Summary
Direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) bruges til at omgå den typiske diffraktionsgrænse for lysmikroskopi og til at se exosomer på nanometerskalaen. Det kan anvendes i både to og tre dimensioner til at karakterisere exosomer.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (elbiler) frigives af alle celletyper og spiller en vigtig rolle i cellesignalering og homøostase. Visualiseringen af elbiler kræver ofte indirekte metoder på grund af deres lille diameter (40-250 nm), hvilket er under diffraktionsgrænsen for typisk lysmikroskopi. Vi har udviklet en mikroskopibaseret visualisering af elbiler med superopløsning for at omgå diffraktionsgrænsen i både to og tre dimensioner. Ved hjælp af denne tilgang kan vi løse den tredimensionelle form af elbiler til inden for +/- 20 nm opløsning på XY-aksen og +/- 50 nm opløsning langs Z-aksen. Afslutningsvis foreslår vi, at mikroskopi med superopløsning betragtes som en karakteriseringsmetode for elbiler, herunder exosomer, samt indhyllede vira.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er membranbundne vesikler frigivet af alle celletyper. De indeholder lipider, proteiner, metabolitter og nukleinsyrer og overfører disse materialer lokalt mellem celler og distally mellem væv og organer. Der findes tre primære undertyper af elbiler: apoptotiske kroppe, mikrovesicles og exosomer1,2. Her fokuserer vi vores diskussion på exosomer og deres tilhørende proteiner.
Exosomer er udskilles vesikler stammer fra indad spirende af tidlige endosomes i multivesicular body (MVB). MVB smelter derefter sammen med plasmamembranen og frigiver exosomer i det ekstracellulære rum for at rejse til andre celler3,4. Exosomer findes på et spektrum af størrelser fra 40 til 150 nm og er beriget med endosomal transmembrane proteiner kendt som tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membran-bundet endosomal sortering kompleks kræves til transport (ESCRT), og lipid flåde-associerede proteiner1,2,5,6,7.
Karakterisering af exosomers biokemiske sammensætning er blevet et populært område for forskere til bedre at forstå deres funktionelle natur. Mange metoder findes til visualisering og karakterisering af exosomer, herunder nanoskala flowcytometri, nanopartikler tracking analyse (NTA), scanning og transmission elektron mikroskopi (TEM), overflade plasmon resonans, resistiv puls sensing, og traditionelle lysmikroskopi, som hver indeholder iboende fordele og ulemper8,9. TEM og cryo-EM kan opnå nanometerbaseret opløsning, men kræver ofte dehydrerende og frysefrakturtrin og derved krympe eller lysing af elbiler10,11. NTA er afhængig af lysspredning, der giver mulighed for karakterisering af hundredvis af elbiler ad gangen, men er en indirekte måling af partikelstørrelse og kan ikke let skelne mellem elbiler, vira og proteinaggregater12,13,14,15,16. Nanoskala flowcytometri anvender lysspredning fra en excitationssti, som derefter kan oversættes til størrelsesmålinger, men er en ny teknologi, og der er ringe enighed om, hvilken størrelse partikler der er inden for det lineære område af detektion for forskellige instrumenter12,17,18.
Traditionel lysmikroskopi ved hjælp af fluorescerende proteiner eller farvestoffer har været en af de mest anvendte teknikker til visualisering af subcellulære rum, proteinkomplekser og signalmaskineri i en celle. Mens denne teknik viser sig nyttig til at visualisere lokalisering af komplekser, diffraktion grænse for traditionelle lysmikroskopi (ca. 250-400 nm) forhindrer klar opløsning af proteiner eller strukturer i den typiske størrelse rækkevidde af en exosome (40-150 nm)12,19,20.
Super-opløsning mikroskopi, nemlig direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM), adskiller sig fra konventionelle lysmikroskopi ved at anvende photoswitchable egenskaber specifikke fluorophores og opdage disse blinkende begivenheder til at rekonstruere billeder ned til nanometer præcision21. Photoswitching begivenheder indsamles ved hjælp af en høj-framerate detektion kamera i løbet af titusinder af individuelle eksponeringer, og et punkt spredning funktion bruges til at kortlægge med høj tillid den nøjagtige placering af photoswitching fluorophore19,20,22. Dette gør det muligt for dSTORM at omgå diffraktionsgrænsen for lysmikroskopi. Flere grupper har rapporteret brugen af superopløsningsteknikker til visualisering og sporing af exosomer og deres tilknyttede proteiner22,23,24,25. Den endelige opløsning afhænger af fluorophorens biofysiske egenskaber, men varierer ofte fra +/-10-100 nm langs XY-aksen, hvilket giver mulighed for opløsning med enkeltmolekyler.
Evnen til at løse individuelle fluorophorer på denne skala på XY-aksen har revolutioneret mikroskopi. Der er dog kun få data om den tredimensionelle (3D) dSTORM af en exosome. Derfor forsøgte vi at etablere en standardprocedure (SOP) for dSTORM-baseret visualisering og karakterisering af rensede elbiler, herunder exosomer til nanometerpræcision i 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Formering og vedligeholdelse af cellelinjer
- Erhverve human osteosarcoma celler (U2OS) og placere cellerne i vækstmediet suppleret med 10% exosome-fri Foster kvæg Serum og 1x Penicillin / Streptomycin opløsning.
BEMÆRK: Exosome-fri Fosterkvæg Serum blev genereret efter protokollen præsenteret i McNamara et. al.26. - U2OS-cellerne vedligeholdes i en kobberbelagt inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 og passageceller i T175-kolber26,27. Cellerne skal vedligeholdes i midten af logaritmisk vækstfase for at forhindre, at delpopulationer opstår, eller fra ophobning af apoptotiske vragrester i den stationære fase.
2 Exosome isolation og rensning
- Øg U2OS-cellelinjerne til fuldt sammenløb i 10 separate T175-kolber med 50 mL medier pr. kolbe. Celle supernatanten fjernes, og den skal efterfølgende passeres gennem et 0,45 μm og 0,22 μm vakuumfiltreringsapparat.
- Udsætte supernatant til crossflow filtrering (også kendt som tangentiel flow filtrering) på et filtreringssystem udstyret med 750 kDa hule-fiber patron for at fjerne mindre proteiner eller metabolitter28.
- Passage supernatant gennem tangential flow filtrering operatør ved et konstant fremad tryk på 30 psi, samtidig med at et fastholdelsestryk på <20 psi til at producere en Δ tryk på 10 eller flere psi. Placer en magnetisk rørestang i retentate tanken og indstillet til 150 rpm26.
- Foderhastigheden skal holdes på 40 mL/min eller højere. Saml gennemsyret i et reservoir og bortskaffe det.
- Koncentrer supernatanten til 30 mL, og ekvilibrer derefter med fire bind af 1x PBS. Krydsningsfiltreret og ekvilibreret opløsning opsamles i et 50 mL konisk rør.
- Udfælde elbilerne ved 4 °C natten over i en endelig koncentration på 40 mg/mL polyethylenglycol med en molekylvægt på 8.000 Da. Centrifuge elbilerne ved 1.200 x g ved 4 °C i 1 time og genanvendes i 500 μL på 1x PBS.
- Inkuberes elbilerne med 50 μg/mL fotoswitchable rød membran intercalating farvestof og 50 μg/mL af RNase A i 1x PBS ved 4 °C i 1 h.
- Fjern overskydende farvestof gennem en kolonne på et proteinrensningssystem, der er fastgjort til en fraktionsamler. Identificer EV-fraktioner gennem UV-absorbans, og spool dem i et mikrocentrifugerør26.
- Affinitet-vælg i alt 200 μL af elbiler ved hjælp af anti-CD81 magnetiske perler ekvilibreret i 1x PBS.
- Fortynd 100 μL af de anti-CD81 magnetiske perler i 1x PBS til et samlet volumen på 1 mL og lad dem binde ved 4 °C i 2 timer i et 2 mL mikrocentrifugerør med kontinuerlig vuggen.
- Vask anti-CD81 perler og EV tre gange med 1x PBS. Elute CD81+ EV fra opløsningen med 100 mM Glycin ved pH 2,0 i 30 min ved 37 °C.
- Pipette den rensede CD81+ EV i et tilsvarende volumen på 100 mM Tris-HCl ved pH 7,5 i 1x PBS.
BEMÆRK: En aliquot af renset CD81 + EV-opløsning kan reserveres til Nanoparticle Tracking Analysis eller elektronmikroskopi for at bekræfte renheden af opløsningen og tilstedeværelsen af elbil26.
3 Fiksering og forberedelse
- Anbring affinitetsrensede elbiler på glasbundede μ-slide 8-brøndsplader i et samlet volumen på 200 μL (kan fortynde EV-prøven i 100 mM Tris-HCl ved pH 7,5 i 1x PBS) og gøre det muligt at klæbe til overfladen natten over ved 4 °C.
- Uden at fjerne den eksisterende opløsning fra 8-brøndspladen skal du fastgøre elbiler på pladerne ved at tilsætte 200 μL 4% paraformaldehyd i 1x PBS til den EV-holdige opløsning i hver brønd og gøre det muligt at inkubere i 30 min ved stuetemperatur21.
- Fjern forsigtigt paraformaldehyd og overskydende opløsning med en mikropipette for ikke at forstyrre elbilerne. Vask EV med 1x PBS for at fjerne overskydende paraformaldehyd. Udfør vaskeproceduren tre gange. Fjern overskydende 1x PBS.
- Der fremstilles 250 μL dSTORM B-kubikbufferopløsning pr. prøve ved at skabe en opløsning på 5 mM protocatechuat dioxygenase (del A), der fortyndes i billedbuffer (del B) pr. producents protokol.
BEMÆRK: Koncentrationen af enzymet i bufferen kan fordobles til 10 mM, hvis der sker fotobleaching.- Tilsæt 250 μL af den forberedte buffer til hver brønd pr. producents protokol i 20 min ved stuetemperatur før billeddannelse for at skylle oxiderende molekyler.
BEMÆRK: Ev'en kan derefter enten ses med det samme eller opbevares ved 4 °C i op til en uge. Erstat bufferen efter lagring før hver visualisering.
- Tilsæt 250 μL af den forberedte buffer til hver brønd pr. producents protokol i 20 min ved stuetemperatur før billeddannelse for at skylle oxiderende molekyler.
4 Direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi kalibrering
- Forbered de perler, der er nødvendige for kalibrering af superopløsningsmikroskopet ved at fortynde 100 nm mikrosfærer til en koncentration på 0,5% i molekylærbiologisk vand og pipetter 200 μL ind i hver brønd af en glasbund μ-slide 8-brøndsplade.
- Lad perlerne sætte sig i brøndene i 1 time ved stuetemperatur.
- Uden at fjerne den eksisterende opløsning tilsættes 200 μL 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønd til kalibreringsperleopløsningen og gør det muligt at inkubere i 30 min ved stuetemperatur.
- Fjern forsigtigt paraformaldehyd med en mikropipette for ikke at forstyrre perlerne og vask perlerne tre gange med 1x PBS. Forbered bufferen i henhold til trin 3.4.
- Fjern 1x PBS og tilsæt 250 μL af den forberedte buffer til hver brønd. Lad bufferen sidde i 20 minutter før visualisering.
- Før du placerer noget på scenen, skal du oprette forbindelse til 3D-mikroskopet ved hjælp af knappen Tilslut mikroskopet. Tilsæt 100x olie til målet og placere midten af brønden på toppen af målet. I indstillingen Indsending skal du aktivere excitationslaserne på 473 og 640 nm , og klik på Vis.
- Uden 3D-objektivet aktiveret, se perlerne under foton mætning indstilling ved at klikke på Photon Tæller i Billedvisning indstillinger. Indstil de første laserkræfter til 8,4 mW for 473 nm laser og til 11,6 mW for 640 nm laser.
- Reducer fokus for laseren til omkring -300 nm eller kalibreringsperlernes brændplan for at producere en klar opløsning af de enkelte perler. Når Z-flyet er fokuseret, yderligere justere laser effekt niveauer til at tage højde for variation i hvert synsfelt.
- Under instrumentfunktionerne skal du fuldføre 3D-kortlægningskalibrering og kalibrering af kanalkortlægning for at opnå fejlene på X-, Y-og Z-aksen. Angiv det maksimale antal FOV'er til 20, måltallet for punkter til 4.000, den maksimale afstand mellem kanalerne til 5,0 pixel og udelukkelsesradiusen mellem kanaler til 10,0 pixel under kalibrering af kanaltilknytning.
- Sørg for, at kalibreringen giver en pointdækning af >90% og kortlægning kvalitet, der er god. Gem de givne kalibreringsdata til fremtidige billedopkøb.
5 Visualisering af EV i tre dimensioner
- Tilsæt 100x olie på målet og læg de forberedte elbiler i mikroskopet. Uden 3D-objektivet aktiveret, tænde 640 nm excitation laser og i første omgang hæve den til mellem 1,2 mW og 12,5 mW afhængigt af intensiteten af signalet og synsfeltet til at ophidse den røde membran intercalating farvestof farvede elbiler.
- Skift visningsmetoden fra fotonmætning til fraktiler under indstillingerne for billedvisning for bedre at visualisere elbilerne. Juster lasereffekten for at minimere støj, samtidig med at signalet maksimeres. Vedligehold alle de andre parametre.
- Juster Z-flyets fokus ved at klikke på ikonet op eller ned på Z-aksen.
BEMÆRK: Z-flyet skal være fokuseret mellem -200 og -350 nm, men vil variere afhængigt af synsfeltet.
- Indstil eksponeringstiden til 20 ms, rammeoptagelsen til 10.000 billeder og den oprindelige lasereffekt til mellem 1,2 mW og 12,5 mW eller lasereffekten bestemt i trin 5.1, afhængigt af intensiteten af signalet og synsfeltet.
- Aktiver 3D-objektivet ved hjælp af ikonet, og start anskaffelsen ved at klikke på knappen Hent.
- I løbet af billedet erhvervelse, hæve laser magt med 3 trin på 10 hver 1000 billeder, eller nok til at opretholde et højt signal-til-støj-forhold. Juster ikke Z-flyet under erhvervelsen.
BEMÆRK: Laseren kan hæves til maksimalt 90 mW lasereffekt.
6 Ændring efter overtagelsen og sporing af el-oplysninger
- Når billedopsamlingen er overtaget, skal du skifte til visningsvinduet Analyser. Udfør afdriftskorrektion på det ufiltrerede billede, og aktiver derefter filtre. Juster antallet af foton, lokaliseringspræcisionen, sigmas og rammeindekset i henhold til tabel 1.
- Overlejre et XYZ-planvisningsværktøj langs X-aksen for individuelle elbiler fra synsfeltet og eksport . CSV-filer af photoswitching begivenheder.
- Gennemskær individuelle elbiler på XY-aksen i et X by Y-synsfelt ved hjælp af et linje histogramværktøj, som viser fotoswitching-hændelser i indstillede afstandsgrupper.
- Tag billeder af enkelte elbiler, og gem dem som .tiff filer.
- Opret 3D-videoer af individuelle elbiler ved hjælp af et 3D-visualiseringsværktøj og farve i henhold til placering langs Z-aksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne undersøgelse var at evaluere effektiviteten af super-opløsning mikroskopi i visualisering af individuelle elbiler med nanometer opløsning i tre dimensioner (3-D). For at analysere formen og størrelsen af de enkelte elbiler, vi ansat photoswitchable farvestof og inkuberet elbiler med en langt rød, membran intercalating farvestof, og fjernet overskydende farvestof gennem kromatografi29. Den affinitet-fanget anti-CD81 og rød-farvede elbiler blev derefter set i super-opløsning mikroskop under 640 nm excitation laser. Efter kalibreringen af mikroskopet, der producerede en gennemsnitlig fejl på 16 nm på XY-aksen og 38 nm på Z-aksen (Figur 1A, B), blev de rensede U2OS-elbiler med succes visualiseret med en opløsning på op til 20 nm på XY-aksen og 50 nm langs Z-aksen.
Individuelle elbiler visualiseret gennem dSTORM i 3-D photoswitched hele 10.000 ramme eksponering som laser magt blev øget og var let synlige i den erhvervede billede (Tal 2A,B). Post-erhvervelse billede korrektion af Z-plan, foton tæller, sigmas, og lokalisering præcision af det rekonstruerede billede tilladt for klar opløsning af EV i 3-D (Figur 2C, D). EV i Figur 2C photoswitched under kun de første 7.000 billeder, som det ses af legenden i øverste højre hjørne. Dette er et resultat af photobleaching, der kan have været forårsaget af at hæve lasereffekten for hurtigt. Histogrammet bekræfter, at de fleste photoswitching hændelser fandt sted inden for en 100 nm radius (Figur 2E), validere, at den visualiserede EV er en exosome, og at isoleringen af elbiler med en lille diameter var vellykket.
Størrelsesfordelingsanalyse blev udført på andre individuelt sporede elbiler ved hjælp af et linje histogramværktøj og XYZ-planvisningsværktøj for at bekræfte, at de fleste photoswitching-hændelser fandt sted inden for en radius af 100 nm fra midten (Figur 3A, C), hvilket yderligere validerede DSTORM's evne til at visualisere elbiler med en lille diameter. Som det ses af et 3D-visualiseringsværktøj øges fejl langs Z-aksen, hvilket giver et aflangt endeligt billede af EV langs den aksiale akse (Figur 3D, Video 1). Photoswitching-hændelser var ikke korreleret med EV-størrelse (Figur 3E), der viser, at dSTORM-baseret karakterisering kan bruges til små elbiler som exosomer og små indhyllede vira under 100 nm i diameter.
De korrekte parametre for Z-plane og sigma er integreret i membranens korrekte opløsning i 3D. Derudover er den korrekte eksponeringstid, antallet af indtagne rammer og det første laserniveau afgørende for at producere et billede af en individuel EV med en løst membran. Yderligere undersøgelse bør gøres på, hvordan man optimerer mikroskopet og indstille både før og efter erhvervelsen parametre til at fange den højeste opløsning billeder af elbiler.
Figur 1: Kalibrering af mikroskopet med superopløsning i tre dimensioner ved hjælp af 100 nm mikrosfærer. (A) Synsfelt i gråtoner fra kalibrering af mikroskopet med mikrosfærer efter billedkorrektioner efter erhvervelsen. Skalastang nederst til højre. (B) Absolutte kalibreringsfejl på XY-aksen og Z-aksen blev opnået gennem henholdsvis kalibrering af kanalkortlægning og 3D-kortlægning. N = 10 biologiske kopier. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: dSTORM af en enkelt EV i tre dimensioner. (A) Gråtoner synsfelt af CD81+ affinitetsrensede elbiler farves med fotoswitchable rød membran intercalating farvestof og ophidset med 640 nm excitation laser. Skalastang nederst til højre. (B) Synsfelt fra A mærket efter kanalfarve. (C) Enkelt EV fra den zoomede visning af den hvide boks i A, mærket i henhold til rammeindekset. Varmekortet øverst til højre angiver den ramme, hvor photoswitching-hændelserne blev optaget. Skalastang nederst til højre. (D) EV fra C mærket i henhold til kanalfarve. (E) Størrelsesfordelingsanalyse blev oprettet ved at bisecting EV på den stiplede linje vist i D og adskille photoswitching begivenhed i 15,4 nm skraldespande ved hjælp af en linje histogram værktøj. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Distribution af photoswitching begivenheder under erhvervelsen af en enkelt EV i tre dimensioner. (A) Rekonstrueret billede af en CD81 + affinitet-renset EV mærket med photoswitchable rød membran intercalating farvestof og ophidset med 640 nm excitation laser. Skalastang nederst til højre. (B) Kasse og whisker plot af gennemsnitlige diametre af CD81 + affinitet-renset elbiler opnået ved hjælp af mikroskopets Line Histogram Tool langs XY-aksen. (middelværdi = 104 nm, standardafvigelse = 28 nm). (C) Placering af individuelle photoswitching begivenheder langs XY dimensionen af EV i A, optaget i hele 10.000 ramme eksponering. (D) Placering af individuelle photoswitching begivenheder langs XZ-aksen af EV i A, optaget i hele 10.000 ramme eksponering. (E) Scatterplot af antallet af photoswitching begivenheder registreret på de enkelte elbiler af varierende diametre. R-kvadreret værdi på 0,1065 viser ingen sammenhæng mellem antallet af påviste photoswitching begivenheder og EV diameter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: 3D billede af en enkelt CD81 + affinitet-renset EV mærket med photoswitchable rød membran intercalating farvestof og ophidset med 640 nm excitation laser. Farveskemaet er mærket i henhold til dybden langs Z-aksen. Fejl langs Z-aksen er langstrakt. Klik her for at downloade denne video.
| Variabel | Min. | Maks |
| Antal foton | 200 | 10,000,000 |
| Z-position (nm) | -300 | 300 |
| Lokaliseringspræcision X (nm) | 0 | 40 |
| Lokaliseringspræcision Y (nm) | 0 | 40 |
| Precision Sigma X (nm) | 0 | 40 |
| Precision Sigma Y (nm) | 0 | 40 |
| Sigma X (nm) (Kanal 0, 640 nm laser) | 100 | 350 |
| Sigma Y (nm) (Kanal 0, 640 nm laser) | 100 | 350 |
| Sigma X (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lasere) | 100 | 350 |
| Sigma Y (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lasere) | 100 | 350 |
| Rammeindeks | 0 | 10,000 |
Tabel 1: Parametre for mikroskopet med superopløsning under 3D-dSTORM-anskaffelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elbiler er blevet et populært studieområde på grund af deres vigtige rolle i mange intracellulære processer og celle-til-celle signalering1,30. Men deres visualisering viser sig at være vanskeligt, da deres lille størrelse falder under diffraktionsgrænsen for lysmikroskopi. Direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM) er en direkte metode til visualisering, der omgår diffraktion grænse ved at fange photoswitching begivenheder af individuelle fluorophores over tid og rekonstruere et billede baseret på disse blinkende begivenheder21,31. Superopløsningsmikroskopi er blevet udført med succes i 3D på flere cellulære strukturer som actin filamenter, mikrotubuler, receptorer indlejret i plasmamembranen og virale proteiner i inficerede celler32,33,34,35,36. Formålet med denne undersøgelse var at evaluere effekten af super-opløsning mikroskopi, specielt dSTORM, at visualisere elbiler i 3-D med nanometer opløsning. Vi har ansat photoswitchable membran intercalating farvestof til at visualisere individuelle elbiler fra U2OS celler gennem dSTORM i op til +/- 20 nm opløsning på XY-aksen og +/- 50 nm opløsning på Z-aksen. Vores tidligere arbejde har vist, at elbiler fra flere cellelinjer og primære væsker har fordelingsprofiler af samme størrelse som analyseret af NTA og TEM26,37. Brugen af en dSTORM-baseret karakterisering af elbiler kan øge yderligere tillid til dette fænomen samt potentielt identificere delpopulationer inden for et enkelt synsfelt. Yderligere raffinering af denne metode er berettiget. En bemærkelsesværdig fordel ved dSTORM er, at prøveforberedelsen ikke kræver hårde eller skadelige trin, der kan ændre elbilernes struktur. Vores resultater viser yderligere , at elbilers biokemiske karakter opretholdes under EV-rensning med anti-CD81-perler og sur glycin26,37. Vi ordnede elbilerne med paraformaldehyd for at undgå membrangennemsigtsninger forårsaget af andre fiksativer som methanol og ethanol. Dette gjorde det muligt for os at konkludere, at dSTORM nøjagtigt fanger morfologien af elbiler, som de findes i opløsning. Det er imidlertid nødvendigt at anvende Capto Core 700 for at rense elbilerne effektivt væk fra forurenende stoffer som albumin og polyethylenglycol til under lovkrav38. En bemærkelsesværdig begrænsning af protokollen er, at bindingseffektiviteten mellem EV og dias ikke er 100%, så nogle elbiler går tabt under prøveforberedelse. Yderligere undersøgelse bør gøres på effekten af selvklæbende dias til bedre at binde elbiler.
Selv om det er ligetil at udarbejde elbiler til visualisering, varierer parametrene under erhvervelsen og især under ændringer efter erhvervelsen betydeligt fra stikprøve til stikprøve, afhængigt af intensiteten og stabiliteten af elbilerne og fluorophoren. Et område af variation i eksperimentet er intensiteten af excitation lasere, der skal være fint hævet i hele eksponering for at maksimere signalet, men forhindre photobleaching. Photobleaching, eller når en fluorophore mister sin evne til at fluorescere, er en betydelig begrænsning i hele super-opløsning mikroskopi12,39. For at forhindre fotobleaching kan koncentrationen af enzymet i bufferen øges til 10 mM for bedre at skylle oxiderende molekyler og forhindre fotografering. Derudover er det afgørende at indstille excitation laserkraften til et lavt indledende niveau og langsomt hæve den under hele eksponeringen for at opretholde et højt signal for at forhindre fotografering.
Vi valgte et rødt photoswitchable farvestof til at plette elbilerne på grund af dets excitation bølgelængde, holdbarhed og evne til at modstå fiksering29. Men det farvestof, vi valgte, kan præsentere problemer under superopløsningsmikroskopi, når det er ophidset for hurtigt eller for højt af en intensitet. Fluorophores i photoswitchable rød membran farvestof kan photobleach efter 10.000 billeder eller efter laser magt overstiger 75,6 mW. Derudover falder membranfarvens intensitet og evne til fluorescen betydeligt efter en uges opbevaring ved 4 °C. Endelig har membraninterkalerende farvestoffer vist sig at danne micelles i en vandig opløsning, så overskydende farvestof, der stadig findes i EV-prøven efter rensning, kan påvises og forveksles med en EV, hvis der ikke er nogen anden markør til at identificere EV, såsom en tetraspanin. Yderligere undersøgelse bør foretages ved hjælp af andre membran intercalating farvestoffer til at optimere til foto-stabilitet31,40. Fluorescerende antistoffer, der er konjugeret til EV, kan være en mere passende løsning, da de har tendens til at være mere modstandsdygtige over for fotobleaching og kan forstærke signalet41. Ulempen ved antistoffer er imidlertid, at signalet fra fluorophoren er lidt forskudt fra EV på grund af afstanden fra epitopen og fluorophoren på antistoffet.
Eksisterende metoder til EV visualisering og karakterisering, såsom NTA, flow cytometri, eller EM, kan kræve skadelige forberedelse trin eller er indirekte metoder til visualisering. dSTORM kræver lidt prøveforberedelse, bevare den naturlige biokemiske karakter af elbiler, og er en direkte metode til visualisering, der kan omgå diffraktionsgrænsen og visualisere elbiler med en lille diameter8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Andre teknikker til super-opløsning mikroskopi kan optimeres til EV karakterisering såsom stimuleret emission udtømning (STED), spinning disk konfokal mikroskopi (SDCM), og foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM)42,43. Den aktuelle undersøgelse fokuserer udelukkende på dSTORM, men fremtidige arbejde på at optimere super-opløsning mikroskopi og sammenligne / kontrasterende disse teknikker er berettiget. Elbiler er for nylig blevet et populært forskningsområde, da deres rolle i virusudvikling er blevet mere tydelig. Mange evolutionært forskellige vira, såsom Epstein Barr Virus, HIV, og Hepatitis A Virus, har udviklet sig til at drage fordel af EV-signalering veje til at fremme sygdomsprogression og unddrage kroppens immunrespons37,44,45,46,47,48,49,50 . Disse vira har vist sig at inkorporere virale faktorer, såsom mRNAs eller virale proteiner, i elbiler, der derefter kan overføre disse komponenter til ikke-inficerede celler, mens de undslipper immundetektering6,51,52,53. Disse exosomale virale faktorer kan påvises og muligvis anvendes som biomarkør for sygdomsprogression54,55. Derfor kan dSTORM-baseret visualisering af individuelle elbiler og deres tilknyttede proteiner udforskes som en platform for sygdomsbiomarkører og måske sygdomsprogression af visse vira54,55. Yderligere forskning bør gøres for at vurdere dSTORM's nytte i visualisering både indhold i en EV og proteiner på sin membran.
Afslutningsvis har vi vist, at mikroskopi i superopløsning bør betragtes som en effektiv teknik til visualisering af elbiler i 3D med nanometeropløsning. Resultater opnået ved dSTORM er i overensstemmelse med andre EV karakterisering teknikker. En klar fordel ved dSTORM er evnen til direkte at visualisere partikler under diffraktionsgrænsen for lys uden dehydrering eller fryse frakturtrin, der kan ændre den biokemiske karakter af elbiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.G.C. har ingen interessekonflikter at erklære. R.P.M og D.P.D. modtager materialestøtte fra Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. og Cytiva Inc. (tidligere GE Healthcare). R.P.M. og D.P.D. erklærer konkurrerende interesser for en mulig kommercialisering af nogle af de fremlagte oplysninger. Disse forvaltes af University of North Carolina. Finansieringskilderne var ikke involveret i fortolkningerne eller skrivning af dette manuskript.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Oxford Nanoimaging for deres konstruktive feedback og vejledning. Dette arbejde blev finansieret af 5UM1CA121947-10 til R.P.M. og 1R01DA040394 til D.P.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
References
- Pegtel, D. M., Gould, S. J.
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C.
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
- Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
- Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
- Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
- Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
- Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
- Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
- Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
- Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
- Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
- Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
- Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
- McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
- Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
- Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
- Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
- Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
- Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
- Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
- Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
- Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
- Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
- Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
- Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
- Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).
