Hücre DışıLaştırıcı Meme Yağ Pedleri: Meme Yağı Pedlerinden Hücre Dışı Matris Hidrojelleri Türetme

Overview

Bu video, in vitro çalışmalar için ex vivo ışınlamayı takiben murine meme yağ pedlerini hücre dışı haleleştirerek hücre dışı matris hidrojelleri türetmenin bir tekniğini açıklamaktadır. Bu hidrojel, tümör hücresi davranışını incelemek için radyasyon sonrası in vivo meme dokusu ortamını taklit etmeye yardımcı olur.

Protocol

1. Hücreden Arındırma

NOT: Bu prosedür, DNA'yı verimli bir şekilde çıkarmak için sodyum dodecyl sülfat yerine sodyum deoksikolat iyonik deterjanı içeren yağ desellülerizasyonuna odaklanan daha önce yayınlanan yöntemlerden uyarlanmıştır.

1. 1. günde,donmuş Meme Yağı pedlerini veya MFP'leri -80 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığında çözün.
2. Çözdükten sonra, MFP'leri hassas bir görev silme işleminde kısa bir süre kurulayın. MFP'leri analitik bir ölçek kullanarak tartın.
3. Makaslı veya neşterli bir çift forseps kullanarak, sağlam ECM'nin ve hidrojel üretimi için kalan dokunun incelenmesi için dokuyu 3 mm x 3 mm x 3 mm numunelere bölün.
   NOT: Numune sayısı test yöntemlerinin sayısına bağlıdır, örneğin iki numunenin toplanması aşağıda açıklanmıştır: biri parafin gömme için (adım 1.5) ve biri istenirse kriyostat gömme ortamında dondurmak için (bkz. Malzeme Tablosu ve adım 1.6).
4. Dokuları tartın. Bölümleme için parafin katıştırıyorsanız, 1.5. Kriyostat gömme ortamında donma varsa, 1.6 adımına devam edin.
5. Kimyasal bir başlıkta, dokuyu% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içine batırın (Malzeme Tablosunabakın) 4 ° C'de 24 saat boyunca. PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Dokuyu 4 °C'de 48 saat boyunca% 30 sakkaroza batırın.
   1. Bu parça çıkarıldığına göre dokuyu tartın. 1.6. adıma devam edin.
6. Kimyasal bir kaputun içine, MFP parçalarını kriyostat gömme ortamı ile önceden yerleştirilmiş etiketli bir kasete yerleştirin. Dokuyu örtmek için daha fazla kriyostat gömme ortamı ekleyin.
   1. Kaseti, sıvı nitrojenle önceden soğutulmuş 2 metilbütanlı bir kabın içine yerleştirin (Malzeme Masasınabakın). Beher, tabanı örtmek için yeterli 2 metilbütanlı olmalıdır, ancak kaseti batırmak için yeterli olmamalıdır, çünkü kriyostat gömme ortamı 2-metilbütan'a dokunmamalıdır. Kaset, kriyostat gömme ortamı donana ve opak hale gelene kadar 2 metilbütan içinde otursun.
   2. Kasetleri folyoya, etikete sarın ve bölümleme için kullanılana kadar -80 °C'de bırakın.
      NOT: Kriyostat gömme ortamına hemen yerleştirilen dokular 5 μm'de, sakkarozda inkübe edilen dokular ise adiposit morfolojisini korumak için 30 μm'de bölümlenmiştir.
7. Kalan dokuya manuel masaj yapmak için tokmak kullanın.
   NOT: Doku parçaları ayrıca 24-48 saat boyunca% 10 NBF'ye yerlenebilir, PBS'de durulanabilir ve parafin içine karışana kadar% 70 etanolde bırakılabilir. Gömmeden sonra, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama için 5 μm bölüm kullanılabilir (aşağıdaki bölüm 2'ye bakın).
8. MFP'leri 5 mL% 0.02 trypsin / % 0.05 EDTA çözeltisi ile 6 cm'lik yemeklere yerleştirin. 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. İnkübatöre yerleştirmeden önce bulaşıkları% 70 etanol ile püskürtün ve silin.
9. MFP'leri dokuyu üç kez su dökerek deiyonize (DI) suyla yıkamak için 0,7 mm süzgeç kullanın. Yıkamalar arasında dokuya manuel olarak masaj yapmak için tokalar kullanın.
10. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın. Dokuları uygun büyüklükte bir karıştırma çubuğu içeren önceden otoklavlanmış bir kabın içine yerleştirin. Dokuları 1 g doku başına 60 mL%3 -octylphenoxypolyethoxyethanol (Malzeme Tablosunabakın) ile örtün ve oda sıcaklığında 1 saat karıştırın. En az 20 mL kullanın.
11. Mendili ve içindekileri bir süzgeçe dök. Kabı DI suyu ile durulayın ve dokulara dökün. İki kez daha tekrarla. Durulamalar arasındaki dokuya manuel olarak masaj yapmak için tokmak kullanın.
12. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın. Dokuları yerleştirin ve çubukları aynı gagalara geri karıştırın ve 1 g doku başına% 4 deoksikolik asitin 60 mL'si ile örtün. Oda sıcaklığında 1 saat karıştırın. En az 20 mL kullanın.
13. Doku ve içindekileri bir ağ süzgecine dök. Kabı DI suyu ile durulayın ve dokulara dökün. İki kez daha tekrarla. Durulamalar arasındaki dokuya manuel olarak masaj yapmak için tokmak kullanın.
14. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın.
15. Dokuları% 1 penisilin-streptomisi ile desteklenmiş taze DI suyu ile aynı behere yerleştirin. Parafin filmi ile sıkıca örtün. Geceyi 4 °C'de bırakın.
16. Ertesi gün kullanmak için süzgeçleri ve beherleri yıkayın.
17. 2. günde,beher içeriğini bir süzgeçe boşaltın. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın.
18. MFP'leri uygun boyutta bir karıştırma çubuğu ile aynı behere yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL% 4 etanol / 0.1% perasetik asit çözeltisi ile örtün. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.
19. Doku ve içeriği 0,7 mm süzgeçe dökin. Dokuya manuel masaj yapmak için tokmak kullanın. İçindekileri tekrar kabın içine yerleştirin. Dokuyu 1 g doku başına 60 mL 1x PBS ile kaplayarak yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez tekrarlayın.
20. Doku ve içeriği 0,7 mm süzgeçe dökin. Dokuya manuel masaj yapmak için tokmak kullanın. İçeriği tekrar behere yerleştirin. Dokuyu 1 g doku başına 60 mL DI su ile kaplayarak yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez tekrarlayın.
21. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın. Mendili ve içindekileri bir süzgeçe dök. Dokuya manuel masaj yapmak için tokmak kullanın.
22. İçeriği tekrar behere yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL%100 n-propanol ile dokuları örtün. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 1 saat karıştırın.
23. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın. Doku ve içeriği 0,7 mm süzgeçe dökin. Dokuya manuel masaj yapmak için tokmak kullanın.
24. İçeriği tekrar behere yerleştirin. Dokuyu 1 g doku başına 60 mL DI su ile kaplayarak yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Üç kez tekrarlayın.
25. Mendili ve içindekileri bir süzgeçe dök. Kriyostat gömme ortamında sakkaroz inkübasyonu ve donması için doku parçalarını toplamak için 2.3-2.6 adımlarını tekrarlayın.
26. Hassas bir görev üzerindeki dokuyu kısaca kurulayın silin ve tartın. Etiketli 15 mL tüpe yerleştirin. Gece boyunca -80 °C'de dondurun.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5