去细胞化乳腺脂肪垫：从乳腺脂肪垫中去除细胞外矩阵水凝胶

Overview

此视频描述了一种技术，通过去细胞外乳腺脂肪垫去细胞外基质水凝胶，在体外研究前体内照射后去细胞外乳腺脂肪垫。这种水凝胶有助于模拟放射治疗后体内乳房组织环境，研究肿瘤细胞行为。

Protocol

1. 去细胞化

注： 这个程序是根据先前公布的方法改编的，这些方法侧重于脂肪去细胞化，其中包括脱氧甲酸钠离子洗涤剂，而不是硫酸钠，以有效地去除DNA。

1. 在第1天，从-80°C中取出冷冻的乳腺脂肪垫或MFP，并在室温下解冻。
2. 解冻后，干燥的 MFP 将短暂地完成一项微妙的任务。使用分析量表称重最惠国待遇。
3. 使用一对带剪刀或手术刀的钳子，将组织分成 3 mm x 3 mm x 3 mm 样本，用于研究完整的 ECM 和用于水凝胶生产的剩余组织。
   注： 样品数量取决于测试方法的数量，例如，下面描述了两个样品的收集：一个用于石蜡嵌入（第 1.5 步），另一个用于冷冻状态器嵌入介质（如有必要，请参阅材料表和第 1.6 步）。
4. 称重组织。如果嵌入石蜡进行分割，请继续步骤 1.5。如果冻结在冷冻状态嵌入介质进行分割，请继续步骤 1.6。
5. 在化学罩中，将组织浸入 10% 中性缓冲形式素 （NBF） （参见材料表） 中，在 4 °C 下 24 小时。 在PBS中洗3次，每次5分钟。在 4 °C 下将组织浸入 30% 蔗糖中 48 小时。
   1. 称重组织，现在这块已被移除。继续步骤1.6。
6. 在化学罩中，将 MFP 件放在带有冷冻状态嵌入介质的标记盒式磁带中。添加更多低温器嵌入介质以覆盖组织。
   1. 将盒式磁带放入用液氮预冷却的2甲基丁烷（见材料表）的烧嘴中。烧嘴应该有足够的2甲基丁烷覆盖底部，但不足以淹没盒式磁带，因为冷冻器嵌入介质不应该触及2甲基丁烷。让盒式磁带坐在2甲基丁烷中，直到低温器嵌入中等冻结，变得不透明。
   2. 将盒式磁带包裹在铝箔、标签中，并在-80°C下离开，直到用于分割。
      注： 立即放入冷冻状态嵌入介质中的组织被分割为 5 μm，而在蔗糖中孵育的组织在 30 μm 处被分割，以保留脂肪细胞形态。
7. 使用钳子手动按摩剩余的组织。
   注： 组织件也可以放置在10%NBF 24-48小时，冲洗在PBS，并留在70%乙醇，直到嵌入石蜡。嵌入后，5 μm 部分可用于血氧林和 eosin （H & E） 染色（见下文第 2 节）。
8. 将 MFP 放在 6 厘米的菜肴中，配有 5 mL 0.02% 的 trypsin/0.05% EDTA 解决方案。在37°C孵育1小时。在放入孵化器之前，先用70%的乙醇喷洒和擦拭盘子。
9. 使用 0.7 毫米滤网通过将水倒在组织上三次，用除离子 （DI） 水清洗 MPS。使用钳子手动按摩洗涤之间的组织。
10. 在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。将纸巾放在含有适当大小的搅拌棒的自动切割烧瓶中。每1克组织用60毫升的3%t-八氯氧乙氧乙醇（见材料表）覆盖组织，在室温下搅拌1小时。使用至少20毫升。
11. 将组织和内容倾倒到过滤器中。用 DI 水冲洗烧嘴并倒入组织。再重复两次。使用钳子手动按摩冲洗之间的组织。
12. 在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。将组织和搅拌棒放回同一个烧嘴中，每 1 克组织覆盖 60 mL 的 4% 脱氧胆酸。在室温下搅拌1小时。使用至少20毫升。
13. 将组织和内容倾倒到网状过滤器中。用 DI 水冲洗烧嘴并倒入组织。再重复两次。使用钳子手动按摩冲洗之间的组织。
14. 在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。
15. 将组织放在同一个烧嘴中，并补充1%的青霉素-链霉素。用石蜡薄膜紧紧盖住。在4°C过夜。
16. 清洗过滤器和烧嘴，供第二天使用。
17. 第2天，将烧嘴内装物排入过滤器中。在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。
18. 将 MFP 放在同一个烧嘴中，并配有适当大小的搅拌棒。覆盖60 mL 4%乙醇/0.1%的乙酸溶液每1克组织。使用至少20毫升。在室温下搅拌2小时。
19. 将组织和内容倾倒到 0.7 毫米滤网中。使用钳子手动按摩组织。将内容放回烧嘴中。用每1克组织1倍PBS的60mL覆盖来清洗组织。使用至少20毫升。在室温下搅拌15分钟。重复一次。
20. 将组织和内容倾倒到 0.7 毫米滤网中。使用钳子手动按摩组织。将内容放回烧嘴中。用每 1 克组织 60 mL DI 水覆盖组织进行清洗。使用至少20毫升。在室温下搅拌15分钟。重复一次。
21. 在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。将组织和内容倾倒到过滤器中。使用钳子手动按摩组织。
22. 将内容放回烧嘴中。用每1克组织100%n丙醇的60mL覆盖组织。使用至少20毫升。在室温下搅拌1小时。
23. 在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。将组织和内容倾倒到 0.7 毫米滤网中。使用钳子手动按摩组织。
24. 将内容放回烧嘴中。用每1克组织60mL的DI水覆盖来清洗组织。使用至少20毫升。在室温下搅拌15分钟。重复三次。
25. 将组织和内容倾倒到过滤器中。重复步骤 2.3–2.6 以收集用于蔗糖孵化和冷冻的冷冻状态嵌入介质的组织片段。
26. 在细腻的任务上短暂干燥组织擦拭和称重。放置在标有 15 mL 管中。冻结在-80°C过夜。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot	VWR	16004-128
2-methylbutane	Alfa Aesar	19387
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Gibco	14040133
Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	cryostat embedding medium
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		delicate task wipes
n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	Phosphate-buffered saline
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Peracetic acid	Sigma-Aldrich	77240-100ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200-056
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211	Richard-Allan Scientific	7211
Whatman qualitative filter paper, Grade 4	Whatman	1004-110	grade 4 qualitative filter paper
Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-5