Almofadas de gordura mamárias descelularizantes: Derivando hidrogéis de matriz extracelular de almofadas de gordura mamária

Overview

Este vídeo descreve uma técnica de derivar hidrogéis de matriz extracelularização descelularizando almofadas de gordura mamária murina após irradiação ex vivo para estudos in vitro. Este hidrogel ajuda a imitar o ambiente de tecido mamário in vivo pós-radiação para estudar o comportamento das células tumorais.

Protocol

1. Descelularização

NOTA: Este procedimento foi adaptado de métodos publicados anteriormente focados na descelularização adiposa, que incluía o detergente iônico de desoxilato de sódio em vez de sulfato de dodecil de sódio para remover o DNA de forma eficiente.

1. No dia 1, remova as almofadas de gordura mamária congelada ou MFPs a partir de -80 °C e descongele à temperatura ambiente.
2. Uma vez descongelado, seco MFPs brevemente em uma delicada limpeza de tarefas. Pesar os MFPs usando uma escala analítica.
3. Utilizando um par de fórceps com tesoura ou um bisturi, divida o tecido em amostras de 3 mm x 3 mm x 3 mm para estudo do ECM intacto e do tecido restante para produção de hidrogel.
   NOTA: O número de amostras depende do número de métodos de teste, por exemplo, a coleta de duas amostras é descrita abaixo: uma para incorporação de parafina (etapa 1,5) e outra para congelamento em criostat, se desejar (ver a Tabela de Materiais e a etapa 1.6).
4. Pesar os tecidos. Se incorporar em parafina para secção, continue a etapa 1.5. Se congelar no criostat incorporando meio para secção, continue a etapa 1.6.
5. Em uma capa química, submergir o tecido em formalina tamponada 10% neutra (NBF) (ver a Tabela de Materiais) por 24 h a 4 °C. Lave 3 vezes em PBS por 5 min cada. Submerse o tecido em 30% de sacarose por 48 h a 4 °C.
   1. Pesar o tecido agora que esta peça foi removida. Continue a passo 1.6.
6. Em uma capa química, coloque peças MFP em um rotulado preparado com meio de incorporação criostat. Adicione mais criostatina incorporando meio para cobrir o tecido.
   1. Coloque o em um béquer de 2-metilbutano (ver a Tabela de Materiais) que é pré-resfriado com nitrogênio líquido. O béquer deve ter 2-metilbutano suficiente para cobrir a parte inferior, mas não o suficiente para submergir o porque o meio de incorporação criostat não deve tocar o 2-metilbutano. Deixe o sentar-se no 2-metilbutano até que o criostate incorporando meio congela e se torne opaco.
   2. Enrole o em papel alumínio, etiqueta e deixe a -80 °C até que seja usado para secção.
      NOTA: Os tecidos colocados imediatamente no meio de incorporação de criostat foram seccionados a 5 μm, enquanto os tecidos incubados em sacarose foram seccionados a 30 μm para reter a morfologia adipócito.
7. Use fórceps para massagear manualmente o tecido restante.
   NOTA: As peças teciduais também podem ser colocadas em 10% de NBF por 24-48 h, enxaguadas em PBS, e deixadas em 70% de etanol até incorporar em parafina. Após a incorporação, as seções de 5 μm podem ser usadas para coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (ver seção 2 abaixo).
8. Coloque os MFPs em pratos de 6 cm com 5 mL 0,02% de trypsin/0,05% solução EDTA. Incubar a 37 °C por 1 h. Borrife e limpe os pratos com 70% de etanol antes de colocar na incubadora.
9. Use coador de 0,7 mm para lavar os MFPs com água desionizada (DI) derramando água sobre o tecido três vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as lavagens.
10. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese. Coloque tecidos em um béquer pré-autoclaved contendo uma barra de agitação de tamanho apropriado. Cubra tecidos com 60 mL de 3% t-octylphenoxypolyoxyetanol (ver a Tabela de Materiais) por 1 g de tecido e mexa por 1h à temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
11. Despeje tecido e conteúdo em um coador. Enxágüe o béquer com água DI e despeje nos tecidos. Repita mais duas vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues.
12. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese. Coloque tecidos e mexa barras nos mesmos béquers, e cubra com 60 mL de ácido desoxicólico de 4% por 1 g de tecido. Mexa por 1h em temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
13. Despeje tecido e conteúdo em um coador de malha. Enxágüe o béquer com água DI e despeje nos tecidos. Repita mais duas vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as enxágues.
14. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese.
15. Coloque tecidos no mesmo béquer com água DI fresca suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina. Cubra bem com o filme de parafina. Deixe durante a noite a 4 °C.
16. Lave filtros e béquers para uso no dia seguinte.
17. No dia 2,drene o conteúdo do béquer em um coador. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese.
18. Coloque MFPs no mesmo béquer com uma barra de agitação de tamanho apropriado. Cubra com 60 mL 4% de etanol/0,1% solução de ácido peracético por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 2h em temperatura ambiente.
19. Despeje tecido e conteúdo em um coador de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de 1x PBS por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 minutos em temperatura ambiente. Repita uma vez.
20. Despeje tecido e conteúdo em um coador de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de água DI por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 minutos em temperatura ambiente. Repita uma vez.
21. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese. Despeje tecido e conteúdo em um coador. Use fórceps para massagear manualmente o tecido.
22. Coloque o conteúdo de volta no béquer. Cubra tecidos com 60 mL de 100% n-propanol por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 1h em temperatura ambiente.
23. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese. Despeje tecido e conteúdo em um coador de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido.
24. Coloque o conteúdo de volta no béquer. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de água DI por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 minutos em temperatura ambiente. Repita três vezes.
25. Despeje tecido e conteúdo em um coador. Repita as etapas 2.3-2.6 para coletar pedaços de tecido para incubação de sacarose e congelamento no meio de incorporação de criostat.
26. Escar firme brevemente um tecido delicado em uma tarefa delicada limpe e pese. Coloque em um tubo de 15 mL rotulado. Congele a -80 °C durante a noite.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5