Summary
직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법 (dSTORM)은 빛 현미경 검사법의 전형적인 회절 한계를 우회하고 나노 미터 척도에서 엑소좀을 보는 데 사용됩니다. 엑소좀을 특성화하기 위해 2차원과 3차원에서 모두 사용할 수 있다.
Abstract
세포 외 소포 (EV)는 모든 세포 유형에 의해 방출되고 세포 신호 및 항상성에 중요한 역할을합니다. 전기 EV의 시각화는 종종 일반적인 빛 현미경 검사법의 회절 한계 아래에있는 작은 직경 (40-250 nm)으로 인해 간접적인 방법이 필요합니다. 우리는 2 차원과 3 차원 모두에서 회절 제한을 우회하기 위해 전기 TV의 초해상도 현미경 기반 시각화를 개발했습니다. 이 방법을 사용하여 XY 축및 XY 축에서 +/- 20 nm 해상도 내에서 EV의 3차원 모양을 해결하고 Z축을 따라 50nm 해상도로 해결할 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 초해상도 현미경 검사법이 외성뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스를 포함한 EV의 특성화 방법으로 간주될 것을 제안합니다.
Introduction
세포 외 소포 (EV)는 모든 세포 유형에 의해 방출되는 막 바인딩 소포입니다. 그(것)들은 지질, 단백질, 대사 산물 및 핵산을 포함하고 조직과 기관 사이 세포 사이 를 현지으로 이 물질을 전송합니다. 전기 의 세 가지 기본 하위 유형이 있다: apoptotic 바디, microvesicles, 및 엑소좀1,2. 여기에서, 우리는 엑소좀과 그들의 관련한 단백질에 우리의 토론을 집중합니다.
엑소좀은 초기 내종의 내후 신진에서 다중 혈관 체(MVB)로 유래한 소포를 분비한다. MVB는 그 때 플라즈마 막과 융합하여 외식을 세포외 공간으로 방출하여 다른세포3,4로이동한다. 엑소좀은 40~150nm에 이르는 다양한 크기의 스펙트럼에 존재하며 테트라스판닌(CD9, CD63, CD81), 수송에 필요한 막 경계 내도 선별 복합체(ESCRT), 지질 래프트 관련 단백질1,2,5,6,7로구성된 내피 반막 단백질로 풍부하게 함유되어 있다.
엑소좀의 생화학적 구성을 특징짓는 것은 연구자들이 기능성 특성을 더 잘 이해할 수 있는 인기 있는 분야가 되었습니다. 나노스케일 유동 세포측정, 나노입자 추적 분석(NTA), 스캐닝 및 투과 전자 현미경검사(TEM), 표면 플라스몬 공명, 저항 펄스 감지 및 전통적인 광 현미경 검사법을 포함한 엑소좀을 시각화하고 특성화하기 위한 많은 방법이 존재하며, 각각 내장된 프로및 단점8,9을함유하고 있다. TEM 및 저저온-EM은 나노미터 기반 해상도를 달성할 수 있지만 탈수 및 동결 골절 단계가 필요하므로 EV10,11을축소하거나 용해합니다. NTA는 빛 산란에 의존하여 한 번에 수백 대의 전기 Ev의 특성화를 허용하지만 입자 크기의 간접 측정이며 EV, 바이러스 및 단백질 집계12,13,14,15,16을쉽게 구별할 수 없다. 나노스케일 유동 세포측정은 난리 경로로부터 광산란을 사용하여 크기 측정으로 변환할 수 있지만 신흥 기술이며, 다양한계측기(12,17,18)에대한 검출의 선형 범위 내에 있는 입자의 크기에 대해서는 거의 합의가 없다.
형광 단백질 이나 염료를 사용 하 여 전통적인 빛 현미경 검사량 세포 구획을 시각화 하기 위한 가장 많이 사용 되는 기술 중 하나입니다., 단백질 복합체, 그리고 세포 내에서 신호 기계. 이 기술은 복합체의 국소화를 시각화하는 데 유용하지만, 전통적인 광 현미경 검사법(약 250-400 nm)의 회절 제한은 엑소좀(40-150 nm)12,19,20의일반적인 크기 범위에서 단백질 또는 구조의 명확한 분해를 방지한다.
초분해능 현미경 검사법, 즉 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법(dSTORM)은 특정 형광의 광전환 특성을 활용하고 이러한 깜박이는 이벤트를 감지하여 나노미터정밀도(21)로이미지를 재구성하여 기존의 광 현미경 검사법과 구별한다. 포토스위칭 이벤트는 수만 개의 개별 노출 과정에서 고액 검출 카메라를 사용하여 수집되며, 포인트 스프레드 기능은 포토스위칭형광(19,20,22)의정확한 위치를 높은 신뢰도로 매핑하는 데 사용된다. 이를 통해 DSTORM은 빛 현미경 검사법의 회절 한계를 우회할 수 있습니다. 몇몇 단은 엑소좀 및 그들의 관련 단백질을 시각화하고 추적하기 위한 초해상도 기술의 사용을 보고했습니다22,23,24,25. 최종 해상도는 형광의 생물학적 특성에 따라 다르지만 XY 축을 따라 +/-10-100 nm부터 다양하여 단일 분자 분해능을 허용합니다.
XY 축에서 이 척도에서 개별 형광을 해결하는 기능은 현미경 검사법에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 엑소좀의 3차원(3차원) dSTORM에 대한 데이터는 거의 없다. 따라서, 우리는 3-D에서 나노 미터 정밀도에 엑소좀을 포함하여 dSTORM 기반의 시각화 및 정제 된 전기 의 특성화를위한 표준 운영 절차 (SOP)를 확립하고자했습니다.
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Protocol
1 세포주 전파 및 유지 보수
- 인간 골육종 세포 (U2OS)를 획득하고 10 % 엑소좀이없는 태아 소 혈청과 1 x 페니실린 / 연쇄 상미신 용액으로 보충 된 성장 배지에 세포를 배치합니다.
참고 : 외성없는 태아 소 혈청은 McNamara 등에서 제시 된 프로토콜에 따라 생성되었습니다. al.26. - T175 플라스크26,27에서5% CO2 및 통로 세포에서 37°C에서 구리 코팅 인큐베이터에서 U2OS 세포를 유지한다. 세포는 중간 로그산학 성장 단계에서 유지되어야하며, 하위 집단이 발생하지 않도록하거나 고정 된 단계에서 세포 사멸 파편이 축적되는 것을 방지해야합니다.
2 엑소솜의 고립과 정화
- 플라스크당 50mL의 미디어로 10개의 별도 T175 플라스크에서 U2OS 셀라인을 완전한 결합으로 성장시다. 세포 상체를 제거하고 0.45 μm 및 0.22 μm 진공 여과 장치를 통해 연속적으로 통과하십시오.
- 더 작은 단백질 또는 대사산물(28)을제거하기 위해 750 kDa 중공 섬유 카트리지가 장착된 여과 시스템에 대한 교차 흐름 여과(접선 흐름 여과라고도 함)를 교차플로하는 상체를 피한다.
- 상체를 30 psi의 일정한 전방 압력으로 접선 유동 여과 연산자 통과하고, <20 psi의 고정 압력을 유지하면서 10 이상의 psi의 Δ 압력을 생성한다. 재보테이트 탱크에 마그네틱 스터드 바를 놓고 150rpm26으로설정합니다.
- 이송 속도를 40mL/min 이상으로 유지합니다. 저수지에 침투를 수집하고 폐기하십시오.
- 상체를 30mL로 농축한 다음 4권의 PBS로 평형화합니다. 50mL 원문 튜브에서 필터링되고 평형된 용액을 수집합니다.
- 40 mg/mL 폴리에틸렌 글리콜의 최종 농도로 하룻밤 사이에 4°C의 전기를 침전하여 분자량 8,000 Da. 원심분리기 는 4°C에서 1시간 동안 1,200xg에서 1시간 동안 1,200xg의 원심분리기, 1x PBS의 500μL로 재연한다.
- 1h에 대한 4°C에서 1x PBS에서 50 μg/mL의 광전환 가능한 적색 막 과 50 μg/mL의 전기를 1시간 PBS로 1x PBS로 배양한다.
- 분수 수집기에 부착된 단백질 정제 시스템의 컬럼을 통해 과도한 염료를 제거합니다. UV 흡광도를 통해 EV 분획을 식별하고 마이크로 센세이프분리기튜브(26)로풀을 한다.
- 선호도-1x PBS에 상형화된 안티 CD81 마그네틱 구슬을 사용하여 총 200μL의 전기자동차를 선택한다.
- 1x PBS에서 1x PBS로 100 μL을 희석하고 연속 흔들림이 있는 2mL 마이크로센심분리기 튜브에서 2시간 동안 4°C로 결합할 수 있도록 합니다.
- 안티 CD81 구슬과 EV를 1x PBS로 세 번 세척합니다. 37°C에서 30분 동안 pH 2.0에서 100mM 글리신을 장착한 용액의 Elute CD81+ EV.
- 파이펫 정제 CD81+ EV는 1배 PBS에서 pH 7.5에서 100mM Tris-HCl의 동일한 부피로 고정됩니다.
참고: 정제된 CD81+ EV 용액의 알리쿼트(aliquot)는 용액의 순도와EV(26)의존재를 확인하기 위해 나노입자 추적 분석 또는 전자 현미경 검사를 위해 예약될 수 있다.
3 고정 및 준비
- 200 μL의 총 부피 (1 x PBS에서 pH 7.5에서 100 mM Tris-HCl에서 EV 샘플을 희석 할 수 있음)의 총 부피로 유리 바닥 μ 슬라이드 8 웰 플레이트에 친화성 정제 된 전기 를 배치하고 4 ° C에서 밤새 표면에 부착 할 수 있습니다.
- 기존 용액을 8웰 플레이트에서 제거하지 않고, 1x PBS에 4% 파라포름알데히드의 200 μL을 1x PBS에 추가하여 플레이트에 EV를 고정하고 실온21에서30분 동안 배양할 수 있도록 한다.
- EV를 방해하지 않도록 마이크로 피펫으로 파라포름알데히드 및 과도한 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 1x PBS로 EV를 세척하여 과도한 파라포름알데히드를 제거합니다. 세워 절차를 세 번 수행합니다. 초과 1배 PBS를 제거합니다.
- 제조업체의 프로토콜당 이미징 버퍼(파트 B)에서 희석된 5mM 프로토카테주아제 디산소제(파트 A)의 용액을 생성하여 시료당 dSTORM B-cubed 버퍼 용액 250μL를 준비합니다.
참고: 광표백이 발생하면 완충제 내 효소의 농도가 10mM로 두 배가 될 수 있다.- 산화 분자를 청소하기 위해 이미징하기 전에 실온에서 20 분 동안 제조업체의 프로토콜당 각 우물에 준비 된 버퍼 250 μL을 추가하십시오.
참고: EV는 즉시 보거나 최대 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. 모든 시각화 전에 다음 저장소를 교체합니다.
- 산화 분자를 청소하기 위해 이미징하기 전에 실온에서 20 분 동안 제조업체의 프로토콜당 각 우물에 준비 된 버퍼 250 μL을 추가하십시오.
4 직접 적증 광학 재건 현미경 교정
- 분자 생물학 급수에서 0.5%의 농도로 100nm 마이크로스피어를 희석하고 유리 바닥 μ 슬라이드 8웰 플레이트의 각 우물에 200 μL을 배관하여 초해상도 현미경의 보정에 필요한 구슬을 준비한다.
- 구슬이 실온에서 1시간 동안 우물에 정착하도록 허용합니다.
- 기존 용액을 제거하지 않고 PBS에 4% 파라포름알데히드의 200 μL을 교정 비드 솔루션에 각 웰에 추가하고 실온에서 30분 동안 배양할 수 있도록 합니다.
- 조심스럽게 구슬을 방해하지 않도록 마이크로 파이펫으로 파라 포름알데히드를 제거하고 1 배 PBS로 구슬을 세 번 씻으라. 3.4 단계에 따라 버퍼를 준비합니다.
- PBS 1x을 제거하고 각 웰에 준비된 버퍼의 250 μL을 추가합니다. 버퍼가 시각화전에 20분 동안 앉을 수 있도록 허용합니다.
- 무대에 무엇이든 배치하기 전에 현미경 연결 버튼을 사용하여 3D 현미경에 연결하십시오. 목표에 100x 오일을 추가하고 목표 위에 우물의 중심을 배치합니다. 획득 설정에서 473 및 640 nm 난초 레이저를 켜고 보기를클릭합니다.
- 3D 렌즈가 활성화되지 않으면 이미지 표시 옵션의 Photon Counts를 클릭하여 광자 포화 설정 아래에서 구슬을 볼 수 있습니다. 초기 레이저 파워를 473 nm 레이저의 경우 8.4 mW로 설정하고 640 nm 레이저의 경우 11.6 mW로 설정합니다.
- 레이저의 초점을 약 -300 nm 또는 교정 구슬의 초점 평면으로 줄여 개별 구슬의 명확한 해상도를 생성합니다. Z-평면에 초점을 맞추면 레이저 전력 레벨을 조정하여 각 시야의 변동을 고려합니다.
- 계측기 기능하에서 3D 매핑 교정 및 채널 매핑 보정을 완료하여 X축, Y 축 및 Z축에서 오류를 가져옵니다. 최대 FOV 수 20, 대상 포인트 수를 4,000점으로 설정하고 채널 매핑 교정 시 채널 간 최대 거리에서 5.0픽셀로 채널 간 제외 반지름을 설정합니다.
- 교정이 >90%의 포인트 커버리지와 좋은 매핑 품질을 생성하도록 합니다. 향후 이미지 수집을 위해 지정된 교정 데이터를 저장합니다.
5 3차원의 EV 시각화
- 목표에 100x 오일을 추가하고 준비된 EV를 현미경에 넣습니다. 3D 렌즈가 활성화되지 않고, 640 nm 흥분 레이저를 켜고 처음에는 신호및 시야의 강도에 따라 1.2 mW와 12.5 mW 사이로 올려 적막이 염색된 염색 된 EV를 자극한다.
- 이미지 표시 옵션에서 보기 메서드를 광자 채도에서 백분위수로 전환하여 TV를 더 잘 시각화합니다. 레이저 전원을 조정하여 노이즈를 최소화하고 신호를 최대화합니다. 다른 모든 매개 변수를 유지 관리합니다.
- Z축의 위쪽 또는 아래 쪽 아이콘을 클릭하여 Z 평면의 초점을 조정합니다.
참고: Z-평면은 -200~350nm 사이에 초점을 맞추어야 하지만 시야에 따라 다릅니다.
- 노출 시간을 20ms로 설정하고, 프레임 캡처는 10,000프레임으로, 초기 레이저 전력은 1.2mW와 12.5mW 사이로, 또는 5.1 단계에서 결정된 레이저 전력을 신호 및 시야의 강도에 따라 설정한다.
- 아이콘을 사용하여 3D 렌즈를 활성화하고 획득 버튼을 클릭하여 획득을 시작합니다.
- 이미지 수집 전반에 걸쳐 레이저 전력을 1000프레임마다 10개씩 3배 증가하거나 높은 신호 대 잡음 비율을 유지할 수 있습니다. 획득 하는 동안 Z-평면을 조정 하지 마십시오.
참고: 레이저는 최대 90mW 레이저 전력으로 올릴 수 있습니다.
6 인수 후 수정 및 EV 추적
- 이미지 수집 후 보기 분석 창으로 전환합니다. 필터링되지 않은 이미지에서 드리프트 보정을 수행한 다음 필터를 활성화합니다. 표 1에따라 광자 수, 국소화 정밀도, 시그마 및 프레임 인덱스를 조정합니다.
- 시야 및 내보내기 필드에서 개별 EV의 X축을 따라 XYZ 평면 보기 도구를 오버레이합니다. 포토스위칭 이벤트의 CSV 파일입니다.
- Xx x 에서 개별 EV를 X x 별 시야의 비스분시로 정렬된 히스토그램 도구를 사용하여 사진 전환 이벤트를 설정된 거리 그룹으로 비합니다.
- 단일 EV의 이미지를 가져와 파일을 .tiff 저장합니다.
- Z축을 따라 배치에 따라 3D 시각화 도구와 색상을 사용하여 개별 EV의 3D 비디오를 만듭니다.
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Representative Results
이 연구의 목적은 3차원(3차원)으로 나노미터 해상도로 개별 전기를 시각화하는 초해상도 현미경 검사법의 효과를 평가하는 것이었습니다. 개별 EV의 모양과 크기를 분석하기 위해 광전환 가능한 염료를 채택하고 극한빨간색, 막 교화 염료로 전기를 배양하고크로마토그래피(29)를통해 과잉 염료를 제거했습니다. 친화성 캡처 안티 CD81 및 적색 스테인드 전기는 640 nm 흥분 레이저에서 초해상도 현미경으로 볼 수 있었다. Z축(도1A,B)에서XY축상에서 평균 오차 16nm, 38nm의 현미경 보정에 따라 정제된 U2OS EV는 XY축에서 최대 20nm, Z축을 따라 50nm까지의 해상도로 성공적으로 시각화되었다.
레이저 전력이 증가함에 따라 10,000프레임 노출을 통해 dSTORM을 통해 시각화된 개별EV(그림 2A, B). 3-D(도2C,D)에서EV의 명확한 해상도를 허용한 재구성된 이미지의 Z 평면, 광자 수, sigmas 및 국소화 정밀도의 획득 후 이미지 보정. 그림 2C의 EV는 오른쪽 상단 모서리의 전설에서 볼 수 있듯이 처음 7,000 프레임 동안만 전환되었습니다. 이것은 너무 빨리 레이저 전력을 상승에 의해 발생할 수 있습니다 사진 표백의 결과입니다. 히스토그램은 대부분의 포토스위칭 이벤트가 100nm 반경(그림2E)내에서 발생했으며, 시각화된 EV가 엑소좀이고 작은 직경의 EV의 분리가 성공적이었음을 확인한다.
크기 분포 분석은 라인 히스토그램 도구 및 XYZ 평면 보기 도구를 사용하여 다른 개별적으로 추적된 EV에서 수행되어 대부분의 포토스위칭 이벤트가 중심의 100nm 반경 내에서 발생했는지 확인했습니다(그림3A,C),dSTORM의 소형 직경의 전기를 시각화하는 능력을 더욱 검증하였다. 3D 시각화 도구에서 볼 수 있듯이, Z축을 따라 오류가 증가하여 축축을 따라 EV의 길쭉한 최종 이미지를 생성한다(그림3D,비디오 1). 포토스위칭 이벤트는 EV크기(그림 3E)와상관관계가 없으며, dSTORM 기반 특성화가 직경 100nm 미만의 외성 및 소형 봉투 바이러스와 같은 소형 EV에 사용될 수 있음을 입증했습니다.
Z-평면 및 시그마에 대한 올바른 매개 변수는 3-D. 또한, 올바른 노출 시간, 캡처된 프레임 수 및 초기 레이저 레벨이 해결된 멤브레인을 가진 개별 EV의 이미지를 생성하는 데 중요합니다. 현미경을 최적화하고 EV의 최고 해상도 이미지를 캡처하기 위해 사전 및 사후 매개 변수를 모두 설정하는 방법에 대한 추가 조사를 수행해야합니다.
도 1: 100nm 마이크로스피어를 사용하여 3차원의 초해상도 현미경 보정. (A)취득 후 현미경으로 현미경의 보정으로부터 그레이스케일의 시야를 취득후 이미지 보정하였다. 오른쪽 아래의 막대를 조정합니다. (B)XY축 및 Z축의 절대 보정 오류는 각각 채널 매핑 교정 및 3D 매핑 교정을 통해 얻어졌다. N = 10 개의 생물학적 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 단일 EV의 dSTORM 3 차원. (A)CD81+ 친화 정제 된 EV의 보기의 회색 스케일 필드가 사진 전환 가능한 적색 막으로 염색되어 640 nm 흥분 레이저로 흥분. 오른쪽 아래의 막대를 조정합니다. (B)채널 색상에 따라 레이블이 붙은 A로부터의 시야. (C)프레임 인덱스에 따라 레이블이 지정된 A의 화이트 박스의 확대된 뷰에서 단일 EV. 오른쪽 상단의 열 맵은 포토스위칭 이벤트가 기록된 프레임을 나타냅니다. 오른쪽 아래의 막대를 조정합니다. (D)채널 색상에 따라 레이블이 지정된 C의 EV. (E)크기 분포 분석은 D에 표시된 대시 라인에서 EV를 양분하고 라인 히스토그램 도구를 사용하여 15.4 nm 쓰레기통으로 포토스위칭 이벤트를 분리하여 생성하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단일 EV를 3차원으로 획득하는 동안 포토스위칭 이벤트 배포. (A)CD81+ 친화 정제 EV의 재구성 된 이미지는 포토 전환 가능한 적색 막 이염으로 표시되고 640 nm 암분 레이저로 흥분. 오른쪽 아래의 막대를 조정합니다. (B)XY축을 따라 현미경의 라인 히스토그램 도구를 사용하여 얻은 CD81+ 친화 정제 된 전기 의 평균 직경의 상자 및 수염 플롯. (평균 = 104 nm, 표준 편차 = 28 nm). (C)10,000프레임 노출에 걸쳐 기록된 A의 EV XY 치수를 따라 개별 포토스위칭 이벤트의 위치. (D)10,000프레임 노출에 걸쳐 기록된 A의 EVXZ 축을 따라 개별 포토스위칭 이벤트의 위치. (E)다양한 직경의 개별 EV에 기록된 포토스위칭 이벤트 수의 스캐터플롯. R 제곱 값 0.1065는 감지된 포토스위칭 이벤트 수와 EV 직경 간의 상관관계가 없음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 단일 CD81+ 친화성 정제 EV의 3-D 이미지에 포토전환 가능한 적색 멤브레인 염료가 부착되어 640 nm 흥분 레이저로 흥분. 색상 구성표는 Z축을 따라 깊이에 따라 레이블이 지정됩니다. Z축을 따라 오류가 길어졌다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 변수 | 분 | 최대 |
| 광자 수 | 200 | 10,000,000 |
| Z 위치(nm) | -300 | 300 |
| 현지화 정밀도 X(nm) | 0 | 40 |
| 현지화 정밀 Y (nm) | 0 | 40 |
| 정밀 시그마 X (nm) | 0 | 40 |
| 정밀 시그마 Y (nm) | 0 | 40 |
| 시그마 X (nm) (채널 0, 640 nm 레이저) | 100 | 350 |
| 시그마 Y (nm) (채널 0, 640 nm 레이저) | 100 | 350 |
| 시그마 X (nm) (채널 1, 473, 561 nm 레이저) | 100 | 350 |
| 시그마 Y (nm) (채널 1, 473, 561 nm 레이저) | 100 | 350 |
| 프레임 인덱스 | 0 | 10,000 |
표 1: 3D dSTORM 획득 시 초해상도 현미경에 대한 매개 변수입니다.
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Discussion
전기자동차는 많은 세포내 프로세스 및 세포 간 신호1,30에서중요한 역할을 하기 때문에 연구의 인기 영역이 되었다. 그러나, 그들의 시각화는 그들의 작은 크기가 빛 현미경 검사법의 회절 한계 이하로 떨어지기 때문에 어려운 것으로 판명됩니다. 직접 관면 광학 재구성 현미경 검사법(dSTORM)은 시간이 지남에 따라 개별 형광의 광전환 이벤트를 캡처하고 이러한 깜박이는이벤트(21, 31)를기반으로 이미지를 재구성하여 회절 한계를 우회하는 직접적인 시각화 방법입니다. 초분해능 현미경검사는 액틴 필라멘트, 마이크로투블러, 혈장 막에내장된 수용체, 감염된세포32,33,34,35,36과같은 여러 세포 구조에서 성공적으로 수행되었다. 이 연구의 목적은 나노미터 해상도로 3-D로 전기자동차를 시각화하기 위해 초분해능 현미경, 특히 dSTORM의 효능을 평가하는 것이었습니다. 우리는 XY 축및 XY 축의 +/- 50 nm 해상도의 최대 +/- 20 nm 해상도의 dSTORM을 통해 U2OS 셀의 개별 EV를 성공적으로 시각화하기 위해 포토 전환 가능한 멤브레인 상호 확장염을 사용했습니다. 우리의 이전 연구는 다중 세포주 및 1 차체액에서 전기가 NTA와 TEM26,37에의해 분석된 것과 유사한 크기 분포 단면도가 있다는 것을 보여주었습니다. DSTORM 기반의 EV 특성화를 사용하면 이 현상에 대한 신뢰도를 높이고 단일 시야에서 하위 모집단을 식별할 수 있습니다. 이 방법의 추가 구체화가 보증됩니다. dSTORM의 한 가지 주목할 만한 장점은 샘플 준비에 EV의 구조를 변경할 수 있는 가혹하거나 손상된 단계가 필요하지 않다는 것입니다. 우리의 결과는 또한 반대로 CD81 구슬 및 산성 글리신26,37로EV 정화 도중 전기의 생화학적 특성이 유지된다는 것을 보여줍니다. 메탄올 및 에탄올과 같은 다른 고정물로 인한 막 과미빌화를 피하기 위해 파라포름알데히드로 전기를 고정했습니다. 이를 통해 dSTORM이 솔루션에 존재하는 대로 EV의 형태를 정확하게 캡처한다는 결론을 내릴 수 있었습니다. 그러나 카포 코어(700)를 사용하면 알부민 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 오염 물질로부터 규제요건(38)까지효과적으로 전기를 정화하는 데 필요하다. 프로토콜의 한 가지 주목할 만한 제한은 EV와 슬라이드 사이의 바인딩 효율이 100%가 아니므로 샘플 준비 중에 일부 EV가 손실된다는 것입니다. 더 나은 EV를 결합하기 위해 접착제 코팅 슬라이드의 효능에 대한 추가 조사를 수행해야합니다.
시각화를 위한 EV의 준비는 간단하지만, 획득 시 및 특히 인수 후 수정 중 의 파라미터는 EV 및 플루오로포어의 강도와 안정성에 따라 샘플마다 크게 다릅니다. 실험에서 가변성의 한 영역은 신호를 최대화하지만 광표백을 방지하기 위해 노출 전반에 걸쳐 섬세하게 제기되어야 하는 흥분 레이저의 강도입니다. 광표백, 또는 형광이 형광 능력을 상실할 때, 초해상도 현미경검사법(12,39)에걸쳐 상당한 한계이다. 광표백을 방지하기 위해 완충제 내효소의 농도를 10mM로 증가시켜 산화 분자를 더 잘 청소하고 광표백을 방지할 수 있다. 또한, 흥분 레이저 전력을 낮은 초기 수준으로 설정하고 노출 전반에 걸쳐 천천히 높이면 높은 신호를 유지하여 광표백을 방지하는 것이 중요합니다.
우리는 포원 파장, 내구성 및 고정 을 견딜 수있는 능력으로 인해 전기 를 얼룩에 빨간색 광전환 염료를 선택했다29. 그러나, 우리가 선택한 염료는 너무 빨리 또는 강도의 너무 높은 때 초해상도 현미경 검사의 도중 문제를 제시할 수 있습니다. 광전환 가능한 적색 막 염료의 형광은 10,000 프레임 후 또는 레이저 전력이 75.6 mW를 초과한 후 표백할 수 있습니다. 또한, 멤브레인 염료의 강도와 형광 능력은 4°C에서 1주일 동안 보관한 후 실질적으로 감소합니다. 마지막으로, 멤브레인 인터칼링 염료는 수성 용액에서 미셀을 형성하는 것으로 나타났으며, 정제 후에도 EV 샘플에 여전히 존재하는 임의의 과잉 염료는 테트라스판닌과 같은 EV를 식별하는 다른 마커가 없는 경우 EV로 감지및 오인될 수 있다. 추가 조사는 사진 안정성31,40에최적화하기 위해 다른 멤브레인 상호 연관 염료를 사용하여 수행해야합니다. EV에 접합된 형광 항체는 광표백에 더 강한 경향이 있고신호(41)를증폭시킬 수 있기 때문에 더 적합한 옵션이 될 수 있다. 그러나, 항체의 단점은 형광호로부터의 신호가 항체상의 에피토프 및 형광호로부터의 거리로 인해 EV로부터 약간 상쇄된다는 것입니다.
NTA, 유동 세포측정법 또는 EM과 같은 기존 EV 시각화 및 특성화 방법은 손상된 준비 단계가 필요하거나 간접적인 시각화 방법이 될 수 있습니다. dSTORM은 전기 의 자연 생화학적 특성을 보존하는 작은 샘플 준비를 필요로하며, 회절 한계를 우회하고 작은 직경8,9,10,11,12,14, 15,16,17,18,21의전기를 시각화 할 수있는 직접 시각화방법입니다. 26. 초해상도 현미경 검사법의 다른 기술은 자극 방출 고갈 (STED), 방사 디스크 공초점 현미경 검사법 (SDCM), 및 사진 활성화 국소 현미경 검사법 (PALM)42,43과같은 EV 특성화에 최적화 될 수 있습니다. 현재 연구는 dSTORM에만 초점을 맞추고 있지만, 슈퍼 해상도 현미경 검사를 최적화하고 이러한 기술을 비교 / 대조하는 미래의 작업이 보증됩니다. ETV는 최근 바이러스 진행에 그들의 역할이 더 분명해짐에 따라 연구의 인기 영역이되었습니다. 엡스타인 바 바이러스, HIV 및 A형 간염 바이러스와 같은 많은 진화적으로 구별되는 바이러스는, 질병 진행을 촉진하고 신체의 면역 반응을 회피하기 위해 EV 신호 경로를 활용하기 위해 진화했다37,44,45,46,47,48,49,50 . 이들 바이러스는 mRNAs 또는 바이러스 성 단백질과 같은 바이러스 요인을면역 검출6,51,52,53을탈출하면서 감염되지 않은 세포로 이러한 성분을 이전할 수 있는 전기자동차에 통합하는 것으로 나타났다. 이러한 외경 관련 바이러스 인자는 질병진행을위한 바이오마커로서 검출될 수 있고55일수 있다. 따라서, 개별 전기자동차와 이들의 관련 단백질의 dSTORM 기반 시각화는 질병 바이오마커및 아마도 특정 바이러스의 질병 진행을 위한 플랫폼으로서 탐구될 수 있다54,55. 추가 연구는 그것의 막에 EV 및 단백질 내의 두 내용을 시각화에 dSTORM의 유틸리티를 평가 하기 위해 수행 되어야 한다.
결론적으로, 우리는 초해상도 현미경 검사가 나노 미터 해상도를 가진 3-D에서 EV의 시각화를 위한 효과적인 기술으로 여겨져야 한다는 것을 보여주었습니다. dSTORM에서 얻은 결과는 다른 EV 특성화 기술과 일치합니다. DSTORM의 뚜렷한 장점은 탈수 없이 빛의 회절 한계 아래에 있는 입자를 직접 시각화하거나 EV의 생화학적 특성을 바꿀 수 있는 골절 단계를 동결하는 기능입니다.
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Disclosures
M.G..C 선언할 이해 상충이 없습니다. R.P.M 및 D.P.D.는 옥스포드 나노 이미징 (ONI) Inc.와 Cytiva Inc.(이전 GE 헬스케어)로부터 재료 지원을받습니다. R.P.M 및 D.P.D.는 제시된 일부 정보의 상용화 가능성에 대해 경쟁적인 이익을 선언합니다. 이들은 노스 캐롤라이나 대학에 의해 관리됩니다. 자금 출처는이 원고의 해석이나 작성에 관여하지 않았습니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 건설적인 피드백과 지도에 대한 옥스포드 나노 이미징에 감사드립니다. 이 작품은 5UM1CA121947-10에서 R.P.M및 1R01DA040394에서 D.P.D.에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
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