Overview
يصف هذا الفيديو تقنية اشتقاق هيدروجيلات مصفوفة خارج الخلية عن طريق إزالة التحلل منصات الدهون المورين الثديي بعد تشعيع الجسم الحي السابق للدراسات المختبرية. يساعد هذا الهيدروجيل على محاكاة بيئة أنسجة الثدي في الجسم الحي بعد العلاج الإشعاعي لدراسة سلوك الخلايا السرطانية.
Protocol
1. التفكيك
ملاحظة: تم تكييف هذا الإجراء من الأساليب المنشورة سابقا التي تركز على التفكيك الدهني ، والتي شملت المنظفات الأيونية deoxycholate الصوديوم بدلا من كبريتات دودسيل الصوديوم لإزالة الحمض النووي بكفاءة.
- في اليوم 1، قم بإزالة منصات الدهون الثديية المجمدة أو MFPs من -80 درجة مئوية وتذوب في درجة حرارة الغرفة.
- مرة واحدة إذابة، MFPs الجافة لفترة وجيزة على مسح مهمة حساسة. وزن MFPs باستخدام مقياس تحليلي.
- باستخدام زوج من ملقط مع مقص أو مشرط، وتقسيم الأنسجة تصل إلى عينات 3 ملم × 3 ملم × 3 ملم لدراسة ECM سليمة والأنسجة المتبقية لإنتاج الهيدروجيل.
ملاحظة: ويتوقف عدد العينات على عدد طرق الاختبار، على سبيل المثال، فيما يلي وصف لعينتين: واحدة لتضمين البارافين (الخطوة 1-5) وواحدة للتجميد في وسيط تضمين الكريوستات، إذا رغبت في ذلك (انظر جدول المواد والخطوة 1-6). - وزن الأنسجة. إذا كان تضمين في البارافين للقسم، استمر في الخطوة 1.5. إذا كان التجميد في cryostat تضمين المتوسطة للقسم، استمر في الخطوة 1.6.
- في غطاء محرك السيارة الكيميائية، وغمر الأنسجة في 10٪ الفورمات العازلة محايدة (NBF) (انظر جدول المواد)لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. غسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما. غمر الأنسجة في السكروز 30٪ لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
- وزن الأنسجة الآن بعد أن تمت إزالة هذه القطعة. استمر في الخطوة 1.6.
- في غطاء محرك السيارة الكيميائية، ضع قطع MFP في كاسيت المسمى إعدادها مع cryostat تضمين المتوسطة. إضافة المزيد من cryostat تضمين المتوسطة لتغطية الأنسجة.
- ضع الكاسيت في كوب من 2-ميثيلبوتان (انظر جدول المواد)الذي يتم تبريده مسبقا بالنيتروجين السائل. يجب أن يكون الكأس ما يكفي من 2-ميثيلبوتان لتغطية الجزء السفلي ولكن ليس بما فيه الكفاية لغمر كاسيت لأن المتوسط تضمين cryostat لا ينبغي أن تلمس 2-ميثيلبوتان. اسمحوا كاسيت الجلوس في 2-ميثيلبوتان حتى تجميد تضمين cryostat المتوسطة ويصبح معتمة.
- التفاف كاسيت (ق) في احباط، التسمية، وترك في -80 درجة مئوية حتى تستخدم للتقسم.
ملاحظة: تم تقسيم الأنسجة الموضوعة على الفور في وسيط تضمين cryostat عند 5 ميكرومتر في حين تم تقسيم الأنسجة المحتضنة في السكروز في 30 ميكرومتر للاحتفاظ مورفولوجيا الخلايا الدهنية.
- استخدام ملقط لتدليك يدويا الأنسجة المتبقية.
ملاحظة: ويمكن أيضا أن توضع قطع الأنسجة في 10٪ فرنك بلجيكي لمدة 24-48 ساعة، وشطف في برنامج تلفزيوني، وترك في الإيثانول 70٪ حتى تضمين في البارافين. بعد التضمين، يمكن استخدام أقسام 5 ميكرومترات لتلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) (انظر القسم 2 أدناه). - وضع MFPs في أطباق 6 سم مع 5 مل 0.02٪ تريبسين/ 0.05٪ حل EDTA. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. رش ومسح الأطباق مع الإيثانول 70٪ قبل وضعها في الحاضنة.
- استخدم مصافي 0.7 مم لغسل MFPs بالماء deionized (DI) عن طريق صب الماء على الأنسجة ثلاث مرات. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين يغسل.
- الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضع الأنسجة في كوب ما قبل الاوتوسلاف يحتوي على شريط ضجة بحجم مناسب. تغطية الأنسجة مع 60 مل من 3٪ ر-octylphenoxypolyethoxyethanol (انظر جدول المواد)لكل 1 غرام من الأنسجة ويحرك لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل.
- تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. شطف الكأس مع الماء DI وتصب على الأنسجة. كرر مرتين أخريين. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين الشطف.
- الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. وضع الأنسجة والحانات اثارة مرة أخرى في نفس الأكواب، وتغطية مع 60 مل من 4٪ حمض الديوكسيكوليك لكل 1 غرام من الأنسجة. يحرك المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل.
- تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة شبكة. شطف الكأس مع الماء DI وتصب على الأنسجة. كرر مرتين أخريين. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين الشطف.
- الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها.
- وضع الأنسجة في نفس الكأس مع المياه DI العذبة تكملها 1٪ البنسلين-streptomycin. تغطية بإحكام مع فيلم البارافين. يترك بين عشية وضحاها عند 4°C.
- غسل مصافي والأكواب للاستخدام في اليوم التالي.
- في اليوم 2، استنزاف محتويات الكأس في مصفاة. الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها.
- ضع MFPs في نفس الكأس مع شريط تحريك بحجم مناسب. تغطية مع 60 مل 4٪ الإيثانول / 0.1٪ محلول حمض البيراسيتيك لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل. يحرك المزيج لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. غسل الأنسجة عن طريق تغطيتها مع 60 مل من 1x PBS لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل. يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
- تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. غسل الأنسجة عن طريق تغطيتها بماء DI 60 مل لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل. يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
- الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا.
- ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. تغطية الأنسجة مع 60 مل من 100٪ ن بروبانول لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل. يحرك المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 ملم. استخدام ملقط لتدليك الأنسجة يدويا.
- ضع المحتويات مرة أخرى في الكأس. غسل الأنسجة عن طريق تغطيتها مع 60 مل من المياه DI لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدام الحد الأدنى من 20 مل. يحرك المزيج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر ثلاث مرات.
- تفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. كرر الخطوات 2.3-2.6 لجمع قطع من الأنسجة لاحتضان السكروز وتجميدها في وسط تضمين cryostat.
- الأنسجة الجافة لفترة وجيزة على مهمة حساسة مسح ووزنها. ضعه في أنبوب يحمل علامة 15 مل. تجميد عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/ Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-5 |
