continúe con el paso 1.6.
6. En una capucha química, coloque las piezas de la impresora multifunción en un cassette etiquetado preparado con medio de incrustación criostato. Agregue más medio de incrustación criostato para cubrir el tejido.
   1. Coloque el cassette en un vaso de precipitados de 2-metilbutano (ver la Tabla de Materiales)que esté preenfriado con nitrógeno líquido. El vaso debe tener suficiente 2-metilbutano para cubrir la parte inferior, pero no lo suficiente para sumergir el cassette porque el medio de incrustación criostato no debe tocar el 2-metilbutano. Deje que el casete se siente en el 2-metilbutane hasta que el medio de incrustación criostato se congele y se vuelva opaco.
   2. Envuelva los casetes en papel de aluminio, etiqueta y deje a -80 °C hasta que se utilicen para la sección.
      NOTA: Los tejidos colocados inmediatamente en el medio de incrustación criostato se seccionaron a 5 μm, mientras que los tejidos incubados en sacarosa fueron seccionados a 30 μm para retener la morfología de los adipocitos.
7. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido restante.
   NOTA: Las piezas de tejido también se pueden colocar en un 10% de NBF durante 24-48 h, enjuagadas en PBS, y se dejan en un 70% de etanol hasta que se incrustan en parafina. Después de la incrustación, se pueden utilizar 5 secciones de μm para la tinción de hematoxilina y eosina (H y E) (ver sección 2 a continuación).
8. Coloque los MFP en platos de 6 cm con solución EDTA de 5 ml 0,02% trypsin/0,05%. Incubar a 37 °C durante 1 h. Rocíe y limpie los platos con un 70% de etanol antes de colocarlo en la incubadora.
9. Utilice coladores de 0,7 mm para lavar los MFP con agua desionizada (DI) vertiendo agua sobre el tejido tres veces. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre lavados.
10. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar. Coloque los tejidos en un vaso de precipitados preautorizado que contenga una barra de agitación de tamaño adecuado. Cubra los tejidos con 60 ml de 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (ver la Tabla de Materiales)por 1 g de tejido y revuelva durante 1 h a temperatura ambiente. Utilice un mínimo de 20 ml.
11. Volcar tejido y contenido en un colador. Enjuague el vaso de precipitados con agua di y vierta sobre los tejidos. Repita dos veces más. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues.
12. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar. Coloque los tejidos y revuelva las barras de nuevo en los mismos beakers, y cubra con 60 ml de ácido desoxicólico 4% por 1 g de tejido. Revuelva durante 1 h a temperatura ambiente. Utilice un mínimo de 20 ml.
13. Volcar tejido y contenido en un colador de malla. Enjuague el vaso de precipitados con agua di y vierta sobre los tejidos. Repita dos veces más. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido entre enjuagues.
14. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar.
15. Coloque los tejidos en el mismo vaso con agua fresca de DI complementada con 1% penicilina-estreptomicina. Cubra bien con película de parafina. Dejar pasar la noche a 4 °C.
16. Lave coladores y beakers para su uso al día siguiente.
17. El día 2,escurra el contenido del vaso en un colador. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar.
18. Coloque los MFP en el mismo vaso de precipitados con una barra de agitación de tamaño adecuado. Cubrir con 60 ml 4% etanol/ 0.1% solución de ácido peracético por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 2 h a temperatura ambiente.
19. Volcar tejido y contenido en un colador de 0,7 mm. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en el vaso de precipitados. Lave el tejido cubriéndolo con 60 ml de 1 PBS por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 15 minutos a temperatura ambiente. Repita una vez.
20. Volcar tejido y contenido en un colador de 0,7 mm. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido. Vuelva a colocar el contenido en vaso de precipitados. Lave el tejido cubriéndolo con agua di de 60 ml por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 15 minutos a temperatura ambiente. Repita una vez.
21. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar. Volcar tejido y contenido en un colador. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido.
22. Vuelva a colocar el contenido en vaso de precipitados. Cubra los tejidos con 60 ml de 100% n-propanol por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 1 h a temperatura ambiente.
23. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar. Volcar tejido y contenido en un colador de 0,7 mm. Utilice fórceps para masajear manualmente el tejido.
24. Vuelva a colocar el contenido en vaso de precipitados. Lave el tejido cubriéndolo con 60 ml de agua di por 1 g de tejido. Utilice un mínimo de 20 ml. Revuelva durante 15 minutos a temperatura ambiente. Repita tres veces.
25. Volcar tejido y contenido en un colador. Repita los pasos 2.3–2.6 para recoger trozos de tejido para la incubación de sacarosa y la congelación en el medio de incrustación criostato.
26. Seque brevemente el tejido en una delicada toallita de tarea y pesar. Colocar en un tubo etiquetado de 15 ml. Congele a -80 °C durante la noche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5