Avcellulariserande fettkuddar från mammary: Härleda extracellulära matrishydrogeler från mammary fettkuddar

Overview

Denna video beskriver en teknik för att härleda extracellulära matris hydrogeler genom att avcellularisera murin mammary fettkuddar efter ex vivo bestrålning för in vitro studier. Denna hydrogel hjälper till att efterlikna in vivo bröstvävnad miljö efter strålning behandling för att studera tumör cell beteende.

Protocol

1. Avcellulering

OBS: Detta förfarande anpassades från tidigare publicerade metoder fokuserade på fettdecellularisering, som inkluderade natrium deoxycholate joniska tvättmedel snarare än natrium dodecyl sulfat att ta bort DNA effektivt.

1. På dag 1, ta bort frysta Mammary Fettkuddar eller MFPs från -80 °C och tina vid rumstemperatur.
2. När de tinat, torka MFPs kort på en delikat uppgiftsservett. Väg MFP:erna med hjälp av en analytisk skala.
3. Använd ett par tångar med sax eller skalpell och dela upp vävnaden i 3 mm x 3 mm x 3 mm prover för studier av den intakta ECM och den återstående vävnaden för hydrogelproduktion.
   OBS: Antalet prover beror på antalet testmetoder, t.ex.
4. Väg vävnaderna. Om du bäddar in i paraffin för sektionering fortsätter du till steg 1,5. Om du fryser i cryostat-inbäddningsmedium för sektionering fortsätter du till steg 1.6.
5. I en kemisk huva, dränk vävnaden i 10% neutral buffrad formalin (NBF) (se materialförteckningen)i 24 timmar vid 4 °C. Tvätta 3 gånger i PBS i 5 minuter vardera. Sänk ner vävnaden i 30% sackaros i 48 timmar vid 4 °C.
   1. Väg vävnaden nu när den här biten har tagits bort. Fortsätt till steg 1.6.
6. Placera MFP-bitar i en märkt kassett i en kemisk huva som är förberedd med kryostatinbäddningsmedium. Tillsätt mer kryostatinbäddningsmedium för att täcka vävnaden.
   1. Placera kassetten i en bägare med 2-metylbutan (se materialtabellen)som är förkyld med flytande kväve. Bägaren bör ha tillräckligt med 2-metylbutan för att täcka botten men inte tillräckligt för att dränka kassetten eftersom kryostatinbäddningsmediet inte ska röra 2-metylbutan. Låt kassetten sitta i 2-metylbutan tills kryostatinbäddningsmediet fryser och blir ogenomskinligt.
   2. Linda kassetterna i folie, etikett och låt den vara på -80 °C tills den används för sektionering.
      OBS: Vävnader placerade omedelbart i cryostat inbäddning medium var sektionerade vid 5 μm medan vävnader inkuberade i sackaros var sektionerade vid 30 μm för att behålla adipocyte morfologi.
7. Använd tång för att manuellt massera den återstående vävnaden.
   OBS: Vävnadsbitar kan också placeras i 10% NBF i 24-48 h, sköljas i PBS och lämnas i 70% etanol tills de bäddas in i paraffin. Efter inbäddning kan 5 μm sektioner användas för hematoxylin- och eosinfärgning (H & E) (se avsnitt 2 nedan).
8. Placera MFPs i 6 cm rätter med 5 ml 0,02% trypsin/0,05% EDTA-lösning. Inkubera vid 37 °C i 1 timme. Spraya och torka disken med 70% etanol innan du lägger i inkubatorn.
9. Använd 0,7 mm silar för att tvätta MFP:erna med avjoniserat (DI) vatten genom att hälla vatten över vävnaden tre gånger. Använd tång för att manuellt massera in vävnaden mellan tvättarna.
10. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Placera vävnader i en för autoklaverad bägare som innehåller en omrörningsstång i lämplig storlek. Täck vävnader med 60 ml 3% t-oktylfenoxipolyetoxietanol (se materialförteckningen)per 1 g vävnad och rör om i 1 timme vid rumstemperatur. Använd minst 20 ml.
11. Dumpa vävnad och innehåll i en sil. Skölj bägaren med DI-vatten och häll på vävnader. Upprepa två gånger till. Använd tång för att manuellt massera in vävnaden mellan sköljningar.
12. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Placera vävnader och omrör galler i samma bägare och täck med 60 ml 4% deoxykolsyra per 1 g vävnad. Rör om i 1 timme vid rumstemperatur. Använd minst 20 ml.
13. Dumpa vävnad och innehåll i en nätsil. Skölj bägaren med DI-vatten och häll på vävnader. Upprepa två gånger till. Använd tång för att manuellt massera in vävnaden mellan sköljningar.
14. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga.
15. Placera vävnader i samma bägare med färskt DI-vatten kompletterat med 1% penicillin-streptomycin. Täck tätt med paraffinfilm. Lämna över natten vid 4 °C.
16. Tvätta silar och bägare för användning följande dag.
17. På dag 2,dränera bägare innehåll i en sil. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga.
18. Placera MFP:er i samma bägare med en omrörningsstång i lämplig storlek. Täck med 60 ml 4% etanol/0,1% peracetsyralösning per 1 g vävnad. Använd minst 20 ml. Rör om i 2 timmar vid rumstemperatur.
19. Dumpa vävnad och innehåll i en 0,7 mm sil. Använd tång för att manuellt massera vävnaden. Placera tillbaka innehållet i bägaren. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 ml 1x PBS per 1 g vävnad. Använd minst 20 ml. Rör om i 15 min vid rumstemperatur. Upprepa en gång.
20. Dumpa vävnad och innehåll i en 0,7 mm sil. Använd tång för att manuellt massera vävnaden. Placera tillbaka innehållet i bägare. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 ml DI-vatten per 1 g vävnad. Använd minst 20 ml. Rör om i 15 min vid rumstemperatur. Upprepa en gång.
21. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Dumpa vävnad och innehåll i en sil. Använd tång för att manuellt massera vävnaden.
22. Placera tillbaka innehållet i bägare. Täck vävnader med 60 ml 100% n-propanol per 1 g vävnad. Använd minst 20 ml. Rör om i 1 timme vid rumstemperatur.
23. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Dumpa vävnad och innehåll i en 0,7 mm sil. Använd tång för att manuellt massera vävnaden.
24. Placera tillbaka innehållet i bägare. Tvätta vävnaden genom att täcka den med 60 ml DI-vatten per 1 g vävnad. Använd minst 20 ml. Rör om i 15 min vid rumstemperatur. Upprepa tre gånger.
25. Dumpa vävnad och innehåll i en sil. Upprepa steg 2.3–2.6 för att samla in vävnadsbitar för sackarosinkubation och frysning i kryostatinbäddningsmedium.
26. Kort torr vävnad på en delikat uppgift torka och väga. Placera i ett märkt 15 ml-rör. Frys vid -80 °C över natten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5