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Biology

तीन आयामों में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM) का उपयोग प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विशिष्ट विवर्तन सीमा को बाईपास करने और नैनोमीटर पैमाने पर एक्सोसोम्स को देखने के लिए किया जाता है। यह एक्सोसोम्स की विशेषता के लिए दो और तीन दोनों आयामों में नियोजित किया जा सकता है।

Abstract

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी सेल प्रकारों द्वारा जारी किए जाते हैं और सेल सिग्नलिंग और होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ईवीएस के दृश्य के लिए अक्सर उनके छोटे व्यास (40-250 एनएम) के कारण अप्रत्यक्ष तरीकों की आवश्यकता होती है, जो विशिष्ट प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा के नीचे है। हमने दो और तीन आयामों दोनों में विवर्तन सीमा को दरकिनार करने के लिए ईवीएस का एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी-आधारित दृश्य विकसित किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम जेड-एक्सिस के साथ XY-धुरी और +/-50 एनएम संकल्प पर +/-20 एनएम संकल्प के भीतर ईवीएस के त्रि-आयामी आकार को हल कर सकते हैं । अंत में, हम प्रस्ताव करते हैं कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को ईवीएस की लक्षण वर्णन विधि के रूप में माना जाए, जिसमें एक्सोसोम्स के साथ-साथ छा जाने वाले वायरस भी शामिल हैं।

Introduction

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी सेल प्रकारों द्वारा जारी झिल्ली-बाध्य वेसिकल्स हैं। इनमें लिपिड, प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स और न्यूक्लिक एसिड होते हैं और इन सामग्रियों को स्थानीय रूप से कोशिकाओं के बीच और ऊतकों और अंगों के बीच डिस्टली स्थानांतरित करते हैं। ईवीएस के तीन प्राथमिक उपप्रकार हैं: एपोटोटिक निकाय, माइक्रोवेसिकल्स, और एक्सोसोम1,2। यहां, हम एक्सोसोम्स और उसके जुड़े प्रोटीन पर अपनी चर्चा केंद्रित करते हैं।

एक्सोसोम्स को मल्टीवेस्कुलर बॉडी (एमवीबी) में शुरुआती एंडोसोम्स के आवक नवोदित से निकलने वाले वेसिकल्स को स्रावित किया जाता है। एमवीबी तब प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ करता है, जो एक्सोसोम्स को अन्य कोशिकाओं3,4की यात्रा करने के लिए बाह्य अंतरिक्ष में जारी करता है। एक्सोसोम 40 से 150 एनएम तक के आकारों के स्पेक्ट्रम पर मौजूद होते हैं और एंडोसोमल ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन से समृद्ध होते हैं जिसे टेट्रास्पैनिन (सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81), परिवहन (ईएससीआरटी) के लिए आवश्यक झिल्ली-बाध्य एंडोसोमल छंटाई परिसर और लिपिड बेड़ा से जुड़े प्रोटीन1,2,5,6, 7के रूप में जानाजाताहै।

एक्सोसोम्स के बायोकेमिकल मेकअप की विशेषता शोधकर्ताओं के लिए उनके कार्यात्मक स्वभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है । नैनोस्केल फ्लो साइटोमेट्री, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए), स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएमई), सरफेस प्लाजन अनुनाद, प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग और पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी सहित एक्सोसोम्स की कल्पना और विशेषता के लिए कई विधियां मौजूद हैं, जिनमें से प्रत्येक में आंतरिक पेशेवरों और विपक्ष8,9शामिल हैं। TEM और क्रायो-ईएम नैनोमीटर आधारित संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन अक्सर निर्जलीकरण और फ्रीज-फ्रैक्चर चरणों की आवश्यकता होती है, जिससे ईवी10, 11सिकुड़ या lysing होता है। एनटीए प्रकाश बिखरने पर निर्भर करता है, जो एक समय में सैकड़ों ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, लेकिन कणों के आकार का एक अप्रत्यक्ष माप है और आसानी से ईवीएस, वायरस और प्रोटीन के बीच अंतर नहीं कर सकता है12,13, 14,15,16। नैनोस्केल प्रवाह साइटोमेट्री एक उत्तेजन पथ से प्रकाश बिखरने को नियोजित करता है, जिसे तब आकार माप में अनुवादित किया जा सकता है, लेकिन एक उभरती हुई तकनीक है, और विभिन्न उपकरणों12,17,18के लिए पता लगाने की रैखिक सीमा के भीतर कणों का आकार क्याहै,इस पर बहुत कम आम सहमति है।

फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों का उपयोग करके पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक कोशिका के भीतर उपकोशिकीय डिब्बों, प्रोटीन परिसरों और सिग्नलिंग मशीनरी की कल्पना करने के लिए सबसे भारी नियोजित तकनीकों में से एक रही है। हालांकि यह तकनीक परिसरों के स्थानीयकरण की कल्पना करने में उपयोगी साबित होती है, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी (लगभग 250-400 एनएम) की विवर्तन सीमा एक एक्सोसोम (40-150 एनएम)12,19,20की विशिष्ट आकार सीमा में प्रोटीन या संरचनाओं के स्पष्ट समाधान को रोकती है।

सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, अर्थात्, प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM), विशिष्ट फ्लोरोफोरस के फोटोस्विचेबल गुणों को नियोजित करके पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी से खुद को अलग करता है और नैनोमीटर सटीक21के नीचे छवियों को पुनर्निर्मित करने के लिए इन निमिष घटनाओं का पता लगाता है। फोटोस्विचिंग घटनाओं को दसियों हजार व्यक्तिगत एक्सपोजर के दौरान एक उच्च-फ्रेमरेट डिटेक्शन कैमरे का उपयोग करके एकत्र किया जाता है, और एक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन का उपयोगफोटोस्विचिंग फ्लोरोफोर19,20, 22के सटीक स्थान को उच्च आत्मविश्वास के साथ मैप करने के लिए कियाजाताहै। यह dstorm प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बाईपास करने की अनुमति देता है। कई समूहों ने एक्सोसोम्स और 22 ,23 , 24 , 25के विशेषज्ञों और 22,23 , 24,25को कल्पना करने और ट्रैक करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकोंकेउपयोग की सूचना दी है। अंतिम संकल्प फ्लोरोफोर के जैव भौतिक गुणों पर निर्भर करता है, लेकिन अक्सर XY-अक्ष के साथ +/-10-100 एनएम से लेकर होता है, जिससे एकल अणु संकल्प की अनुमति होती है ।

XY-धुरी पर इस पैमाने पर व्यक्तिगत फ्लोरोफोरस को हल करने की क्षमता ने माइक्रोस्कोपी में क्रांति ला दी है। हालांकि, एक एक्सोसोम के त्रि-आयामी (3-डी) dSTORM पर थोड़ा डेटा है। इसलिए, हमने 3-डी में नैनोमीटर परिशुद्धता के लिए एक्सोसोम सहित डीस्टॉर्म-आधारित विज़ुअलाइज़ेशन और शुद्ध ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया (एसओपी) स्थापित करने की मांग की।

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Protocol

1 सेल लाइनों का प्रचार और रखरखाव

  1. मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (U2OS) का अधिग्रहण करें और कोशिकाओं को 10% एक्सोसोम-मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम और 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक विकास माध्यम में रखें।
    नोट: मैकनामारा एट में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद एक्सोसोम-मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम उत्पन्न किया गया था। अल.26.
  2. 5%सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर कॉपर-कोटेड इनक्यूबेटर में यू2ओएस कोशिकाओं को बनाए रखें और T175 फ्लास्क26,27में मार्ग कोशिकाओं। कोशिकाओं को मध्य-लॉगरिथम विकास चरण में बनाए रखा जाना चाहिए ताकि उप-जनसंख्या को उत्पन्न होने से रोका जा सके, या स्थिर चरण के दौरान जनसंख्या मलबे के संचय से।

2 एक्सोसोम अलगाव और शुद्धि

  1. फ्लास्क प्रति मीडिया के 50 एमएल के साथ 10 अलग-अलग T175 फ्लास्क में पूर्ण पूर्ण संकुचन के लिए U2OS सेल लाइनों को बढ़ाएं। सेल सुपरनेट को निकालें और लगातार इसे 0.45 माइक्रोन और 0.22 माइक्रोन वैक्यूम फिल्ट्रेशन उपकरण के माध्यम से पारित करें।
  2. छोटे प्रोटीन या मेटाबोलाइट्स28को हटाने के लिए 750 केडीए खोखले फाइबर कारतूस से लैस एक निस्पंदन प्रणाली पर क्रॉसफ्लो निस्पंदन (जिसे स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन के रूप में भी जाना जाता है) के लिए सुपरनैंट के अधीन है।
    1. 30 साई के निरंतर आगे के दबाव में स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन ऑपरेटर के माध्यम से सुपरनैंट को पारित करना, जबकि 10 या अधिक साई का दबाव पैदा करने के लिए <20 साई का प्रतिधारण दबाव बनाए रखना। रिटेनेट टैंक में एक चुंबकीय हलचल पट्टी रखें और 150 आरपीएम26पर सेट करें।
    2. फीड रेट 40 एमएल/मिनट या उससे अधिक पर बनाए रखें। एक जलाशय में रिस ले लीजिए और इसे निपटाने।
  3. सुपरनेट को 30 एमएल पर केंद्रित करें, और फिर 1x पीबीएस के चार वॉल्यूम के साथ संतुलन बढ़ाएं। 50 एमएल शंकु नली में क्रॉसफ्लो फ़िल्टर और संतुलन समाधान ले लीजिए।
  4. 8,000 डीए के आणविक वजन के साथ 40 मिलीग्राम/एमएल पॉलीथीन ग्लाइकोल की अंतिम एकाग्रता में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ईवीएस को तेज करें। 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,200 x ग्राम पर ईवीएस को अप्सक और 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन में रीसस्पेंड करें।
  5. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS में फोटोस्विचेबल लाल झिल्ली इंटरकैलिंग डाई के 50 μg/mL और 50 μg/mL RNase A के साथ ईवी को इनक्यूबेट करें।
  6. एक अंश कलेक्टर से जुड़ी प्रोटीन शुद्धिकरण प्रणाली पर एक स्तंभ के माध्यम से अतिरिक्त डाई निकालें। यूवी अवशोषण के माध्यम से ईवी अंशों की पहचान करें और उन्हें माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब26में पूल करें ।
  7. एफ़िनिटी- 1x पीबीएस में बराबर एंटी-सीडी 81 चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके ईवीएस के कुल 200 माइक्रोन का चयन करें।
    1. 1x पीबीएस में एंटी-सीडी 81 चुंबकीय मोतियों की 100 माइक्रोल को 1 एमएल की कुल मात्रा में पतला करें और उन्हें निरंतर कमाल के साथ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बांधने की अनुमति दें।
  8. 1x पीबीएस के साथ एंटी-सीडी81 मोतियों और ईवी को तीन बार धोएं। एल्यूट सीडी 81 + ईवी 100 m M ग्लाइसिन के साथ पीएच 2.0 पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  9. 1x पीबीएस में पीएच 7.5 पर 100 एमएम ट्रिस-एचसीएल की बराबर मात्रा में शुद्ध सीडी 81 + ईवी को पिपेट करें।
    नोट: शुद्ध सीडी 81 + ईवी समाधान का एक एलिकोट नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आरक्षित किया जा सकता है ताकि ईवीएस26के समाधान और उपस्थिति की शुद्धता की पुष्टि की जा सके।

3 निर्धारण और तैयारी

  1. 200 माइक्रोन की कुल मात्रा में ग्लास-बॉटम μ-स्लाइड 8-अच्छी प्लेटों पर आत्मीयता-शुद्ध ईवीएस रखें (100 mM Tris-HCl में 1x PBS में पीएच 7.5 पर ईवी नमूना पतला कर सकते हैं) और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सतह का पालन करने की अनुमति दें।
  2. 8-अच्छी प्लेट से मौजूदा समाधान को हटाने के बिना, प्रत्येक कुएं में ईवी-युक्त समाधान में 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 200 माइक्रोन जोड़कर प्लेटों पर ईवीएस को ठीक करें और कमरे के तापमान21पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  3. ईवीएस को परेशान न करने के लिए माइक्रोपिपेट के साथ पैराफॉर्मेल्डिहाइड और अतिरिक्त समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। अतिरिक्त पैराफॉर्मेल्डिहाइड को हटाने के लिए 1x पीबीएस के साथ ईवी धोएं। तीन बार वॉश प्रक्रिया करें। अतिरिक्त 1x पीबीएस निकालें।
  4. इमेजिंग बफर (पार्ट बी) प्रति निर्माता प्रोटोकॉल में पतला 5 एमएमएम प्रोटोएकेटेच (पार्ट ए) का समाधान बनाकर प्रति नमूना dSTORM B-cubed बफर समाधान के 250 μL तैयार करें।
    नोट: यदि फोटोब्लैचिंग होती है तो बफर में एंजाइम की एकाग्रता दोगुनी होकर 10 mm हो सकती है।
    1. ऑक्सीकरण अणुओं को मैला करने के लिए इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से निर्माता के प्रोटोकॉल के लिए तैयार बफर के 250 μL जोड़ें।
      नोट: EV तो या तो तुरंत देखा जा सकता है या एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । हर दृश्य से पहले बफर निम्नलिखित भंडारण को बदलें।

4 डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी कैलिब्रेशन

  1. आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी में 0.5% की एकाग्रता के लिए 100 एनएम माइक्रोस्फीयर को कमजोर करके सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के अंशांकन के लिए आवश्यक मोतियों को तैयार करें और ग्लास-बॉटम μ-स्लाइड 8-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 200 माइक्रोल को पाइपिंग करें।
    1. मोती कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कुओं में बसने के लिए अनुमति दें ।
  2. मौजूदा समाधान को हटाने के बिना, अंशांकन मनका समाधान के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 200 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  3. मोतियों को परेशान न करने और मोतियों को 1x पीबीएस से तीन बार धोने के लिए माइक्रोपिपेट के साथ पैराफॉर्मेल्डिहाइड को सावधानी से हटा दें। चरण 3.4 के अनुसार बफर तैयार करें।
  4. 1x पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार बफर के 250 माइक्रोन जोड़ें। बफर को दृश्य से पहले 20 मिनट तक बैठने की अनुमति दें।
  5. स्टेज पर कुछ भी रखने से पहले कनेक्ट द माइक्रोस्कोप बटन का इस्तेमाल करते हुए 3-डी माइक्रोस्कोप से कनेक्ट करें। उद्देश्य के लिए 100x तेल जोड़ें और उद्देश्य के शीर्ष पर अच्छी तरह से केंद्र जगह है। अधिग्रहण सेटिंग में, 473 और 640 एनएम उत्तेजन लेजर चालू करें और देखेंपर क्लिक करें।
    1. 3-डी लेंस सक्रिय बिना, इमेज डिस्प्ले विकल्पों में फोटॉन काउंट्स पर क्लिक करके फोटॉन संतृप्ति सेटिंग के तहत मोतियों को देखें। 473 एनएम लेजर के लिए 8.4 एमडब्ल्यू और 640 एनएम लेजर के लिए 11.6 मिलियन तक प्रारंभिक लेजर शक्तियां निर्धारित करें।
    2. अलग-अलग मोतियों का स्पष्ट समाधान उत्पन्न करने के लिए लेजर का ध्यान लगभग -300 एनएम या अंशांकन मोतियों के फोकल प्लेन में कम करें। एक बार जेड विमान ध्यान केंद्रित है, आगे देखने के प्रत्येक क्षेत्र में भिन्नता के लिए खाते में लेजर शक्ति के स्तर को समायोजित करें ।
  6. साधन कार्यों के तहत, एक्स-, वाई-और जेड-एक्सिस पर त्रुटियों को प्राप्त करने के लिए 3-डी मैपिंग अंशांकन और चैनल मैपिंग अंशांकन पूरा करें। एफओवी की अधिकतम संख्या 20, अंकों की लक्ष्य संख्या 4,000, चैनल मैपिंग अंशांकन के दौरान चैनलों के बीच अधिकतम दूरी 5.0 पिक्सल और चैनलों के बीच 10.0 पिक्सल तक अपवर्जन त्रिज्या निर्धारित करें।
  7. सुनिश्चित करें कि अंशांकन >90% और मानचित्रण गुणवत्ता का एक बिंदु कवरेज पैदा करता है जो अच्छा है। भविष्य की छवि अधिग्रहण के लिए दिए गए अंशांकन डेटा को सहेजें।

तीन आयामों में ईवी का 5 दृश्य

  1. उद्देश्य पर 100x तेल जोड़ें और माइक्रोस्कोप में तैयार EVs जगह है। 3-डी लेंस सक्रिय बिना, 640 एनएम उत्तेजन लेजर चालू करें और शुरू में लाल झिल्ली इंटरकलेटिंग डाई दाग ईवीएस को उत्तेजित करने के लिए सिग्नल और क्षेत्र को देखने की तीव्रता के आधार पर इसे 1.2 एमडब्ल्यू और 12.5 एमडब्ल्यू के बीच बढ़ाएं।
    1. इमेज डिस्प्ले विकल्पों के तहत, ईवीएस को बेहतर कल्पना करने के लिए फोटॉन संतृप्ति से शतमक में देखने की विधि को स्विच करें। सिग्नल को अधिकतम करते हुए शोर को कम करने के लिए लेजर पावर को समायोजित करें। अन्य सभी मापदंडों को बनाए रखें।
    2. जेड-एक्सिस पर अप या डाउन आइकन पर क्लिक करके जेड-प्लेन का फोकस एडजस्ट करें।
      नोट: जेड-प्लेन -200 और - 350 एनएम के बीच केंद्रित होना चाहिए, लेकिन देखने के क्षेत्र के आधार पर भिन्न होगा।
  2. 20 एमएस के लिए जोखिम समय सेट, 10,000 फ्रेम करने के लिए फ्रेम पर कब्जा है, और 1.2 mW और 12.5 एमडब्ल्यू के बीच प्रारंभिक लेजर शक्ति, या लेजर शक्ति चरण 5.1 में निर्धारित, संकेत और देखने के क्षेत्र की तीव्रता पर निर्भर करता है।
    1. आइकन का उपयोग करके 3-डी लेंस को सक्रिय करें और अधिग्रहण बटन पर क्लिक करके अधिग्रहण शुरू करें।
  3. छवि अधिग्रहण के दौरान, लेजर पावर को 10 हर 1000 फ्रेम की 3 वेतन वृद्धि द्वारा बढ़ाएं, या उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है। अधिग्रहण के दौरान जेड-प्लेन को एडजस्ट न करें।
    नोट: लेजर अधिकतम 90 एमडब्ल्यू लेजर पावर तक उठाया जा सकता है।

6 अधिग्रहण के बाद संशोधन और ईवी ट्रेसिंग

  1. छवि अधिग्रहण के बाद, विश्लेषण देखने खिड़की पर टॉगल। अनफ़िल्टर्ड छवि पर बहाव सुधार करें, और फिर फ़िल्टर को सक्रिय करें। टेबल 1के अनुसार फोटॉन काउंट, लोकलाइजेशन प्रिसिजन, सिग्मास और फ्रेम इंडेक्स को एडजस्ट करें ।
  2. देखने और निर्यात के क्षेत्र से व्यक्तिगत ईवीएस के एक्स-एक्सिस के साथ एक XYZ विमान दृश्य उपकरण ओवरले। फोटोस्विचिंग घटनाओं की सीएसवी फाइलें।
  3. एक लाइन हिस्टोग्राम टूल का उपयोग करके वाई फील्ड ऑफ व्यू द्वारा एक्स में XY-अक्ष पर व्यक्तिगत ईवीएस को विभाजित करने वाले बिंदुओं को निर्धारित दूरी समूहों में साझा करने वाले बिंदुओं को इंगित करते हैं।
  4. एकल ईवीएस की छवियां लें और उन्हें फाइलों के रूप में सहेजें .tiff।
  5. जेड-एक्सिस के साथ प्लेसमेंट के अनुसार 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन टूल और रंग का उपयोग करके व्यक्तिगत ईवीएस के 3-डी वीडियो बनाएं।

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Representative Results

इस अध्ययन का लक्ष्य तीन आयामों (3-डी) में नैनोमीटर संकल्प के साथ व्यक्तिगत ईवीएस की कल्पना करने में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करना था। व्यक्तिगत ईवी के आकार और आकार का विश्लेषण करने के लिए, हमने फोटोस्विचेबल डाई को नियोजित किया और ईवीएस को दूर-लाल, झिल्ली इंटरकैलिटिंग डाई के साथ इनक्यूबेटेड किया, और क्रोमेटोग्राफी29के माध्यम से अतिरिक्त डाई को हटा दिया। आत्मीयता पर कब्जा कर लिया विरोधी CD81 और लाल दाग EVs तो ६४० एनएम उत्तेजन लेजर के तहत सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप में देखा गया । माइक्रोस्कोप के अंशांकन के बाद जिसने XY-धुरी पर 16 एनएम और जेड-एक्सिस(चित्रा 1A,बी)पर 38 एनएम की औसत त्रुटि का उत्पादन किया, शुद्ध U2OS ईवीएस को सफलतापूर्वक XY-अक्ष पर 20 एनएम तक के संकल्प के साथ और जेड-एक्सिस के साथ 50 एनएम तक की कल्पना की गई थी।

व्यक्तिगत ईवीएस 3-डी में dSTORM के माध्यम से कल्पना 10,000 फ्रेम जोखिम भर में फोटोस्विच के रूप में लेजर शक्ति में वृद्धि हुई थी और अधिग्रहीत छवि में आसानी से स्पष्ट थे(आंकड़े 2A, बी). जेड-प्लेन के अधिग्रहण के बाद की छवि सुधार, फोटॉन मायने रखता है, सिग्मास, और 3-डी(चित्रा 2C,D)में EV के स्पष्ट समाधान के लिए अनुमति दी गई पुनर्निर्मित छवि की स्थानीयकरण परिशुद्धता। चित्रा 2C में EV केवल पहले ७,००० फ्रेम के दौरान photoswitched, के रूप में ऊपरी सही कोने में किंवदंती द्वारा देखा । यह फोटोब्लैचिंग का परिणाम है जो लेजर पावर को भी जल्दी बढ़ाने के कारण हो सकता है। हिस्टोग्राम इस बात की पुष्टि करता है कि अधिकांश फोटोस्विचिंग घटनाएं 100 एनएम त्रिज्या(चित्रा 2E)के भीतर हुई, यह मान्य करती हैं कि कल्पना की गई EV एक एक्सोसोम है और एक छोटे व्यास के ईवी का अलगाव सफल रहा।

आकार वितरण विश्लेषण अन्य व्यक्तिगत रूप से पता लगाया ईवीएस पर एक लाइन हिस्टोग्राम टूल और XYZ विमान दृश्य उपकरण का उपयोग करके इस बात की पुष्टि करने के लिए किया गया था कि अधिकांश फोटोस्विचिंग घटनाएं केंद्र के 100 एनएम त्रिज्या(चित्रा 3 ए,सी)के भीतर हुईं, और एक छोटे व्यास के ईवी की कल्पना करने की dSTORM की क्षमता को मान्य करती हैं। जैसा कि 3-डी विज़ुअलाइज़ेशन टूल द्वारा देखा गया है, जेड-एक्सिस के साथ त्रुटि बढ़ जाती है, जो अक्षीय धुरी(चित्रा 3 डी,वीडियो 1)के साथ ईवी की एक लम्बी अंतिम छवि का उत्पादन करती है। फोटोस्विचिंग घटनाओं को ईवी आकार(चित्रा 3E)के साथ सहसंबद्ध नहीं किया गया था, यह प्रदर्शित करता है कि डीस्टॉर्म-आधारित लक्षण वर्णन का उपयोग छोटे ईवीएस जैसे एक्सोसोम्स और व्यास में 100 एनएम से कम छोटे लिफाफे वाले वायरस के लिए किया जा सकता है।

जेड-प्लेन और सिग्मा के लिए सही पैरामीटर 3-डी में झिल्ली के उचित समाधान का अभिन्न अंग हैं। इसके अतिरिक्त, सही एक्सपोजर समय, कैप्चर किए गए फ्रेम की संख्या, और प्रारंभिक लेजर स्तर एक हल झिल्ली के साथ एक व्यक्तिगत ईवी की छवि का उत्पादन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। माइक्रोस्कोप को अनुकूलित करने के तरीके पर आगे की जांच की जानी चाहिए और ईवीएस की उच्चतम रिज़ॉल्यूशन छवियों को कैप्चर करने के लिए पूर्व और अधिग्रहण के बाद दोनों मापदंड निर्धारित किए जाने चाहिए।

Figure 1
चित्र 1:100 एनएम माइक्रोस्फीयर का उपयोग करके तीन आयामों में सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोप का अंशांकन। (A)अधिग्रहण के बाद छवि सुधार के बाद माइक्रोस्फीयर के साथ माइक्रोस्कोप के अंशांकन से ग्रेस्केल में देखने का क्षेत्र। निचले अधिकार में स्केल बार। (ख)XY-धुरी और जेड-एक्सिस पर पूर्ण अंशांकन त्रुटियों को क्रमशः चैनल मैपिंग अंशांकन और 3-डी मैपिंग अंशांकन के माध्यम से प्राप्त किया गया था । N = 10 जैविक प्रतिकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:तीन आयामों में एक ही ईवी का डैस्टॉर्म। (ए)सीडी 81 + आत्मीयता-शुद्ध ईवीएस के दृश्य का ग्रेस्केल क्षेत्र फोटोस्कोटेबल लाल झिल्ली इंटरकैलिटिंग डाई के साथ सना हुआ है और 640 एनएम उत्तेजन लेजर के साथ उत्साहित है। निचले अधिकार में स्केल बार। (ख)चैनल कलर के अनुसार लेबल से देखने का क्षेत्र । (ग)फ्रेम इंडेक्स के अनुसार लेबल किए गए ए में व्हाइट बॉक्स को देखते हुए जूम किए गए से सिंगल ईवी । ऊपरी दाईं ओर गर्मी का नक्शा उस फ्रेम को इंगित करता है जिसमें फोटोस्विचिंग की घटनाएं दर्ज की गई थीं। निचले अधिकार में स्केल बार। (घ)सी से ईवी चैनल कलर के अनुसार लेबल किया गया । (ई)आकार वितरण विश्लेषण डी में दिखाए गए धराशायी लाइन पर ईवी को विभाजित करके और एक लाइन हिस्टोग्राम उपकरण का उपयोग करके फोटोस्विचिंग इवेंट को 15.4 एनएम डिब्बे में अलग करके बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:तीन आयामों में एक ही ईवी के अधिग्रहण के दौरान फोटोस्विचिंग घटनाओं का वितरण। (ए)सीडी 81 + एफ़िनिटी-शुद्ध ईवी की पुनर्निर्मित छवि फोटोस्विचेबल लाल झिल्ली इंटरकैलिटिंग डाई के साथ लेबल और 640 एनएम उत्तेजन लेजर के साथ उत्साहित। निचले अधिकार में स्केल बार। (ख)CD81 + आत्मीयता-शुद्ध ईवीएस के औसत व्यास के बॉक्स और मूंछ की साजिश XY-अक्ष के साथ माइक्रोस्कोप की लाइन हिस्टोग्राम टूल का उपयोग करके प्राप्त की गई । (मतलब = 104 एनएम, मानक विचलन = 28 एनएम)। (ग)ए में EV के XY आयाम के साथ व्यक्तिगत फोटोस्विचिंग घटनाओं का स्थान, 10,000 फ्रेम एक्सपोजर में दर्ज किया गया। (घ)ए में ईवी के एक्सजेड-एक्सिस के साथ व्यक्तिगत फोटोस्विचिंग घटनाओं का स्थान, 10,000 फ्रेम एक्सपोजर में दर्ज किया गया। (ई)अलग-अलग व्यास के व्यक्तिगत ईवीएस पर दर्ज फोटोस्विचिंग घटनाओं की संख्या का स्कैटरप्लॉट। 0.1065 के आर-चुकता मूल्य पता चला फोटोस्विचिंग घटनाओं और EV व्यास की संख्या के बीच कोई संबंध नहीं दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: एक सीडी 81 + आत्मीयता-शुद्ध EV की 3-डी छवि फोटोस्विचीय लाल झिल्ली इंटरकैलिटिंग डाई के साथ लेबल और 640 एनएम उत्तेजन लेजर के साथ उत्साहित है। रंग योजना जेड-एक्सिस के साथ गहराई के अनुसार लेबल है। जेड-एक्सिस के साथ त्रुटि लम्बी है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

परिवर्तनशील मिनट अधिकतम
फोटॉन काउंट 200 10,000,000
जेड-स्थिति (एनएम) -300 300
स्थानीयकरण परिशुद्धता एक्स (एनएम) 0 40
स्थानीयकरण परिशुद्धता वाई (एनएम) 0 40
सटीक सिग्मा एक्स (एनएम) 0 40
सटीक सिग्मा वाई (एनएम) 0 40
सिग्मा एक्स (एनएम) (चैनल 0, 640 एनएम लेजर) 100 350
सिग्मा वाई (एनएम) (चैनल 0, 640 एनएम लेजर) 100 350
सिग्मा एक्स (एनएम) (चैनल 1, 473, 561 एनएम लेजर) 100 350
सिग्मा वाई (एनएम) (चैनल 1, 473, 561 एनएम लेजर) 100 350
फ्रेम इंडेक्स 0 10,000

तालिका 1: 3-डी dSTORM अधिग्रहण के दौरान सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के लिए पैरामीटर।

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Discussion

ईवीएस कई इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं और सेल-टू-सेल सिग्नलिंग1,30में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण अध्ययन का एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है। हालांकि, उनका विज़ुअलाइज़ेशन मुश्किल साबित होता है क्योंकि उनका छोटा आकार प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा से नीचे गिर जाता है। प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM) दृश्य की एक सीधी विधि है जो समय के साथ व्यक्तिगत फ्लोरोफोरस की फोटोस्विचिंग घटनाओं पर कब्जा करके और इन निमिष घटनाओं के आधार पर एक छवि का पुनर्निर्माण करके विवर्तन सीमा को नजरअंदाज करती है21,31। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को कई सेलुलर संरचनाओं जैसे ऐक्टिन फिलामेंट्स, माइक्रोट्यूबुल्स, प्लाज्मा झिल्ली में एम्बेडेड रिसेप्टर्स, और वायरलप्रोटीन संक्रमित कोशिकाओं32, 33, 34,35,36पर सफलतापूर्वक किया गया है। इस अध्ययन का उद्देश्य नैनोमीटर संकल्प के साथ 3-डी में ईवीएस की कल्पना करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, विशेष रूप से डैस्टॉर्म की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना था। हमने जेड-एक्सिस पर एक्सवाई-एक्सिस और +/-50 एनएम रिज़ॉल्यूशन पर 20 एनएम रिज़ॉल्यूशन तक के लिए DSTORM के माध्यम से U2OS कोशिकाओं से व्यक्तिगत ईवी को सफलतापूर्वक कल्पना करने के लिए फोटोस्विचेबल झिल्ली इंटरकैलिटिंग डाई को नियोजित किया। हमारे पिछले कार्य से पता चला है कि कई सेल लाइनों और प्राथमिक तरल पदार्थों से ईवीएस में एनटीए और TEM26,37द्वारा विश्लेषण किए गए समान आकार के वितरण प्रोफाइल हैं। ईवीएस के एक dSTORM आधारित लक्षण वर्णन का उपयोग इस घटना के लिए और अधिक विश्वास जोड़ सकते हैं, साथ ही संभावित रूप से देखने के एक क्षेत्र में उपजनसंख्या की पहचान । इस विधि का और शोधन आवश्यक है। dSTORM के लिए एक उल्लेखनीय लाभ यह है कि नमूना तैयारी कठोर या हानिकारक कदम है कि EVs की संरचना को बदल सकते है की आवश्यकता नहीं है । हमारे परिणाम आगे प्रदर्शित करते हैं कि ईवी शुद्धिकरण के दौरान ईवीवी की जैव रासायनिक प्रकृति को एंटी-सीडी 81 मोतियों और अम्लीय ग्लाइसिन26,37के साथ बनाए रखा जाता है। हमने मेथनॉल और इथेनॉल जैसे अन्य फिक्सेटिव्स के कारण झिल्ली परमेबिलाइजेशन से बचने के लिए पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ ईवीएस को तय किया। इससे हमें यह निष्कर्ष निकालने की अनुमति मिली कि dSTORM सटीक रूप से ईवीएस की आकृति विज्ञान को कैप्चर करता है क्योंकि वे समाधान में मौजूद हैं। हालांकि, कैप्टो कोर 700 का उपयोग आवश्यक है, हालांकि, ईवीएस को प्रभावी ढंग से सुम्मलिन और पॉलीथीन ग्लाइकोल जैसे संदूषकों से दूर करने के लिए नियामक आवश्यकताओं38से नीचे तक। प्रोटोकॉल की एक उल्लेखनीय सीमा यह है कि ईवी और स्लाइड के बीच बाध्यकारी दक्षता 100% नहीं है, इसलिए नमूना तैयारी के दौरान कुछ ईवीएस खो जाते हैं। ईवीएस को बेहतर तरह बांधने के लिए चिपकने वाली-लेपित स्लाइड्स की प्रभावकारिता पर आगे की जांच की जानी चाहिए।

जबकि दृश्य के लिए ईवीएस की तैयारी सीधी है, अधिग्रहण के दौरान और विशेष रूप से अधिग्रहण के बाद संशोधनों के दौरान पैरामीटर ईवीएस और फ्लोरोफोर की तीव्रता और स्थिरता के आधार पर नमूने से नमूना तक काफी भिन्न होते हैं। प्रयोग में परिवर्तनशीलता का एक क्षेत्र उत्तेजन लेजर की तीव्रता है जिसे सिग्नल को अधिकतम करने के लिए पूरे एक्सपोजर में नाजुक रूप से उठाया जाना चाहिए लेकिन फोटोब्लेचिंग को रोकना चाहिए। फोटोब्लेचिंग, या जब फ्लोरोफोर फ्लोरोस की क्षमता खो देता है, तो सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी12,39में एक महत्वपूर्ण सीमा है। फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए, बफर में एंजाइम की एकाग्रता को 10 m m तक बढ़ाया जा सकता है ताकि ऑक्सीकरण अणुओं को बेहतर तरह से स्कैवेंशन किया जा सके और फोटोब्लैचिंग को रोका जा सके। इसके अतिरिक्त, एक कम प्रारंभिक स्तर पर उत्तेजन लेजर शक्ति की स्थापना और धीरे-धीरे इसे पूरे एक्सपोजर में बढ़ाने के लिए एक उच्च संकेत बनाए रखने के लिए फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।

हमने अपनी उत्तेजन तरंगदैर्ध्य, स्थायित्व और निर्धारण29का सामना करने की क्षमता के कारण ईवीएस को दाग देने के लिए एक लाल फोटोस्विचेबल डाई चुना। हालांकि, डाई हमने चुना सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के दौरान मुद्दों को पेश कर सकते है जब बहुत जल्दी उत्साहित या एक तीव्रता के बहुत अधिक पर । फोटोस्विचेबल लाल झिल्ली डाई में फ्लोरोफोरस 10,000 फ्रेम के बाद या लेजर पावर 75.6 एमडब्ल्यू से अधिक होने के बाद फोटोब्लैक कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, झिल्ली डाई की तीव्रता और फ्लोरोसे की क्षमता 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के एक सप्ताह के बाद काफी कम हो जाती है। अंत में, झिल्ली इंटरकैलिंग रंगों को एक जलीय समाधान में माइकेल बनाने के लिए दिखाया गया है, इसलिए शुद्धिकरण के बाद ईवी नमूने में अभी भी मौजूद किसी भी अतिरिक्त डाई का पता लगाया जा सकता है और ईवी के लिए गलत हो सकता है यदि ईवी की पहचान करने के लिए कोई अन्य मार्कर नहीं है, जैसे कि टेट्रास्पैनिन। फोटो-स्थिरता 31,40के लिए अनुकूलित करने के लिए अन्य झिल्ली इंटरकैलिटिंग रंगों का उपयोग करके आगे की जांच की जानी चाहिए। ईवी के लिए संयोजित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी एक अधिक उपयुक्त विकल्प हो सकता है क्योंकि वे फोटोब्लैचिंग के लिए अधिक प्रतिरोधी होते हैं और सिग्नल41को बढ़ा सकते हैं। हालांकि, एंटीबॉडी की कमी यह है कि फ्लोरोफोर से संकेत एंटीबॉडी पर एपिटोप और फ्लोरोफोर से दूरी के कारण ईवी से थोड़ा ऑफसेट होता है।

एनटीए, फ्लो साइटोमेट्री या ईएम जैसे ईवी विज़ुअलाइज़ेशन और लक्षण वर्णन के मौजूदा तरीकों को हानिकारक तैयारी चरणों की आवश्यकता हो सकती है या दृश्य के अप्रत्यक्ष तरीके हैं। dSTORM को ईवीएस की प्राकृतिक जैव रासायनिक प्रकृति को संरक्षित करते हुए थोड़ा नमूना तैयार करने की आवश्यकता होती है, और दृश्यीकरण की एक सीधी विधि है जो विवर्तन सीमा को दरकिनार कर सकती है और एकछोटे व्यास8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,21,के ईवी को कम कर सकतीहै। 26. सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी की अन्य तकनीकों को ईवी लक्षण वर्णन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे उत्तेजित उत्सर्जन कमी (एसटीडी), स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (एसडीसीएम), और फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम)42,43। वर्तमान अध्ययन विशेष रूप से dSTORM पर केंद्रित है, लेकिन सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी अनुकूलन और तुलना/इन तकनीकों विषम पर भविष्य के काम की आवश्यकता है । EVs हाल ही में अनुसंधान का एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है के रूप में वायरस प्रगति में उनकी भूमिका अधिक स्पष्ट हो गया है । एपस्टीन बर्र वायरस, एचआईवी और हेपेटाइटिस ए वायरस जैसे कई विकासवादी अलग वायरस रोग की प्रगति को बढ़ावा देने और शरीर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया37,44, 45, 46, 47,48,49,50 से बचने के लिए ईवी-सिग्नलिंग रास्तों का लाभ उठाने के लिए विकसित हुएहैं। . इन वायरसों को वायरल कारकों, जैसे कि एमआरएएनए या वायरल प्रोटीन को ईवीएस में शामिल करने के लिए दिखाया गया है जो प्रतिरक्षा का पता लगाने से बचने के दौरान इन घटकों को असंक्रमित कोशिकाओं में स्थानांतरित कर सकते हैं, जबकि प्रतिरक्षा का पता6,51,52,53। इन एक्सोसोमल से जुड़े वायरल कारकों का पता लगाया जा सकता है और संभवतः रोग प्रगति54,55के लिए बायोमार्कर के रूप में कार्यरत हैं। इसलिए, व्यक्तिगत ईवीएस और उसके संबद्ध प्रोटीन के dSTORM आधारित दृश्य रोग बायोमार्कर के लिए एक मंच के रूप में पता लगाया जा सकता है और, शायद, कुछ वायरस54,55की रोग प्रगति। इसके अलावा अनुसंधान के लिए एक EV और अपनी झिल्ली पर प्रोटीन के भीतर दोनों सामग्री की कल्पना में dSTORM उपयोगिता का आकलन किया जाना चाहिए ।

अंत में, हमने दिखा दिया है कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को नैनोमीटर संकल्प के साथ 3-डी में ईवीएस के दृश्य के लिए एक प्रभावी तकनीक माना जाना चाहिए। DSTORM द्वारा प्राप्त परिणाम अन्य ईवी विशेषता तकनीकों के अनुरूप हैं। dSTORM का एक अलग लाभ सीधे निर्जलीकरण या फ्रीज फ्रैक्चर कदम है कि EVs की जैव रासायनिक प्रकृति को बदल सकते है बिना प्रकाश की विवर्तन सीमा के नीचे कणों कल्पना करने की क्षमता है ।

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Disclosures

एम.जी. .C की घोषणा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है । आर.पी. .M और डी.पी.डी. ऑक्सफोर्ड नैनोइमेजिंग (ओनआई) इंक और साइटिवा इंक (पूर्व में जीई हेल्थकेयर) से सामग्री समर्थन प्राप्त करते हैं। आर.पी. .M और डी.पी.डी. प्रस्तुत की गई कुछ सूचनाओं के संभावित व्यावसायीकरण के लिए प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं। इनका प्रबंधन यूनिवर्सिटी ऑफ नॉर्थ कैरोलिना द्वारा किया जाता है । धन स्रोत इस पांडुलिपि की व्याख्याओं या लेखन में शामिल नहीं थे ।

Acknowledgments

हम ऑक्सफोर्ड नैनोइमेजिंग को उनकी रचनात्मक प्रतिक्रिया और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस कार्य को 5UM1CA121947-10 से आर.पी. .M और 1R01DA040394 से डी.पी.डी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

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जीव विज्ञान अंक 174
तीन आयामों में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी
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Chambers, M. G., McNamara, R. P.,… More

Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

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