脱細胞化乳脂肪パッド:乳腺脂肪パッドから細胞外マトリックスヒドロゲルを導出する

Overview

このビデオでは、インビトロ研究のためのex vivo照射に続いて、マウスママリ脂肪パッドを脱細胞化することによって細胞外マトリックスヒドロゲルを導出する技術について説明します。このヒドロゲルは、腫瘍細胞の挙動を研究するために放射線治療後の生体内乳房組織環境を模倣するのに役立ちます。

Protocol

1. 脱細胞化

注: この手順は、DNAを効率的に除去するためにドデシル硫酸ナトリウムではなくデオキシコール酸イオン性洗剤を含む脂肪脱細胞化に焦点を当てた以前に発表された方法から適応された。

1. 1日目には、凍結した乳脂肪パッドまたはMMPを-80°Cから取り出し、室温で解凍します。
2. 解凍したら、繊細なタスクワイプでMMPを短時間乾燥させます。分析スケールを使用して MFP の重量を量る。
3. はさみまたはメスで鉗子のペアを使用して、インタクトECMとヒドロゲルの生産のための残りの組織の研究のために3ミリメートルx 3 mm x 3 mmのサンプルに組織を分割します。
   注: サンプル数は、例えば2つのサンプルの収集が以下に記載されている試験方法の数に依存する:パラフィン埋め込み用(ステップ1.5)とクライオスタット埋め込み媒体で凍結するための1つ(必要に応じて、材料表およびステップ1.6を参照)。
4. 組織の重量を量る。断面化のためにパラフィンに埋め込む場合は、ステップ 1.5 に進みます。切除用の凍結スタット埋め込み培地で凍結する場合は、ステップ1.6に進みます。
5. 化学フードで、4°Cで24時間、10%中性緩衝ホルマリン(NBF)(材料表を参照)に組織を沈下します。 PBSで3回、それぞれ5分間洗います。4°Cで48時間30%スクロースに組織を沈下する。
   1. この部分が取り除かれたので、組織の重量を量ります。ステップ 1.6 に進みます。
6. 化学フードに、クライオスタット埋め込み培地を準備したラベル付きカセットにMFPピースを入れる。組織を覆うために、より多くの凍結スタット埋め込み培地を追加します。
   1. カセットを液体窒素であらかじめ冷却した2-メチルブタン(材料表参照)のビーカーに入れてください。ビーカーは底部を覆うのに十分な2-メチルブタンを持っている必要がありますが、クライオスタット埋め込み培地は2-メチルブタンに触れてはならないので、カセットを沈めるのに十分ではありません。キオスタット埋め込み培地が凍結して不透明になるまで、カセットを2-メチルブタンに座らせます。
   2. カセットをホイルで包み、ラベルを貼り、切断に使用するまで-80°Cにしておきます。
      注: 凍結スタット埋め込み培地に直ちに入れられた組織は5μmで切除され、スクロースでインキュベートされた組織は30μmで切除され、有分細胞形態を保持した。
7. 鉗子を使用して残りの組織を手動でマッサージします。
   注: 組織片は、24〜48時間10%NBFに入れ、PBSですすいだし、パラフィンに埋め込まれるまで70%エタノールに残してもよい。埋め込み後、5μmのセクションをヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色に使用することができます(下記のセクション2を参照)。
8. 5 mL 0.02%トリプシン/0.05%EDTA溶液を使用して、6 cmの皿にMMPを入れ。37°Cで1時間インキュベートする。インキュベーターに入れる前に、70%エタノールで皿をスプレーして拭きます。
9. 0.7 mmのストレーナーを使用して、組織の上に水を3回注ぐことによって脱イオン(DI)水でMMPを洗浄します。鉗子を使用して、手動で、その間に組織をマッサージします。
10. 繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。適切なサイズの攪拌棒を含むオートクレーブビーカーに組織を入れる。組織1gあたり3%t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(材料表参照)の60 mLの組織を覆い、室温で1時間攪拌する。20 mL以上を使用してください。
11. ストレーナーに組織と内容物をダンプします。DI水でビーカーをすすいで、ティッシュに注ぎます。さらに 2 回繰り返します。鉗子を使用して、リンスの間の組織を手動でマッサージします。
12. 繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。組織を置き、同じビーカーに戻ってバーをかき混ぜ、組織の1gあたり4%デオキシコール酸の60 mLで覆います。室温で1時間かき混ぜます。20 mL以上を使用してください。
13. ティッシュと内容物をメッシュストレーナーにダンプします。DI水でビーカーをすすいで、ティッシュに注ぎます。さらに 2 回繰り返します。鉗子を使用して、リンスの間の組織を手動でマッサージします。
14. 繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。
15. 1%ペニシリンストレプトマイシンを補充新鮮なDI水と同じビーカーに組織を入れます。パラフィンフィルムでしっかりと覆います。4°Cで一晩放置します。
16. 翌日使用するためにストレーナーとビーカーを洗います。
17. 2日目にビーカーの内容物をストレーナーに排出します。繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。
18. 適切なサイズのスターバーを持つ同じビーカーにMMPを入れる。60 mL 4% エタノール/0.1% 過酢酸溶液を組織 1 g あたりカバーします。20 mL以上を使用してください。室温で2時間かき混ぜます。
19. 0.7 mm ストレーナーにティッシュおよび内容物をダンプする。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。ビーカーに内容を戻します。組織の1gあたり1x PBSの60 mLでそれを覆うことによってティッシュを洗う。20 mL以上を使用してください。室温で15分間かき混ぜます。1 回繰り返します。
20. 0.7 mm ストレーナーにティッシュおよび内容物をダンプする。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。内容をビーカーに戻します。ティッシュの1g当たり60 mL DI水でそれを覆うことによってティッシュを洗う。20 mL以上を使用してください。室温で15分間かき混ぜます。1 回繰り返します。
21. 繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。ストレーナーに組織と内容物をダンプします。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。
22. 内容をビーカーに戻します。組織の1gあたり100%n-プロパノールの60 mLで組織を覆う。20 mL以上を使用してください。室温で1時間かき混ぜます。
23. 繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。0.7 mm ストレーナーにティッシュおよび内容物をダンプする。手動で組織をマッサージするために鉗子を使用してください。
24. 内容をビーカーに戻します。組織の1gあたり60mLのDI水で覆うことでティッシュを洗います。20 mL以上を使用してください。室温で15分間かき混ぜます。3 回繰り返します。
25. ストレーナーに組織と内容物をダンプします。ステップ 2.3 ~ 2.6 を繰り返して、スクロースインキュベーション用の組織片を収集し、凍結スタット埋め込み培地で凍結します。
26. 繊細なタスクワイプと重量の上にティッシュを簡単に乾燥させます。15 mLのラベル付きチューブに入れる。一晩で-80°Cで凍結します。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5