Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) משמשת לעקיפת מגבלת עקיפה אופיינית של מיקרוסקופיית אור ולהציג אקסוזומים בסולם הננומטר. זה יכול להיות מועסק בשניים ושלושה ממדים כדי לאפיין אקסוזומים.

Abstract

שלל חוץ-תאי (EVs) משוחררים על ידי כל סוגי התאים וממלאים תפקיד חשוב באיתות התא ובהומאוסטזיס. ההדמיה של EVs דורשת לעתים קרובות שיטות עקיפות בשל הקוטר הקטן שלהם (40-250 ננומטר), שהוא מתחת לגבול העקיפה של מיקרוסקופיית אור טיפוסית. פיתחנו הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר של EVs כדי לעקוף את מגבלת עקיפה בשניים ושלושה ממדים. באמצעות גישה זו, אנו יכולים לפתור את הצורה התלת ממדית של EVs בתוך +/- 20 ננומטר רזולוציה על ציר XY ו + / - 50 ננומטר רזולוציה לאורך ציר Z. לסיכום, אנו מציעים כי מיקרוסקופיה ברזולוציית-על תיחשב כשיטת אפיון של EVs, כולל אקסוזומים, כמו גם וירוסים עטופים.

Introduction

שלל חוץ-תאי (EVs) הם שלוקים הקשורים בממברנה המשתחררים על ידי כל סוגי התאים. הם מכילים שומנים, חלבונים, מטבוליטים וחומצות גרעין ומעבירים חומרים אלה באופן מקומי בין תאים ומעבירים בין רקמות ואיברים. ישנם שלושה תתי סוגים עיקריים של EVs: גופים אפופוטוטיים, microvesicles, ו exosomes1,2. כאן, אנו ממקדים את הדיון שלנו על אקסוזומים והחלבונים הקשורים שלהם.

אקסוזומים הם שלל מופרש שמקורו בהתפתחות הפנימית של אנדוזומים מוקדמים לתוך הגוף הרב-לשוני (MVB). לאחר מכן MVB מתמזג עם קרום הפלזמה, משחרר את exosomes לתוך החלל החוץ תאי לנסוע לתאים אחרים3,4. אקסוזומים קיימים על ספקטרום של גדלים הנעים בין 40 ל -150 ננומטר ומועשרים בחלבוני טרנס-מברן אנדוסומלית המכונים טטרספנינים (CD9, CD63, CD81), קומפלקס מיון אנדוסומאלי הקשור לממברנה הנדרש להובלה (ESCRT), וחלבונים הקשורים לרפסודה של שומנים1,2,5,6,7.

אפיון ההרכב הביוכימי של אקסוזומים הפך לתחום פופולרי עבור חוקרים להבין טוב יותר את האופי התפקודי שלהם. קיימות שיטות רבות להדמיה ואפיון אקסוזומים, כולל ציטומטריית זרימה ננומטרית, ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA), מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה ושידור (TEM), תהודה פלסמון פני השטח, חישת דופק התנגדותית ומיקרוסקופיה אור מסורתית, שכל אחד מהם מכיל יתרונות פנימיים וחסרונות8,9. TEM ו- cryo-EM יכולים להשיג רזולוציה מבוססת ננומטר, אך לעתים קרובות דורשים צעדי התייבשות ושבר בהקפאה, ובכך מתכווצים או מתרוממים EVs10,11. NTA מסתמכת על פיזור אור, המאפשר אפיון של מאות EVs בכל פעם, אבל היא מדידה עקיפה של גודל החלקיקים ולא יכול להבחין בקלות בין EVs, וירוסים, וחלבון אגרגטים12,13,14,15,16. ציטומטריית זרימה ננומטרית משתמשת בפיזור אור מנתיב עירור, אשר לאחר מכן ניתן לתרגם למדידות גודל, אבל היא טכנולוגיה מתפתחת, ויש קונצנזוס קטן על מה גודל החלקיקים נמצאים בטווח הליניארי של זיהוי עבור מכשירים שונים12,17,18.

מיקרוסקופיה אור מסורתית באמצעות חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים הייתה אחת הטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים תת-תאיים, מתחמי חלבון ומכונות איתות בתוך תא. בעוד טכניקה זו מוכיחה שימושית לדמיין את לוקליזציה של מתחמים, מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיה אור מסורתית (סביב 250-400 ננומטר) מונעת את הרזולוציה הברורה של חלבונים או מבנים בטווח הגודל הטיפוסי של exosome (40-150 ננומטר)12,19,20.

מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כלומר, מיקרוסקופיה שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM), מבדילה את עצמה ממיקרוסקופיה קלה קונבנציונלית על ידי שימוש בתכונות הניתנות לצילום של פלואורופורים ספציפיים וזיהוי אירועים מהבהבים אלה כדי לשחזר תמונות עד לדיוק ננומטר21. אירועים של פוטו-וויצ'ינג נאספים באמצעות מצלמת זיהוי בקצב גבוה במהלך עשרות אלפי חשיפות בודדות, ופונקציית התפשטות נקודה משמשת למיפוי בביטחון רב את המיקום המדויק של הפלורופור השוטף19,20,22. זה מאפשר dSTORM לעקוף את מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיית אור. מספר קבוצות דיווחו על שימוש בטכניקות ברזולוציית-על להדמיה ומעקב אחר אקסוזומים והחלבונים הקשורים22,23,24,25. הרזולוציה הסופית תלויה בתכונות הביופיסיות של הפלואורופור, אך לעתים קרובות נעה בין +/-10-100 ננומטר לאורך ציר ה-XY, ומאפשרת רזולוציה של מולקולה אחת.

היכולת לפתור פלואורופורים בודדים בקנה מידה זה על ציר XY חוללה מהפכה במיקרוסקופיה. עם זאת, יש מעט נתונים על dSTORM תלת מימדי (תלת-ממדי) של אקסוזום. לכן, ביקשנו לקבוע נוהל הפעלה סטנדרטי (SOP) להדמיה ואפיון מבוססי dSTORM של EVs מטוהרים, כולל אקסוזומים לדיוק ננומטר בתלת-ממד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 הפצה ותחזוקה של קווי תאים

  1. לרכוש תאי אוסטאוסרקומה אנושיים (U2OS) ולמקם את התאים במדיום הצמיחה בתוספת 10% סרום בקר עוברי ללא אקסוזום ופתרון 1x פניצילין/סטרפטומיצין.
    הערה: סרום בקר עוברי ללא אקסוזום נוצר בעקבות הפרוטוקול שהוצג במקנמרה et. אל26.
  2. לשמור על תאי U2OS באינקובטור מצופה נחושת ב 37 °C ב 5% CO2 ותאי מעבר T175 צלוחיות26,27. התאים חייבים להישמר בשלב הצמיחה הלוגריתמי באמצע כדי למנוע תת-אוכלוסין הנובע, או מהצטברות של פסולת אפופטוטית במהלך השלב הנייח.

2 בידוד וטיהור אקסוזומים

  1. הגדל את קווי התא U2OS להשפעה מלאה ב-10 צלוחיות T175 נפרדות עם 50 מ"ל של מדיה לבקבוקון. הסר את תא supernatant ולאחר מכן לעבור אותו דרך 0.45 מיקרומטר ו 0.22 מיקרומטר סינון ואקום מנגנון סינון.
  2. נתן את supernatant לסינון זרימה צולבת (הידוע גם בשם סינון זרימה משיק) על מערכת סינון מצויד מחסנית 750 kDa חלול סיבים על מנת להסיר חלבונים קטנים יותר או מטבוליטים28.
    1. מעבר supernatant דרך מפעיל סינון זרימה משיק בלחץ קדימה מתמיד של 30 פסאיי, תוך שמירה על לחץ שמירה של <20 פסאיי כדי לייצר לחץ Δ של 10 או יותר פסאיי. מניחים מוט מערבוב מגנטי במיכל retentate ומגדירים ל 150 סל"ד26.
    2. שמור על קצב ההזנה ב 40 מ"ל / דקה ומעלה. אוספים את החפירה במאגר ונפטרים ממנו.
  3. מרכז את supernatant ל 30 מ"ל, ולאחר מכן שיווי משקל עם ארבעה כרכים של 1x PBS. לאסוף את זרימה צולבת מסנן ופתרון מכויל בצינור חרוט 50 מ"ל.
  4. לזרז את EVs ב 4 °C (55 °F) בריכוז סופי של 40 מ"ג / מ"ל פוליאתילן גליקול עם משקל מולקולרי של 8,000 Da. צנטריפוגה EVs ב 1,200 x גרם ב 4 °C (4 °F) עבור 1 שעות resuspend ב 500 μL של 1x PBS.
  5. לדגור על EVs עם 50 מיקרוגרם / מ"ל של צבע intercalating קרום אדום photowitchable ו 50 מיקרוגרם / מ"ל של RNase A ב 1x PBS ב 4 °C (5 °F) עבור 1 שעה.
  6. הסר צבע עודף דרך עמודה במערכת טיהור חלבונים המחוברת לאספן שברים. זהה שברי EV באמצעות ספיגת UV ובריכה אותם לתוך צינור microcentrifuge26.
  7. זיקה-לבחור סך של 200 μL של EVs באמצעות חרוזים מגנטיים נגד CD81 שיווי משקל ב 1x PBS.
    1. לדלל 100 μL של החרוזים המגנטיים נגד CD81 ב 1x PBS לנפח כולל של 1 מ"ל ולאפשר להם להיקשר ב 4 °C (2 °F) עבור 2 שעות בצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם נדנדה רציפה.
  8. לשטוף את החרוזים נגד CD81 ו EV שלוש פעמים עם PBS 1x. Elute CD81+ EV מהפתרון עם גליצין 100 מ"מ ב- pH 2.0 למשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
  9. Pipette CD81 + EV מטוהר לנפח שווה של 100 mM Tris-HCl ב pH 7.5 ב 1x PBS.
    הערה: aliquot של פתרון CD81 + EV מטוהר עשוי להיות שמור לניתוח מעקב חלקיקים או מיקרוסקופיה אלקטרונית על מנת לאשר את טוהר הפתרון ואת נוכחותם של EVs26.

3 קיבעון והכנה

  1. הנח/י כלי עבודה מטוהרים על לוחות 8-באר מטוהרים מזכוכית בתחתית זכוכית μ בנפח כולל של 200 μL (יכול לדלל דגימת EV ב-100 מ"מ טריס-HCl ב-pH 7.5 ב-1x PBS) ולאפשר לדבוק בפני השטח למשך הלילה ב-4 °C (C).
  2. מבלי להסיר את הפתרון הקיים מהצלחת 8-well, לתקן EVs על הצלחות על ידי הוספת 200 μL של 4% paraformaldehyde ב 1x PBS לפתרון המכיל EV בכל באר ולאפשר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר21.
  3. הסר בזהירות paraformaldehyde ופתרון עודף עם micropipette כדי לא להפריע את EVs. לשטוף את EV עם 1x PBS כדי להסיר paraformaldehyde עודף. בצע את הליך הכביסה שלוש פעמים. הסר עודף 1x PBS.
  4. הכן 250 μL של פתרון חיץ dSTORM B-cubed לכל מדגם על-ידי יצירת פתרון של 5 mM protocatechuate dioxygenase (חלק A) מדולל במאגר הדמיה (חלק B) לכל פרוטוקול של היצרן.
    הערה: ריכוז האנזים במאגר עשוי להיות מוכפל ל 10 mM אם מתרחשת ליבנה.
    1. הוסף 250 μL של המאגר המוכן לכל באר לפי פרוטוקול היצרן במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר לפני הדמיה כדי לחפש מולקולות חמצון.
      הערה: לאחר מכן ניתן לצפות ב- EV באופן מיידי או לאחסן אותו ב- 4 °C (70 °F) למשך עד שבוע. החלף את המאגר הבא לפני כל פריט חזותי.

4 כיול מיקרוסקופי שחזור אופטי סטוכאסטי ישיר

  1. הכן את החרוזים הדרושים לכיול המיקרוסקופ ברזולוציית העל על ידי דילול מיקרוספרות של 100 ננומטר לריכוז של 0.5% במים מולקולריים כיתה וצינור 200 μL לתוך כל באר של צלחת 8-שקופית μ-שקופית 8-באר.
    1. אפשר לחרוזים להתיישב בבארות במשך שעה בטמפרטורת החדר.
  2. מבלי להסיר את הפתרון הקיים, להוסיף 200 μL של 4% paraformaldehyde ב- PBS לכל באר לפתרון חרוז הכיול ולאפשר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. הסר בזהירות את paraformaldehyde עם micropipette לא להפריע החרוזים לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1x PBS. הכן את המאגר בהתאם לשלב 3.4.
  4. הסר 1x PBS והוסף 250 μL של המאגר המוכן לכל באר. אפשר למאגר לשבת 20 דקות לפני הפריט החזותי.
  5. לפני הנחת משהו על הבמה, התחבר למיקרוסקופ תלת-ממדי באמצעות לחצן חבר את המיקרוסקופ. מוסיפים שמן 100x למטרה ומניחים את מרכז הבאר על גבי המטרה. בהגדרה רכישה, הפעל את לייזרי העירור 473 ו- 640 ננומטר ולחץ על הצג.
    1. ללא הפעלת העדשה בתלת-ממד, הצג את החרוזים תחת הגדרת רוויית הפופוטונים על-ידי לחיצה על ספירת פוטון באפשרויות תצוגת תמונה. הגדר את כוחות הלייזר הראשוניים ל-8.4 מ"ו ללייזר 473 ננומטר ול-11.6 מ"ו ללייזר 640 ננומטר.
    2. להקטין את המוקד של הלייזר סביב -300 ננומטר או את המישור המוקד של חרוזי הכיול כדי לייצר רזולוציה ברורה של החרוזים בודדים. לאחר שמישור Z ממוקד, התאם עוד יותר את רמות צריכת הלייזר כדי להסביר וריאציה בכל שדה ראייה.
  6. תחת פונקציות המכשיר, כיול מיפוי תלת-ממדי וכיול מיפוי ערוצים כדי לקבל את השגיאות בציר X- - Y ו- Z. הגדר את המספר המרבי של FOVs ל- 20, את מספר הנקודות היעד ל- 4,000, את המרחק המרבי בין ערוצים ל- 5.0 פיקסלים ואת רדיוס האי-הכללה בין ערוצים ל- 10.0 פיקסלים במהלך כיול מיפוי הערוצים.
  7. ודא שהכיול מייצר כיסוי נקודתי של >90% ואיכות מיפוי טובה. שמור את נתוני הכיול הנתונים עבור רכישות עתידיות של תמונות.

5 הדמיה של EV בשלושה ממדים

  1. מוסיפים שמן 100x על המטרה ומניחים את ה- EVs המוכנים במיקרוסקופ. ללא הפעלת העדשה התלת-ממדית, הפעל את לייזר העירור של 640 ננומטר והעלה אותו בתחילה ל- 1.2 מגוואט ל- 12.5 מגוואט בהתאם לעוצמת האות ושדה הראייה כדי לרגש את הממברנה האדומה צובעת את הרכבים המוכתמים.
    1. תחת האפשרויות תצוגת תמונה, עברו את שיטת הצפייה מרוויה פוטונית לאוכלונים כדי להציג את ה-EVs באופן חזותי טוב יותר. כוונן את עוצמת הלייזר כדי למזער רעשים, תוך מיקסום האות. שמור על כל הפרמטרים האחרים.
    2. התאם את המוקד של מישור Z על-ידי לחיצה על סמל למעלה או למטה בציר Z.
      הערה: מטוס Z צריך להיות ממוקד בין -200 ל -350 ננומטר, אך ישתנה בהתאם לשדה הראייה.
  2. הגדר את זמן החשיפה ל- 20 אלפיות שני, את לכידת המסגרת ל- 10,000 פריימים ואת עוצמת הלייזר ההתחלתית ל- 1.2 מגוואט ל- 12.5 מגוואט, או את עוצמת הלייזר שנקבעה בשלב 5.1, בהתאם לעוצמת האות ושדה הראייה.
    1. הפעל את העדשה 3-D באמצעות הסמל ולהתחיל את הרכישה על ידי לחיצה על כפתור רכישה.
  3. במהלך רכישת התמונה, העלה את עוצמת הלייזר ב-3 במרווחים של 10 כל 1000 פריימים, או מספיק כדי לשמור על יחס אות לרעש גבוה. אל תתאים את מטוס Z במהלך הרכישה.
    הערה: ניתן להעלות את הלייזר למקסימום של 90 mW כוח לייזר.

6 שינויים לאחר הרכישה ומעקב אחר EV

  1. לאחר רכישת התמונה, עבור לחלון הצפייה 'ניתוח'. בצע תיקון סחף בתמונה הלא מסוננת ולאחר מכן הפעל מסננים. התאם את ספירת הפופוטים, דיוק ההתאמה לשפות לוקליזציה, סיגמות ואינדקס מסגרות בהתאם לטבלה 1.
  2. שכבת-על כלי תצוגה של מישור XYZ לאורך ציר X של כלי ערך חשמליים בודדים משדה הראייה והייצוא . קבצי CSV של אירועי צילום.
  3. חצו את הרכבים האלקטרוניים הבודדים בציר XY בשדה תצוגה X by Y באמצעות כלי היסטוגרמה של קו, המכניס בין אירועים של צילומי תמונות לקבוצות מרחק מוגדרות.
  4. צמו תמונות של EVs בודדים ושמרו אותם כקבצים .tiff.
  5. צרו סרטוני וידאו תלת-ממדיים של כלי עבודה אלקטרוניים בודדים באמצעות כלי תצוגה חזותי תלת-ממדי וצבע בהתאם למיקום לאורך ציר Z.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת מחקר זה הייתה להעריך את האפקטיביות של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על בהדמיית EVs בודדים ברזולוציית ננומטר בשלושה ממדים (תלת-ממד). כדי לנתח את הצורה והגודל של EVs בודדים, השתמשנו בצבע פוטו-חוטי ודגרנו את ה- EVs עם צבע אדום בהרבה, ממברנה מתערבב, והסרנו צבע עודף דרך כרומטוגרפיה29. לאחר מכן נצפו במיקרוסקופ בעל רזולוציית העל תחת לייזר העירור של 640 ננומטר. בעקבות הכיול של המיקרוסקופ שיצר שגיאה ממוצעת של 16 ננומטר בציר XY ו- 38 ננומטר בציר Z (איור 1A,B),U2OS EVs המטוהרים הוצגו בהצלחה עם רזולוציה של עד 20 ננומטר על ציר XY ו- 50 ננומטר לאורך ציר Z.

כלי הפעלה חשמליים בודדים שדמיינו באמצעות dSTORM בצילומים תלת-ממדיים לאורך 10,000 החשיפה למסגרת כאשר כוח הלייזר גדל והיו גלויים בתמונה הנרכשת(איורים 2A, B). תיקון תמונה לאחר הרכישה של Z-plane, ספירת פוטון, סיגמות, ודיוק לוקליזציה של התמונה המשוחזרת מותר לרזולוציה ברורה של EV ב 3-D (איור 2C,D). ה-EV באיור 2C צילם רק את 7,000 הפריימים הראשונים, כפי שניתן לראות מהאגדה בפינה הימנית העליונה. זוהי תוצאה של ליבנה פוטו כי ייתכן שנגרם על ידי העלאת כוח הלייזר מהר מדי. ההיסטוגרמה מאשרת כי רוב אירועי הצילום התרחשו ברדיוס של 100 ננומטר (איור 2E),המאשר כי הרכב המוצלח הוא אקסוזום וכי הבידוד של הרכבים חשמליים בקוטר קטן הצליח.

ניתוח התפלגות גודל בוצע על כלי עבודה אחרים במעקב בנפרד באמצעות כלי היסטוגרמה קו וכלי תצוגת מישור XYZ כדי לאשר כי רוב אירועי photowitching התרחשו ברדיוס של 100 ננומטר של המרכז (איור 3A,C), אימות נוסף של היכולת של dSTORM לדמיין EVs בקוטר קטן. כפי שניתן לראות על ידי כלי הדמיה תלת-ממדי, השגיאה לאורך ציר Z מוגברת, ומייצרת תמונה סופית מוארכת של EV לאורך הציר הצירי (איור 3D, וידאו 1). אירועי פוטו-וויצ'ינג לא היו מתואמים עם גודל הרכב המוצלב(איור 3E),המוכיחים כי ניתן להשתמש באפיון מבוסס dSTORM עבור EVs קטנים כגון אקסוזומים ווירוסים קטנים עם מעטפות בקוטר של פחות מ-100 ננומטר.

הפרמטרים הנכונים עבור Z-plane ו- sigma הם חלק בלתי נפרד מהרזולוציה הנכונה של הממברנה בתלת-ממד. בנוסף, זמן החשיפה הנכון, מספר המסגרות שנתפסו ורמת הלייזר הראשונית חיוניים לייצור תמונה של EV בודד עם ממברנה פתורה. חקירה נוספת צריכה להיעשות על איך לייעל את המיקרוסקופ ולהגדיר הן פרמטרים לפני הרכישה ולאחר הרכישה כדי ללכוד את התמונות ברזולוציה הגבוהה ביותר של EVs.

Figure 1
איור 1: כיול המיקרוסקופ ברזולוציית העל בשלושה ממדים באמצעות מיקרוספרות של 100 ננומטר. (A)שדה ראייה בגווני אפור מכילול המיקרוסקופ עם מיקרוספרות לאחר תיקוני תמונה לאחר הרכישה. סרגל קנה מידה בצד ימין התחתון. (B)שגיאות כיול מוחלטות בציר ה- XY ובציר Z הושגו באמצעות כיול מיפוי ערוצים וכיול מיפוי תלת-ממדי, בהתאמה. N = 10 שכפולים ביולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: dSTORM של EV יחיד בשלושה ממדים. (A) שדה ראייה בגווני אפור של CD81+ כלי עבודה מטוהרים זיקה מוכתמים בצבע קרום אדום ניתן לצילום ונרגשים עם לייזר עירור של 640 ננומטר. סרגל קנה מידה בצד ימין התחתון. (B)שדה תצוגה מ- A המסומן לפי צבע הערוץ. (C)EV יחיד מהתצוגה המוגדלת של התיבה הלבנה ב- A, המסומנת לפי אינדקס המסגרות. מפת החום בפינה הימנית העליונה מציינת את המסגרת שבה נרשמו אירועי הצילום. סרגל קנה מידה בצד ימין התחתון. (D)EV מ- C המסומן לפי צבע הערוץ. (E)ניתוח התפלגות גודל נוצר על-ידי חוצה את הרכב המנוקב בקו המקווקו המוצג ב- D והפרדת האירוע של 15.4 ננומטר באמצעות כלי היסטוגרמה של קו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הפצת אירועי פוטו-חוטים במהלך רכישת EV יחיד בשלושה ממדים. (A)תמונה משוחזרת של EV מטוהר CD81+ המסומן בצבע משולב של ממברנה אדומה הניתנת לצילום ונרגש עם לייזר עירור 640 ננומטר. סרגל קנה מידה בצד ימין התחתון. (B)חלקת תיבה ושפם בקוטר ממוצע של CD81+ כלי עבודה מטוהרים זיקה המתקבלת באמצעות כלי היסטוגרמה קו של המיקרוסקופ לאורך ציר XY. (ממוצע = 104 ננומטר, סטיית תקן = 28 ננומטר). (C)מיקום אירועי פוטו-חוט בודדים לאורך ממד ה- XY של ה- EV ב- A, שנרשמו לאורך 10,000 החשיפה למסגרות. (D)מיקום אירועי פוטו-חוט בודדים לאורך ציר XZ של ה- EV ב- A, שנרשם לאורך 10,000 החשיפה למסגרות. (ה)פיזור של מספר אירועי הצילום המתועדים על 400 פריטים חדשים בקוטרים שונים. ערך R בריבוע של 0.1065 אינו מדגים קשר בין מספר אירועי ה- photoswitching שזוהו לבין קוטר EV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: תמונה תלת-ממדית של EV יחיד מטוהר CD81+ עם תווית של קרום אדום ניתן לצילום והתרגשות עם לייזר עירור 640 ננומטר. ערכת הצבעים מסומנת לפי עומק לאורך ציר Z. השגיאה לאורך ציר Z מוארכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

משתנה דקות מקס
ספירת פוטון 200 10,000,000
Z-position (nm) -300 300
לוקליזציה דיוק X (nm) 0 40
לוקליזציה דיוק Y (nm) 0 40
דיוק סיגמא X (nm) 0 40
Precision Sigma Y (nm) 0 40
סיגמא X (nm) (ערוץ 0, לייזר 640 ננומטר) 100 350
סיגמא Y (nm) (ערוץ 0, לייזר 640 ננומטר) 100 350
סיגמא X (nm) (ערוץ 1, 473, לייזרים 561 ננומטר) 100 350
סיגמא Y (nm) (ערוץ 1, 473, לייזרים 561 ננומטר) 100 350
אינדקס מסגרת 0 10,000

טבלה 1: פרמטרים עבור המיקרוסקופ ברזולוציית העל במהלך רכישת תלת-ממד dSTORM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רכבים הסביבה הפכו לתחום מחקר פופולרי בשל תפקידם החשוב בתהליכים תאיים רבים ובאיתות מתא לתא1,30. עם זאת, ההדמיה שלהם מוכיחה להיות קשה כמו הגודל הקטן שלהם נופל מתחת לגבול עקיפה של מיקרוסקופיה אור. מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) היא שיטה ישירה להדמיה העוקפת את מגבלת העקיפה על ידי לכידת אירועים פוטו-חוטים של פלואורופורים בודדים לאורך זמן ושחזור תמונה המבוססת על אירועים מהבהבים אלה21,31. מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר בוצעה בהצלחה בתלת-ממד במספר מבנים תאיים כגון חוטי אקטין, מיקרוטובולות, קולטנים המוטמעים בקרום הפלזמה, וחלבונים ויראליים בתאים נגועים32,33,34,35,36. מטרת המחקר הזה הייתה להעריך את היעילות של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, במיוחד dSTORM, כדי לדמיין EVs בתלת-ממד עם רזולוציית ננומטר. השתמשנו בצבע intercalating ממברנה הניתנת לתמונות כדי לדמיין בהצלחה כלי עבודה אלקטרוניים בודדים מתאי U2OS באמצעות dSTORM ברזולוציה של עד +/- 20 ננומטר על ציר XY ורזולוציה של +/- 50 ננומטר על ציר Z. העבודה הקודמת שלנו הראתה כי EVs מקווי תאים מרובים ונוזלים ראשיים יש פרופילי הפצה בגודל דומה כפי שניתח על ידי NTA ו- TEM26,37. השימוש באפיון מבוסס dSTORM של EVs יכול להוסיף ביטחון נוסף לתופעה זו, כמו גם פוטנציאל לזהות תת-אוכלוסין בשדה ראייה אחד. שיפור נוסף של שיטה זו מוצדק. יתרון בולט אחד ל- dSTORM הוא שהכנת המדגם אינה דורשת צעדים קשים או מזיקים שעשויים לשנות את מבנה ה- EVs. התוצאות שלנו ממחישות עוד יותר כי האופי הביוכימי של EVs נשמר במהלך טיהור EV עם חרוזים אנטי CD81 וגליצין חומצי26,37. תיקנו את כלי התחבורה האלקטרוניים עם paraformaldehyde כדי למנוע פרמזיזציה ממברנה הנגרמת על ידי קיבועים אחרים כגון מתנול ואתנול. זה איפשר לנו להסיק כי dSTORM לוכד במדויק את המורפולוגיה של EVs כפי שהם קיימים בפתרון. השימוש Capto Core 700 יש צורך, עם זאת, כדי לטהר את EVs ביעילות הרחק מזהמים כגון אלבומין ופוליאתילן גליקול מתחת לדרישותהרגולציה 38. מגבלה בולטת אחת של הפרוטוקול היא כי יעילות האיגוד בין EV ושקופיות אינו 100%, ולכן כמה EVs הולכים לאיבוד במהלך הכנת המדגם. חקירה נוספת צריכה להיעשות על היעילות של שקופיות מצופות דבק כדי לקשור טוב יותר רכבים ותיטים.

בעוד הכנת EVs להדמיה היא פשוטה, הפרמטרים במהלך הרכישה ובמיוחד במהלך שינויים לאחר הרכישה משתנים באופן משמעותי מדגם לדגימה, בהתאם לעוצמת ויציבות של EVs ואת הפלורופור. תחום אחד של שונות בניסוי הוא עוצמת לייזרי העירור שיש להעלות בעדינות לאורך כל החשיפה כדי למקסם את האות אך למנוע הצטלבות. ליבנה פוטו, או כאשר פלואורופור מאבד את יכולתו לפלורסה, היא מגבלה משמעותית לאורך מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר12,39. כדי למנוע לייעוד תמונות, ניתן להגדיל את ריכוז האנזים במאגר ל-10 מ"מ כדי לנקות טוב יותר מולקולות מחמצנות ולמנוע צילומי תמונות. בנוסף, הגדרת כוח לייזר העירור לרמה התחלתית נמוכה והעלאה איטית לאורך כל החשיפה לשמירה על אות גבוה היא קריטית למניעת הצטלבות.

בחרנו צבע אדום שניתן להכתים את ה- EVs בשל אורך הגל העירור, העמידות והיכולת לעמוד קיבעון29. עם זאת, הצבע שבחרנו עשוי להציג בעיות במהלך מיקרוסקופיה ברזולוציית-על כאשר הוא מתרגש מהר מדי או בעוצמה גבוהה מדי. הפלואורופורים בצבע הממברנה האדומה הניתנת לצילום יכולים להלבין לאחר 10,000 פריימים או לאחר שכוח הלייזר עולה על 75.6 מ"ו. בנוסף, עוצמת צבע הממברנה והיכולת לפלורסה פוחתת באופן משמעותי לאחר שבוע של אחסון ב 4 °C (70 °F). לבסוף, צבעי האינטרקלציה של הממברנה הוכחו כצורת מיצלים בתמיסה מימית, כך שכל צבע עודף עדיין קיים במדגם EV לאחר הטיהור עשוי להיות מזוהה בטעות עבור EV אם אין סמן אחר לזהות את EV, כגון טטרספנין. חקירה נוספת צריכה להיעשות באמצעות צבעים אחרים intercalating ממברנה כדי לייעל עבור יציבות תמונה31,40. נוגדנים פלואורסצנטיים הצומדים בפני הרכב הרך עשויים להיות אפשרות מתאימה יותר מכיוון שהם נוטים להיות עמידים יותר להלבנה פוטו ויכולים להגביר את האות41. עם זאת, החיסרון של נוגדנים הוא כי האות מן פלואורופור הוא מקוזז מעט מן EV בשל המרחק מן האפיטופ ופלואורופור על הנוגדן.

שיטות קיימות של הדמיה ואפיון של EV, כגון NTA, ציטומטריית זרימה או EM, יכולות לדרוש שלבי הכנה מזיקים או שהן שיטות ויזואליזציה עקיפות. dSTORM דורש הכנה מדגם קטנה, שימור הטבע הביוכימי הטבעי של EVs, והוא שיטה ישירה של הדמיה שיכול לעקוף את מגבלת עקיפה לדמיין EVs בקוטר קטן8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. טכניקות אחרות של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר ניתן אופטימיזציה עבור אפיון EV כגון דלדול פליטה מגורה (STED), מיקרוסקופיה קונפוקלית דיסק ספינינג (SDCM), ומיקרוסקופיה לוקליזציה מופעלת על ידי תמונה (PALM)42,43. המחקר הנוכחי מתמקד אך ורק ב- dSTORM, אך עבודה עתידית על אופטימיזציה של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על והשוואת טכניקות אלה/ניגודיות. רכבים מתקדמים הפכו לאחרונה לתחום מחקר פופולרי ככל שתפקידו בהתקדמות הנגיף נעשה ברור יותר. וירוסים רבים מבחינה אבולוציונית, כגון וירוס אפשטיין בר, HIV, ווירוס הפטיטיס A, התפתחו כדי לנצל את המסלולים לאותת EV כדי לקדם את התקדמות המחלה ולהתחמק מהתגובה החיסונית של הגוף37,44,45,46,47,48,49,50 . וירוסים אלה הוכחו לשלב גורמים ויראליים, כגון mRNAs או חלבונים ויראליים, לתוך EVs שיכולים לאחר מכן להעביר רכיבים אלה לתאים נגועים, תוך בריחה זיהוי מערכת החיסון6,51,52,53. גורמים ויראליים אלה הקשורים exosomal ניתן לזהות ואולי מועסקים כסמן ביולוגי להתקדמות המחלה54,55. לכן, הדמיה מבוססת dSTORM של EVs בודדים והחלבונים הקשורים שלהם ניתן לחקור כפלטפורמה עבור סמנים ביולוגיים מחלות, ואולי, התקדמות המחלה של וירוסים מסוימים54,55. מחקר נוסף צריך להיעשות כדי להעריך את התועלת של dSTORM לדמיין הן תוכן בתוך EV וחלבונים על הממברנה שלה.

לסיכום, הוכחנו כי מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר צריכה להיחשב טכניקה יעילה להדמיה של EVs בתלת-ממד עם רזולוציית ננומטר. התוצאות שהושגו על ידי dSTORM עולות בקנה אחד עם טכניקות אפיון EV אחרות. יתרון מובהק של dSTORM הוא היכולת לדמיין חלקיקים ישירות מתחת למגבלת עקיפה של אור ללא התייבשות או הקפאת צעדי שבר שיכולים לשנות את האופי הביוכימי של EVs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.G.C. אין ניגודי אינטרסים להצהיר. R.P.M ו- D.P.D. מקבלים תמיכה חומרית מאוקספורד ננו-הדמיה (ONI) Inc. ו- Cytiva Inc. (לשעבר GE Healthcare). R.P. .M ו- D.P.D. מצהירים על אינטרסים מתחרים למסחור אפשרי של חלק מהמידע המוצג. אלה מנוהלים על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה. מקורות המימון לא היו מעורבים בפרשנויות או בכתיבה של כתב יד זה.

Acknowledgments

ברצוננו להודות ל-Oxford Nanoimaging על המשוב וההדרכה הבונים שלהם. עבודה זו מומנה על ידי 5UM1CA121947-10 ל R.P.M. ואת 1R01DA040394 ל D.P.D.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

ביולוגיה גיליון 174
מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, M. G., McNamara, R. P.,… More

Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter