Summary
Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV' ler) tüm hücre tipleri tarafından salınır ve hücre sinyalizasyonu ve homeostazda önemli bir rol oynar. EV'lerin görselleştirilmesi genellikle tipik ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altında olan küçük çapları (40-250 nm) nedeniyle dolaylı yöntemler gerektirir. Kırınım sınırını hem iki hem de üç boyutta atlamak için EV'lerin süper çözünürlüklü mikroskopi tabanlı bir görselleştirmesini geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, EV'lerin üç boyutlu şeklini XY ekseninde +/- 20 nm çözünürlüğe ve Z ekseni boyunca +/- 50 nm çözünürlüğe çözebiliriz. Sonuç olarak, süper çözünürlüklü mikroskopinin, ekzozomlar ve zarflı virüsler de dahil olmak üzere EV'lerin bir karakterizasyon yöntemi olarak kabul edilmesini öneriyoruz.
Introduction
Hücre dışı veziklinler (EV' ler) tüm hücre tipleri tarafından salınan membran bağlı veziküllerdir. Lipitler, proteinler, metabolitler ve nükleik asitler içerirler ve bu malzemeleri hücreler arasında lokal olarak ve dokular ve organlar arasında distal olarak aktarırlar. EV'lerin üç ana alt tipi vardır: apoptotik cisimler, mikrovesiküller ve ekzozomlar1,2. Burada, tartışmamızı eksozomlara ve ilişkili proteinlerine odaklıyoruz.
Ekzozomlar, erken endozomların çokvesiküler vücuda (MVB) içe doğru tomurcuklanmasından kaynaklanan veziküller salgılanır. MVB daha sonra plazma zarı ile kaynaşır ve eksozomları hücre dışı alana serbest bırakarak diğer hücrelere3,4. Ekzozomlar 40 ila 150 nm arasında değişen boyutlarda bulunur ve tetraspaninler (CD9, CD63, CD81), taşıma için gerekli olan membran bağlı endosomal sıralama kompleksi (ESCRT) ve lipid sal ile ilişkili proteinler 1,2 ,5,6,7olarak bilinen endosomal transmembran proteinleri ile zenginleştirilir.
Eksozomların biyokimyasal makyajını karakterize etmek, araştırmacıların işlevsel doğalarını daha iyi anlamaları için popüler bir alan haline gelmiştir. Nano ölçekli akış sitometrisi, nanopartikül izleme analizi (NTA), tarama ve iletim elektron mikroskopisi (TEM), yüzey plazmon rezonansı, dirençli darbe algılama ve her biri8,9eksileri içeren geleneksel ışık mikroskopisi dahil olmak üzere eksozomları görselleştirmek ve karakterize etmek için birçok yöntem mevcuttur. TEM ve kriyo-EM nanometre tabanlı çözünürlük elde edebilir, ancak genellikle susuz bırakma ve donma-kırılma adımları gerektirir, böylece 10,11 EV'leriküçültür veya yutabilir. NTA, aynı anda yüzlerce EV'nin karakterizasyonuna izin vererek ışık saçılımlarına dayanır, ancak parçacık boyutunun dolaylı bir ölçümüdür ve EV'ler, virüsler ve protein agregaları arasında kolayca ayırt edemez12 , 13,14,15,16. Nano ölçekli akış sitometrisi, daha sonra boyut ölçümlerine çevrilebilen bir heyecan yolundan ışık saçılımını istihdam eder, ancak gelişmekte olan bir teknolojidir ve çeşitli aletler için doğrusal algılama aralığında parçacıkların boyutu hakkında çok az fikir birliği vardır12,17,18.
Floresan proteinler veya boyalar kullanılarak geleneksel ışık mikroskopisi, hücre altı bölmeleri, protein komplekslerini ve bir hücre içindeki sinyal makinelerini görselleştirmek için en yoğun kullanılan tekniklerden biri olmuştur. Bu teknik komplekslerin lokalizasyonunu görselleştirmede yararlı olsa da, geleneksel ışık mikroskopisinin kırınım sınırı (yaklaşık 250-400 nm), bir ekzozom (40-150 nm) 12,19,20'nin tipik boyut aralığındaki proteinlerin veya yapıların net çözünürlüğünü önler.
Süper çözünürlüklü mikroskopi, yani doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), belirli floroforların fotowitchable özelliklerini kullanarak ve görüntüleri nanometre hassasiyeti21'ekadar yeniden oluşturmak için bu yanıp sönen olayları algılayarak geleneksel ışık mikroskopisinden kendini ayırır. Photoswitching olayları, on binlerce bireysel pozlama boyunca yüksek kare hızında algılama kamerası kullanılarak toplanır ve fotoğraf çekme floroforunun tam konumunu yüksek güvenle haritalamak için bir nokta yayma işlevi kullanılır19,20,22. Bu, dSTORM'un ışık mikroskopisinin kırınım sınırını atlamasına izin verir. Çeşitli gruplar, eksozomları ve ilişkili proteinleri22 , 23 , 24,25'igörselleştirmek ve izlemek için süper çözünürlüklü tekniklerin kullanıldığını bildirmektedir. Son çözünürlük floroforun biyofiziksel özelliklerine bağlıdır, ancak genellikle XY ekseni boyunca +/-10-100 nm arasında değişerek tek moleküllü çözünürlüğe izin verir.
XY ekseninde bu ölçekte bireysel floroforları çözme yeteneği mikroskopide devrim yaratmamıştır. Ancak, bir eksozom üç boyutlu (3-B) dSTORM hakkında çok az veri vardır. Bu nedenle, 3 boyutlu nanometre hassasiyetine ekozomlar da dahil olmak üzere saflaştırılmış EV'lerin dSTORM tabanlı görselleştirilmesi ve karakterizasyonu için standart bir işletim prosedürü (SÇP) oluşturmaya çalıştık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Hücre hatlarının yayılması ve bakımı
- İnsan osteosarkom hücreleri (U2OS) alıp hücreleri %10 eksozom içermeyen Fetal Sığır Serumu ve 1x Penisilin/Streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş büyüme ortamına yerleştirin.
NOT: McNamara et'te sunulan protokol sonrasında ekzozomsuz Fetal Sığır Serumu üretildi. al.26. - U2OS hücrelerini % 5CO 2'de 37 °C'de bakır kaplı bir inkübatörde ve T175 şişelerinde geçiş hücrelerinde26,27'desakla. Hücreler, subpopulasyonların ortaya çıkmasını önlemek için orta logaritmik büyüme aşamasında veya sabit faz sırasında apoptotik kalıntıların birikmesinden korunmalıdır.
2 Eksozom izolasyonu ve saflaştırma
- Şişe başına 50 mL ortam ile 10 ayrı T175 şişesinde U2OS hücre hatlarını tam izdiah eder. Hücre üstnatantı çıkarın ve art arda 0,45 μm ve 0,22 μm vakum filtrasyon aparatına geçirin.
- Daha küçük proteinleri veya metabolitleri kaldırmak için 750 kDa içi boş lif kartuşu ile donatılmış bir filtrasyon sisteminde çapraz akış filtrasyonuna(teğetsel akış filtrasyonu olarak da bilinir) maruz kalın.
- 10 veya daha fazla psi Δ basıncı üretmek için 20 psi < tutma basıncını korurken, süpernatantı teğet akış filtrasyon operatöründen 30 psi sabit ileri basınçta geçirin. Retentate tankına manyetik bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve 150 rpm26olarak ayarlayın.
- Besleme hızını 40 mL/dk veya daha yüksekte koruyun. Geçirgenliği bir rezervuarda toplayın ve atın.
- Süpernatant'ı 30 mL'ye konsantre edin ve ardından dört adet 1x PBS hacmi ile dengeyi sağlar. Çapraz akış filtreli ve eşkenel çözeltiyi 50 mL konik bir tüpte toplayın.
- EV'leri 4 °C'de bir gecede 40 mg/mL polietilen glikolün son konsantrasyonunda 8.000 Da moleküler ağırlığa sahip çökeltici 1.200 x g'da 1 saat boyunca 4 °C'de santrifüj ve 1x PBS'nin 500 μL'sinde resüspend.
- EV'leri 50 μg/mL fotoğraf büyülenebilir kırmızı membran aralayıcı boya ve 1 saat boyunca 4 °C'de 1x PBS'de 50 μg/mL RNase A ile kuluçkaya yatırın.
- Fraksiyon toplayıcıya bağlı bir protein arıtma sistemindeki bir sütundan fazla boyayı çıkarın. UV absorbansı ile EV fraksiyonlarını tanımlayın ve bir mikrosantrifüj tüpü26içine birleşin.
- Benzeşim- 1x PBS'de eşleştirilmiş anti-CD81 manyetik boncuklar kullanarak toplam 200 μL EV seçin.
- Anti-CD81 manyetik boncukların 100 μL'sini 1x PBS'de toplam 1 mL hacme seyreltin ve sürekli sallanan 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 2 saat boyunca 4 °C'de bağlanmalarını sağlar.
- Anti-CD81 boncukları ve EV'yi 1x PBS ile üç kez yıkayın. 37 °C'de 30 dakika boyunca pH 2.0'da 100 mM Glisin ile çözeltiden Elute CD81+ EV.
- Pipet saflaştırılmış CD81+ EV, 1x PBS'de pH 7.5'te 100 mM Tris-HCl eşit hacimde.
NOT:26EV'lerin çözeltisinin saflığını ve varlığını doğrulamak için Nanopartikül Takip Analizi veya elektron mikroskopisi için saflaştırılmış CD81+ EV çözeltisi aliquot rezerve edilebilir.
3 Fiksasyon ve hazırlık
- Benzeşimli EV'leri cam tabanlı μ-slide 8 kuyu plakalarına toplam 200 μL hacimde yerleştirin (EV örneğini pH 7,5'te 1x PBS'de 100 mM Tris-HCl'de seyreltebilir) ve 4 °C'de bir gecede yüzeye yapışmaya izin verin.
- Mevcut çözeltiyi 8 kuyulu plakadan çıkarmadan, her kuyudaki EV içeren çözeltiye 1x PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit ekleyerek EV'leri plakalara sabitlayın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin21.
- EV'leri rahatsız etmemek için paraformaldehit ve fazla çözeltiyi bir mikropipette dikkatlice çıkarın. Fazla paraformaldehit gidermek için EV'yi 1x PBS ile yıkayın. Yıkama prosedürünü üç kez gerçekleştirin. Fazla 1x PBS'yi çıkarın.
- Üretici protokolü başına görüntüleme tamponunda (Bölüm B) seyreltilmiş 5 mM protocatechuate dioksijenaz (Bölüm A) çözeltisi oluşturarak numune başına 250 μL dSTORM B küplü tampon çözeltisi hazırlayın.
NOT: Fotobleaching meydana gelirse, tampondaki enzimin konsantrasyonu iki katına çıkarılarak 10 mM'ye çıkarılabilir.- Oksitleyici molekülleri atmadan önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üretici protokolü başına her kuyuya 250 μL hazırlanan tampon ekleyin.
NOT: EV daha sonra hemen görüntülenebilir veya bir haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir. Her görselleştirmeden önce depolamayı izleyen arabelleği değiştirin.
- Oksitleyici molekülleri atmadan önce oda sıcaklığında 20 dakika boyunca üretici protokolü başına her kuyuya 250 μL hazırlanan tampon ekleyin.
4 Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopi kalibrasyonu
- 100 nm mikrokürecikleri moleküler biyoloji sınıfı suda % 0,5 konsantrasyona seyrelterek ve cam tabanlı μ slaytlı 8 kuyu plakasının her kuyusuna 200 μL pipetle vurarak süper çözünürlüklü mikroskobun kalibrasyonu için gerekli boncukları hazırlayın.
- Boncukların oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuyulara yerleşmesine izin verin.
- Mevcut çözeltiyi çıkarmadan, kalibrasyon boncuk çözeltisine her kuyuya PBS'de 200 μL% 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatmaya izin verin.
- Boncukları rahatsız etmemek için paraformaldehiti bir mikropipetle dikkatlice çıkarın ve boncukları 1x PBS ile üç kez yıkayın. Arabelleği adım 3.4'e göre hazırlayın.
- 1x PBS'yi çıkarın ve hazırlanan tamponun 250 μL'lik kısmını her kuyuya ekleyin. Görselleştirmeden önce arabelleğin 20 dakika oturmasına izin verin.
- Sahne alanına herhangi bir şey yerleştirmeden önce, Mikroskobu Bağla düğmesini kullanarak 3-B mikroskopa bağlanın. Hedefe 100x yağ ekleyin ve kuyunun merkezini hedefin üzerine yerleştirin. Edin ayarında, 473 ve 640 nm heyecan lazerlerini açın ve Görüntüle 'yetıklayın.
- 3-B lens etkinleştirilmeden, Görüntü Görüntüleme seçeneklerinde Foton Sayıları'na tıklayarak foton doygunluğu ayarının altındaki boncukları görüntüleyin. İlk lazer güçlerini 473 nm lazer için 8,4 mW'a ve 640 nm lazer için 11,6 mW'a ayarlayın.
- Lazerin odağını yaklaşık -300 nm'ye veya kalibrasyon boncuklarının odak düzlemine düşürerek tek tek boncukların net bir çözünürlüğünü üretin. Z düzlemi odaklandıktan sonra, lazer güç seviyelerini her görüş alanındaki varyasyonu hesaba katacak şekilde daha fazla ayarlayın.
- Cihaz işlevleri altında, X, Y ve Z eksenindeki hataları elde etmek için 3-B haritalama kalibrasyonunu ve kanal haritalama kalibrasyonunu tamamlayın. Kanal eşleme kalibrasyonu sırasında en fazla EV sayısını 20'ye, hedef nokta sayısını 4.000'e, kanallar arasındaki maksimum mesafeyi 5,0 piksele ve kanallar arasındaki dışlama yarıçapını 10,0 piksele ayarlayın.
- Kalibrasyonun %90'> bir nokta kapsama alanı ve iyi bir haritalama kalitesi ürettiğinden emin olun. Verilen kalibrasyon verilerini gelecekteki görüntü alımları için kaydedin.
5 EV'nin üç boyutta görselleştirilmesi
- Hedefe 100x yağ ekleyin ve hazırlanan EV'leri mikroskopa yerleştirin. 3-B lens etkinleştirilmeden, 640 nm uyarlama lazerini açın ve kırmızı membran intercalating boya boyalı EV'leri heyecanlandırmak için sinyalin ve görüş alanının yoğunluğuna bağlı olarak başlangıçta 1,2 mW ile 12,5 mW arasında yükseltin.
- Görüntü Görüntüleme seçenekleri altında, EV'leri daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yöntemini foton doygunluğundan yüzdelik dilimlere geçirin. Sinyali en üst düzeye çıkarırken gürültüyü en aza indirmek için lazer gücünü ayarlayın. Diğer tüm parametreleri koruyun.
- Z eksenindeki yukarı veya aşağı simgesini tıklatarak Z düzleminin odağını ayarlayın.
NOT: Z düzlemi -200 ile -350 nm arasında odaklanmalıdır, ancak görüş alanına bağlı olarak değişecektir.
- Pozlama süresini 20 ms, kare yakalamayı 10.000 kareye ve ilk lazer gücünü 1,2 mW ile 12,5 mW arasında veya sinyalin yoğunluğuna ve görüş alanına bağlı olarak 5,1 adımda belirlenen lazer gücüne ayarlayın.
- Simgeyi kullanarak 3-B lensi etkinleştirin ve Edin düğmesine tıklayarak satın almaya başlayın.
- Görüntü alımı boyunca, lazer gücünü her 1000 karede 3 artışla veya yüksek sinyal-gürültü oranını korumak için yeterli artırın. Satın alma sırasında Z düzlemini ayarlamayın.
NOT: Lazer maksimum 90 mW lazer gücüne yükseltilebilir.
6 Satın alma sonrası modifikasyon ve EV izleme
- Görüntü alımından sonra, Görüntülemeyi çözümle penceresine geçiş yapma. Filtrelenmemiş görüntüde sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin ve filtreleri etkinleştirin. Foton sayısını, yerelleştirme hassasiyetini, sigmaları ve çerçeve dizinini Tablo 1'e göre ayarlayın.
- Görünüm ve dışa aktarma alanından tek tek EV'lerin X ekseni boyunca bir XYZ düzlem görünümü aracını kapla. Fotoğraf çekme olaylarının CSV dosyaları.
- X x x eksenindeki tek tek EV'leri X x x görüş alanında, fotoğraf çekme olaylarını ayarlanan mesafe gruplarına sığdıran bir çizgi histogram aracı kullanarak ikiye ayırın.
- Tek EV'lerin görüntülerini alın ve bunları .tiff dosyaları olarak kaydedin.
- Z ekseni boyunca yerleşime göre 3-B görselleştirme aracı ve rengi kullanarak tek tek EV'lerin 3-B videolarını oluşturun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmanın amacı, nanometre çözünürlüğü olan bireysel EV'lerin üç boyutlu olarak (3-D) görselleştirilmesinde süper çözünürlüklü mikroskopinin etkinliğini değerlendirmektir. Bireysel EV'lerin şeklini ve boyutunu analiz etmek için, fotoğraflanabilir boya kullandık ve EV'leri uzak kırmızı, membran aralayıcı bir boya ile kuluçkaya yatırdık ve kromatografi29aracılığıyla fazla boyayı çıkardık. Benzeşim yakalanan anti-CD81 ve kırmızı lekeli EV'ler daha sonra 640 nm uyarım lazeri altında süper çözünürlüklü mikroskopta görüntülendi. XY ekseninde ortalama 16 nm ve Z ekseninde 38 nm hata üreten mikroskopun kalibrasyonunun ardından (Şekil 1A, B),saflaştırılmış U2OS EV'ler XY ekseninde 20 nm'ye kadar ve Z ekseni boyunca 50 nm çözünürlüğe kadar başarıyla görselleştirildi.
Lazer gücü arttıkça ve elde edilen görüntüde kolayca belirginleştikçe 10.000 kare pozlama boyunca 3 boyutlu fotoğraflarda dSTORM aracılığıyla görselleştirilen bireysel EV'ler (Şekil 2A,B). Z düzleminin alım sonrası görüntü düzeltmesi, foton sayıları, sigmalar ve yeniden yapılandırılmış görüntünün yerelleştirme hassasiyeti, EV'nin 3-D olarak net bir şekilde çözülmesine izin verdi(Şekil 2C,D). Şekil 2C'deki EV, sağ üst köşedeki efsane tarafından görüldüğü gibi, yalnızca ilk 7.000 kare sırasında fotoğraflandı. Bu, lazer gücünün çok hızlı bir şekilde yükseltilmesinden kaynaklanmış olabilecek fotobleachingin bir sonucudur. Histogram, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun 100 nm yarıçapında (Şekil 2E) gerçekleştiğini doğrular, görselleştirilmiş EV'nin eksozom olduğunu ve küçük çaplı EV'lerin izolasyonunun başarılı olduğunu doğrular.
Boyut dağılımı analizi, bir çizgi histogram aracı ve XYZ düzlem görüntüleme aracı kullanılarak, fotoğraf çekme olaylarının çoğunun merkezin 100 nm yarıçapında gerçekleştiğini doğrulamak için tek tek izlenen diğer EV'lerde gerçekleştirildi (Şekil 3A,C), dSTORM'un küçük çaplı EV'leri görselleştirme yeteneğini daha da doğruladı. 3-B görselleştirme aracı tarafından görüldüğü gibi, Z ekseni boyunca hata artırılarak EKsenel eksen boyunca EV'nin uzun bir son görüntüsü üretilir (Şekil 3D, Video 1). Photoswitching olayları EV boyutu ile ilişkili değildi (Şekil 3E), dSTORM tabanlı karakterizasyonun ekzozomlar ve çapı 100 nm'den küçük zarflı virüsler gibi küçük EV'ler için kullanılabileceğini göstermiştir.
Z düzlemi ve sigma için doğru parametreler, membranın 3-B'de uygun çözünürlüğün ayrılmaz bir parçası. Mikroskobun nasıl optimize edileceğini ve EV'lerin en yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalamak için hem ön hem de edinim sonrası parametrelerin nasıl ayarlanacağını daha fazla araştırma yapılmalıdır.
Şekil 1: Süper çözünürlüklü mikroskobun 100 nm mikroküreler kullanılarak üç boyutta kalibrasyonu. (A) Satın alma sonrası görüntü düzeltmelerinden sonra mikroskobun mikroküsküler ile kalibrasyonundan gri tonlamalı görüş alanı. Sağ alt çubuk ölçekle. (B) XY ekseninde ve Z ekseninde mutlak kalibrasyon hataları sırasıyla kanal haritalama kalibrasyonu ve 3-B harita kalibrasyonu ile elde edilmiştir. N = 10 biyolojik kopya. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: üç boyutlu tek bir EV'nin dSTORM'u. (A) Fotoğraflarla boyayı birbirine alan ve 640 nm uyarım lazeri ile heyecanlanan fotoğrafla boyanabilen kırmızı membran ile boyanmış CD81+ benzeşimle arındırılmış EV'lerin gri tonlamalı görüş alanı. Sağ alt çubuk ölçekle. (B) Kanal rengine göre etiketlenmiş A'dan görüş alanı. (C) A'daki beyaz kutunun yakınlaştırılmış görünümünden kare dizinine göre etiketlenmiş tek EV. Sağ üstteki ısı haritası, fotoğraf çekme olaylarının kaydedildiği kareyi gösterir. Sağ alt çubuk ölçekle. (D) C'den EV kanal rengine göre etiketlenmiştir. (E) Boyut dağılımı analizi, D'de gösterilen kesik çizgideki EV'nin ikiye ayrılması ve fotoğraf çekme olayının bir çizgi histogram aracı kullanılarak 15,4 nm kutulara ayrılmasıyla oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tek bir EV'nin üç boyutlu olarak alınması sırasında fotoğraf çekme olaylarının dağılımı. (A) Fotoğraf büyüleyici kırmızı membran iç içe boya ile etiketlenmiş ve 640 nm uyarım lazeri ile heyecanlanan CD81+ benzeşimli saflaştırılmış bir EV'nin yeniden yapılandırılmış görüntüsü. Sağ alt çubuk ölçekle. (B) XY ekseni boyunca mikroskop çizgi Histogram Aracı kullanılarak elde edilen CD81+ benzeşim saflaştırılmış EV'lerin ortalama çaplarının kutu ve bıyık grafiği. (ortalama = 104 nm, standart sapma = 28 nm). (C) 10.000 kare pozlama boyunca kaydedilen A'daki EV'nin XY boyutu boyunca tek tek fotoğraf çekme olaylarının konumu. (D) 10.000 kare pozlama boyunca kaydedilen A'daki EV'nin XZ ekseni boyunca tek tek fotoğraf çekme olaylarının konumu. (E) Farklı çaplardaki bireysel EV'lerde kaydedilen fotoğraf çekme olaylarının sayısının scatterplot'ı. R-kare değeri 0.1065, algılanan fotoğraf çekme olaylarının sayısı ile EV çapı arasında hiçbir korelasyon göstermez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Fotoğraf büyüleyici kırmızı membran intercalating boya ile etiketlenmiş ve 640 nm uyarım lazer ile heyecanlı tek bir CD81 + benzeşim saflaştırılmış EV 3-B görüntü. Renk düzeni Z ekseni boyunca derinliğe göre etiketlenir. Z ekseni boyunca hata uzamış. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
| Değişken | Min | Max |
| Foton Sayısı | 200 | 10,000,000 |
| Z pozisyonu (nm) | -300 | 300 |
| Yerelleştirme Duyarlık X (nm) | 0 | 40 |
| Yerelleştirme Duyarlık Y (nm) | 0 | 40 |
| Hassas Sigma X (nm) | 0 | 40 |
| Hassas Sigma Y (nm) | 0 | 40 |
| Sigma X (nm) (Kanal 0, 640 nm lazer) | 100 | 350 |
| Sigma Y (nm) (Kanal 0, 640 nm lazer) | 100 | 350 |
| Sigma X (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lazerler) | 100 | 350 |
| Sigma Y (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lazerler) | 100 | 350 |
| Çerçeve Dizini | 0 | 10,000 |
Tablo 1: 3-D DSTORM alımı sırasında süper çözünürlüklü mikroskop için parametreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV'ler, birçok hücre içi işlemdeki önemli rolleri ve hücreden hücreye sinyalizasyon1,30. Bununla birlikte, küçük boyutları ışık mikroskopisinin kırınım sınırının altına düştüğü için görselleştirmelerinin zor olduğu kanıtlanır. Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), zaman içinde bireysel floroforların fotoğraf çekme olaylarını yakalayarak ve bu yanıp sönen olaylara dayanarak bir görüntüyü yeniden oluşturarak kırınım sınırını atlayan doğrudan bir görselleştirme yöntemidir21,31. Süper çözünürlüklü mikroskopi, aksin filamentleri, mikrotübüller, plazma zarında gömülü reseptörler ve enfekte hücrelerde viral proteinler32 , 33 , 34,35,36gibi çeşitli hücresel yapılarda3boyutlu olarak başarıyla gerçekleştirildi. Bu çalışmanın amacı, süper çözünürlüklü mikroskopinin, özellikle dSTORM'un, 3 boyutlu olarak nanometre çözünürlüğü ile EV'lerin görselleştirilmesinin etkinliğini değerlendirmekti. XY ekseninde +/- 20 nm çözünürlüğe ve Z ekseninde +/- 50 nm çözünürlüğe kadar dSTORM aracılığıyla U2OS hücrelerinden tek tek EV'leri başarıyla görselleştirmek için fotoğraf büyülenebilir membran intercalating boyası kullandık. Daha önceki çalışmalarımız, birden fazla hücre hattından ve birincil sıvılardan gelen EV'lerin NTA ve TEM26,37tarafından analiz edilen benzer boyut dağılımı profillerine sahip olduğunu göstermiştir. EV'lerin dSTORM tabanlı bir karakterizasyonunun kullanılması, bu fenomene daha fazla güven katabilir ve potansiyel olarak tek bir görüş alanındaki alt nüfusları tanımlayabilir. Bu yöntemin daha fazla iyileştirilmesi garanti edilir. dSTORM için önemli bir avantaj, numune hazırlığının EV'lerin yapısını değiştirebilecek sert veya zarar verici adımlar gerektirmemesidir. Sonuçlarımız ayrıca, EV saflaştırma sırasında EV'lerin biyokimyasal doğasının anti-CD81 boncuklar ve asidik glisinin26,37ile korunduğunu göstermektedir. Metanol ve etanol gibi diğer fiksatiflerin neden olduğu membran permeabilizasyonlarını önlemek için EV'leri paraformaldehit ile sabitledik. Bu, dSTORM'un EV'lerin morfolojisini çözümde var oldukları gibi doğru bir şekilde yakaladığı sonucuna varmızı sağladı. Bununla birlikte, Capto Core 700'ün kullanımı, EV'leri albümin ve polietilen glikol gibi kirleticilerden düzenleyici gereksinimlerin altına etkili bir şekilde arındırmak için gereklidir38. Protokolün dikkate değer bir sınırlaması, EV ve slaytlar arasındaki bağlama verimliliğinin% 100 olmamasıdır, bu nedenle bazı EV'ler numune hazırlama sırasında kaybolur. EV'leri daha iyi bağlamak için yapışkan kaplı slaytların etkinliği hakkında daha fazla araştırma yapılmalıdır.
EV'lerin görselleştirme için hazırlanması basit olsa da, satın alma sırasında ve özellikle alım sonrası değişiklikler sırasında parametreler, EV'lerin ve floroforun yoğunluğuna ve stabilitesine bağlı olarak numuneden örneğe önemli ölçüde değişir. Deneydeki değişkenlik alanlarından biri, sinyali en üst düzeye çıkarmak ancak fotobleachingi önlemek için maruz kalma boyunca hassas bir şekilde yükseltilmesi gereken heyecan lazerlerinin yoğunluğudur. Fotobleaching veya bir florofor floresan yeteneğini kaybettiğinde, süper çözünürlüklü mikroskopi boyunca önemli bir sınırlamadır12,39. Fotobleachingi önlemek için, oksitleyici molekülleri daha iyi çıkarmak ve fotobleachingi önlemek için tampondaki enzimin konsantrasyonu 10 mM'ye yükseltilebilir. Ek olarak, heyecan lazer gücünü düşük bir başlangıç seviyesine ayarlamak ve yüksek bir sinyali korumak için pozlama boyunca yavaşça yükseltmek fotobleachingi önlemek için kritik öneme sahiptir.
Heyecan dalga boyu, dayanıklılığı ve fiksasyona dayanabilme yeteneği nedeniyle EV'leri lekelemek için kırmızı bir fotoğraf büyülenebilir boya seçtik29. Bununla birlikte, seçtiğimiz boya, süper çözünürlüklü mikroskopi sırasında çok hızlı veya çok yüksek yoğunlukta heyecanlandığında sorunlar ortaya çıkabilir. Fotoğraflanabilir kırmızı membran boyasındaki floroforlar, 10.000 kareden sonra veya lazer gücü 75,6 mW'ı aştıktan sonra fotobleach yapabilir. Ek olarak, membran boyasının yoğunluğu ve floresan yeteneği, 4 ° C'de bir haftalık depolamadan sonra önemli ölçüde azalır. Son olarak, membran intercalating boyaların sulu bir çözeltide misel oluşturduğu gösterilmiştir, bu nedenle arıtmadan sonra EV örneğinde hala bulunan herhangi bir fazla boya tespit edilebilir ve tetraspanin gibi EV'yi tanımlamak için başka bir işaret yoksa bir EV ile karıştırılabilir. Fotoğraf stabilitesi için optimize etmek için diğer membran intercalating boyalar kullanılarak daha fazla araştırma yapılmalıdır31,40. EV'ye konjuge edilen floresan antikorlar, fotobleachinge karşı daha dirençli olma eğiliminde oldukları ve sinyali yükseltebilecekleri için daha uygun bir seçenek olabilir41. Bununla birlikte, antikorların dezavantajı, florofordan gelen sinyalin, antikor üzerindeki epitop ve florofordan uzaklığı nedeniyle EV'den biraz uzak olmasıdır.
NTA, akış sitometrisi veya EM gibi mevcut EV görselleştirme ve karakterizasyon yöntemleri, zarar verici hazırlık adımları gerektirebilir veya dolaylı görselleştirme yöntemleridir. dSTORM, EV'lerin doğal biyokimyasal doğasını koruyarak çok az numune hazırlama gerektirir ve kırınım sınırını atlayabilen ve küçük çaplı 8 , 9 , 10 ,11 , 12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Uyarılmış emisyon tükenmesi (STED), eğirme diski konfokal mikroskopisi (SDCM) ve foto-aktif lokalizasyon mikroskopisi (PALM)42,43gibi ev karakterizasyonu için süper çözünürlüklü mikroskopinin diğer teknikleri optimize edilebilir. Mevcut çalışma sadece dSTORM'a odaklanmaktadır, ancak süper çözünürlüklü mikroskopiyi optimize etmek ve bu teknikleri karşılaştırmak / kontrastlamak için gelecekteki çalışmalar garanti edilir. EV'ler son zamanlarda virüsün ilerlemesindeki rolleri daha belirgin hale geldiği için popüler bir araştırma alanı haline geldi. Epstein Barr Virüsü, HIV ve Hepatit A Virüsü gibi evrimsel olarak farklı birçok virüs, hastalığın ilerlemesini teşvik etmek ve vücudun bağışıklık tepkilerinden kaçmak için EV sinyal yollarından yararlanmak için evrimleşmiştir37,44,45,46,47,48,49,50 . Bu virüslerin, mRNA'lar veya viral proteinler gibi viral faktörleri, bağışıklık algılama 6 ,51 , 52,53'ten kaçarken, bu bileşenleri enfekte olmayan hücrelere aktarabilen EV'lere dahil ettiği gösterilmiştir. Bu ekzozomal ilişkili viral faktörler tespit edilebilir ve muhtemelen hastalığın ilerlemesi için biyobelirteç olarak kullanılabilir54,55. Bu nedenle, dSTORM tabanlı bireysel EV'lerin ve ilişkili proteinlerinin görselleştirilmesi, hastalık biyobelirteçleri ve belki de belirli virüslerin hastalık ilerlemesi için bir platform olarak araştırılabilir54,55. DSTORM'un bir EV içindeki içeriği ve zarındaki proteinleri görselleştirmedeki yararını değerlendirmek için daha fazla araştırma yapılmalıdır.
Sonuç olarak, süper çözünürlüklü mikroskopinin 3 boyutlu olarak NANOMETRE çözünürlüğü ile EV'lerin görselleştirilmesi için etkili bir teknik olarak değerlendirilmesi gerektiğini ortaya koyduk. dSTORM tarafından elde edilen sonuçlar diğer EV karakterizasyon teknikleri ile uyumludur. dSTORM'un belirgin bir avantajı, DEHIDRASYON veya DONDURMA kırığı adımları olmadan ışığın kırınım sınırının altındaki parçacıkları doğrudan görselleştirme yeteneğidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.G.C.'nin beyan edecek bir çıkar çatışması yok. R.P.M ve D.P.D., Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. ve Cytiva Inc.'den (eski adıyla GE Healthcare) malzeme desteği almaktadır. R.P.M. ve D.P.D. sunulan bazı bilgilerin olası ticarileştirilmesi için rakip çıkarlar beyan eder. Bunlar Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından yönetilmektedir. Fon kaynakları bu makalenin yorumlanmasında veya yazılmasında yer almamaktadır.
Acknowledgments
Oxford Nanoimaging'e yapıcı geri bildirimleri ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma 5UM1CA121947-10 tarafından R.P..M.'a ve 1R01DA040394'den D.P.D.'ye finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
References
- Pegtel, D. M., Gould, S. J.
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C.
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
- Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
- Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
- Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
- Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
- Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
- Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
- Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
- Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
- Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
- Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
- Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
- McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
- Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
- Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
- Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
- Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
- Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
- Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
- Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
- Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
- Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
- Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
- Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
- Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).
