Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия внеклеточных везикул в трех измерениях

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) используется для обхода типичного дифракционного предела световой микроскопии и для просмотра экзосом в нанометровом масштабе. Он может быть использован как в двух, так и в трех измерениях для характеристики экзосом.

Abstract

Внеклеточные везикулы (EV) высвобождаются всеми типами клеток и играют важную роль в клеточной сигнализации и гомеостазе. Визуализация электромобилей часто требует косвенных методов из-за их малого диаметра (40-250 нм), который ниже дифракционного предела типичной световой микроскопии. Мы разработали визуализацию электромобилей на основе микроскопии сверхвысокого разрешения, чтобы обойти дифракционный предел как в двух, так и в трех измерениях. Используя этот подход, мы можем разрешить трехмерную форму электромобилей с разрешением +/- 20 нм по оси XY и разрешением +/- 50 нм по оси Z. В заключение мы предлагаем рассматривать микроскопию сверхвысокого разрешения как метод характеристики EV, включая экзосомы, а также вирусы в оболочке.

Introduction

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой мембранно-связанные везикулы, высвобождаемые всеми типами клеток. Они содержат липиды, белки, метаболиты и нуклеиновые кислоты и переносят эти материалы локально между клетками и дистально между тканями и органами. Существует три основных подтипа EV: апоптотические тела, микровезикулы и экзосомы1,2. Здесь мы сосредоточим наше обсуждение на экзосомах и связанных с ними белках.

Экзосомы представляют собой секретируемые везикулы, возникающие из внутреннего бутонизации ранних эндосом в мультивезикулярное тело (MVB). Затем MVB сливается с плазматической мембраной, высвобождая экзосомы во внеклеточное пространство для перемещения в другие клетки3,4. Экзосомы существуют в спектре размеров от 40 до 150 нм и обогащены эндосомальными трансмембранными белками, известными как тетраспанины (CD9, CD63, CD81), мембранно-связанным эндосомальным сортировочным комплексом, необходимым для транспорта (ESCRT), и липидными рафт-ассоциированными белками1,2,5,6,7.

Характеристика биохимического состава экзосом стала популярной областью для исследователей, чтобы лучше понять их функциональную природу. Существует множество методов визуализации и характеристики экзосом, включая наноразмерную проточную цитометрию, анализ отслеживания наночастиц (NTA), сканирующую и просвечивающую электронную микроскопию (TEM), поверхностный плазмонный резонанс, резистивное импульсное зондирование и традиционную световую микроскопию, каждая из которых содержит внутренние плюсы и минусы8,9. ТЭМ и крио-ЭМ могут достигать нанометрового разрешения, но часто требуют этапов обезвоживания и замораживания-разрушения, тем самым уменьшая или лизуя EV10,11. NTA полагается на рассеяние света, позволяя характеризовать сотни EV одновременно, но является косвенным измерением размера частиц и не может легко различить EV, вирусы и белковые агрегаты12,13,14,15,16. Наноразмерная проточная цитометрия использует рассеяние света от пути возбуждения, которое затем может быть преобразовано в измерения размера, но является новой технологией, и существует мало консенсуса относительно того, какой размер частиц находится в линейном диапазоне обнаружения для различных инструментов12,17,18.

Традиционная световая микроскопия с использованием флуоресцентных белков или красителей была одним из наиболее широко используемых методов визуализации субклеточных компартментов, белковых комплексов и сигнальных механизмов внутри клетки. Хотя этот метод оказывается полезным при визуализации локализации комплексов, дифракционный предел традиционной световой микроскопии (около 250-400 нм) препятствует четкому разрешению белков или структур в типичном диапазоне размеров экзосомы (40-150 нм)12,19,20.

Микроскопия сверхвысокого разрешения, а именно прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM), отличается от обычной световой микроскопии тем, что использует фотопереключаемые свойства конкретных флуорофоров и обнаруживает эти мигающие события для реконструкции изображений до нанометровой точности21. События переключения фотографий собираются с помощью камеры обнаружения с высокой частотой кадров в течение десятков тысяч индивидуальных экспозиций, а функция точечного распространения используется для отображения с высокой степенью достоверности точного местоположения фотопереключающего флуорофора19,20,22. Это позволяет dSTORM обходить дифракционный предел световой микроскопии. Несколько групп сообщили об использовании методов сверхвысокого разрешения для визуализации и отслеживания экзосом и связанных с ними белков22,23,24,25. Конечное разрешение зависит от биофизических свойств флуорофора, но часто колеблется от +/-10-100 нм вдоль оси XY, что позволяет использовать одномолекулярное разрешение.

Способность разрешать отдельные флуорофоры в этом масштабе на оси XY произвела революцию в микроскопии. Тем не менее, существует мало данных о трехмерном (3-D) dSTORM экзосомы. Поэтому мы стремились установить стандартную операционную процедуру (SOP) для визуализации и характеристики очищенных электромобилей на основе dSTORM, включая экзосомы с нанометровой точностью в 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 Распространение и обслуживание клеточных линий

  1. Приобретите клетки остеосаркомы человека (U2OS) и поместите клетки в питательную среду, дополненную 10% экзосомной сывороткой крупного рогатого скота без экзосом и 1x раствором пенициллина / стрептомицина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фетальная бычья сыворотка без экзосом была сгенерирована в соответствии с протоколом, представленным в McNamara et. ал.26.
  2. Поддерживайте клетки U2OS в инкубаторе с медным покрытием при 37 °C в 5% CO2 и проходные клетки в колбах T17526,27. Клетки должны поддерживаться в средней логарифмической фазе роста, чтобы предотвратить возникновение субпопуляций или накопление апоптотического мусора во время стационарной фазы.

2 Выделение и очистка экзосом

  1. Увеличьте клеточные линии U2OS до полного слияния в 10 отдельных колбах T175 с 50 мл среды на колбу. Удалите супернатант клетки и последовательно пропустите его через вакуумный фильтрационный аппарат 0,45 мкм и 0,22 мкм.
  2. Подвергайте супернатант фильтрации поперечного потока (также известной как тангенциальная фильтрация потока) на системе фильтрации, оснащенной картриджем с полым волокном 750 кДа, чтобы удалить более мелкие белки или метаболиты28.
    1. Пропустить супернатант через оператор фильтрации тангенциального потока при постоянном прямом давлении 30 фунтов на квадратный дюйм, сохраняя при этом давление удержания <20 фунтов на квадратный дюйм для получения давления Δ 10 или более фунтов на квадратный дюйм. Поместите магнитный перемешивание в ретентатный бак и установите на 150 об/мин26.
    2. Поддерживайте скорость подачи на уровне 40 мл/мин или выше. Соберите пермеат в резервуар и утилизируйте его.
  3. Сконцентрируйте супернатант до 30 мл, а затем уравновесьте четырьмя объемами по 1x PBS. Соберите поперечный фильтрованный и уравновешенный раствор в коническую трубку объемом 50 мл.
  4. Осаждать EV при 4 °C в течение ночи в конечной концентрации 40 мг/мл полиэтиленгликоля с молекулярной массой 8000 Да. Центрифугировать EV при 1 200 х г при 4 °C в течение 1 ч и повторно суспендировать в 500 мкл 1x PBS.
  5. Инкубируйте электромобили с 50 мкг/мл фотопереключаемого красного мембранного интеркалирующего красителя и 50 мкг/мл РНКазы А в 1x PBS при 4 °C в течение 1 ч.
  6. Удалите избыток красителя через колонку на системе очистки белка, прикрепленной к коллектору фракций. Идентификация фракций EV через поглощение УФ-излучения и объединение их в микроцентрифужную трубку26.
  7. Affinity-выберите в общей сложности 200 мкл электромобилей, используя магнитные шарики против CD81, уравновешенные в 1x PBS.
    1. Разбавьте 100 мкл магнитных шариков анти-CD81 в 1x PBS до общего объема 1 мл и дайте им связываться при 4 °C в течение 2 ч в микроцентрифужной трубке 2 мл с непрерывным раскачиванием.
  8. Вымойте бусины против CD81 и EV три раза с 1x PBS. Elute CD81+ EV из раствора со 100 мМ глицина при рН 2,0 в течение 30 мин при 37 °C.
  9. Пипетка очищенного CD81+ EV в равный объем 100 мМ Tris-HCl при рН 7,5 в 1x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвота очищенного раствора CD81+ EV может быть зарезервирована для анализа отслеживания наночастиц или электронной микроскопии с целью подтверждения чистоты раствора и наличия EV26.

3 Фиксация и подготовка

  1. Поместите аффинно-очищенные EV на стеклянные μ-слайдовые 8-луночные пластины общим объемом 200 мкл (можно разбавить образец EV в 100 мМ Tris-HCl при рН 7,5 в 1x PBS) и дайте прилипнуть к поверхности в течение ночи при 4 °C.
  2. Не удаляя имеющийся раствор из 8-луночной пластины, закрепляют EV на пластинах, добавляя 200 мкл 4% параформальдегида в 1x PBS к EV-содержащему раствору в каждой скважине и дают инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре21.
  3. Осторожно удалите параформальдегид и избыток раствора с помощью микропипетки, чтобы не нарушить работу электромобилей. Вымойте EV с 1x PBS, чтобы удалить избыток параформальдегида. Выполните процедуру умывания три раза. Удалите лишний 1x PBS.
  4. Приготовьте 250 мкл буферного раствора dSTORM B-куба на образец, создав раствор из 5 мМ протокатехуатдиоксигеназы (часть A), разбавленной в буфере визуализации (часть B) в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация фермента в буфере может быть удвоена до 10 мМ, если происходит фотоотбеливание.
    1. Добавьте 250 мкл подготовленного буфера в каждую скважину в соответствии с протоколом производителя в течение 20 минут при комнатной температуре перед визуализацией для очистки окисляющих молекул.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затем EV можно либо просмотреть сразу, либо хранить при температуре 4 °C в течение недели. Замените буфер после хранилища перед каждой визуализацией.

4 Прямая стохастическая оптическая реконструкционная калибровка микроскопии

  1. Подготовьте шарики, необходимые для калибровки микроскопа сверхвысокого разрешения, путем разбавления 100 нм микросфер до концентрации 0,5% в воде класса молекулярной биологии и пипетки 200 мкл в каждую скважину стеклянного дна μ-слайдовой 8-луночной пластины.
    1. Дайте шарикам осесть в колодцах в течение 1 ч при комнатной температуре.
  2. Не удаляя имеющийся раствор, добавляют 200 мкл 4% параформальдегида в ПБС в каждую лунку к калибровочному шариковому раствору и дают инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Осторожно удалите параформальдегид микропипеткой, чтобы не потревожить бусины, и трижды вымойте бусины 1x PBS. Подготовьте буфер в соответствии с шагом 3.4.
  4. Удалите 1x PBS и добавьте 250 мкл подготовленного буфера в каждую лунку. Дайте буферу посидеть в течение 20 минут перед визуализацией.
  5. Прежде чем поместить что-либо на сцену, подключитесь к 3D-микроскопу с помощью кнопки «Подключить микроскоп». Добавьте 100x масла к цели и поместите центр скважины поверх цели. В настройке «Получить» включите лазеры возбуждения 473 и 640 нм и нажмите «Вид».
    1. Без активированного 3D-объектива просмотрите бусины под настройкой насыщенности фотонов, щелкнув Счетчики фотонов в параметрах отображения изображения. Установите начальную мощность лазера на 8,4 мВт для лазера 473 нм и на 11,6 мВт для лазера 640 нм.
    2. Уменьшите фокус лазера примерно до -300 нм или фокальной плоскости калибровочных шариков, чтобы получить четкое разрешение отдельных шариков. Как только Z-плоскость сфокусирована, дополнительно отрегулируйте уровни мощности лазера, чтобы учесть изменения в каждом поле зрения.
  6. В соответствии с функциями прибора, выполните калибровку 3-D отображения и калибровку отображения каналов для получения ошибок на осях X,Y- и Z. Установите максимальное число FOV равным 20, целевое число точек — 4 000, максимальное расстояние между каналами — 5,0 пикселя и радиус исключения между каналами — 10,0 пикселя во время калибровки сопоставления каналов.
  7. Убедитесь, что калибровка обеспечивает точечное покрытие >90% и хорошее качество отображения. Сохраните данные калибровки для будущих сборов изображений.

5 Визуализация EV в трех измерениях

  1. Добавьте 100-кратное масло на объектив и поместите подготовленные электромобили в микроскоп. Без активированной 3D-линзы включите лазер возбуждения 640 нм и первоначально поднимите его до 1,2 мВт и 12,5 мВт в зависимости от интенсивности сигнала и поля зрения, чтобы возбудить красную мембрану, интеркалируя окрашенные красителем EV.
    1. В параметрах Отображение изображения переключите метод просмотра с насыщения фотонов на процентили, чтобы лучше визуализировать электромобили. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму шум, одновременно максимизируя сигнал. Сохраняйте все остальные параметры.
    2. Отрегулируйте фокус плоскости Z, щелкнув значок вверх или вниз по оси Z.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Z-плоскость должна быть сфокусирована между -200 и -350 нм, но будет варьироваться в зависимости от поля зрения.
  2. Установите время экспозиции на 20 мс, захват кадра на 10 000 кадров, а начальную мощность лазера на расстоянии от 1,2 мВт до 12,5 мВт или мощность лазера, определенную на шаге 5,1, в зависимости от интенсивности сигнала и поля зрения.
    1. Активируйте 3D-объектив с помощью значка и начните сбор, нажав на кнопку «Получить».
  3. Во время получения изображения повышайте мощность лазера на 3 шага по 10 каждые 1000 кадров, или достаточно для поддержания высокого отношения сигнал/шум. Не регулируйте Z-плоскость во время захвата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазер может быть увеличен до максимальной мощности лазера 90 мВт.

6 Модификация после приобретения и отслеживание электромобилей

  1. После получения изображения переключитесь в окно просмотра Анализ. Выполните коррекцию дрейфа на нефильтрованном изображении, а затем активируйте фильтры. Отрегулируйте количество фотонов, точность локализации, сигма и индекс кадра в соответствии с таблицей 1.
  2. Наложение инструмента просмотра плоскости XYZ вдоль оси X отдельных электромобилей из поля зрения и экспорта. CSV-файлы событий переключения фотографий.
  3. Разделите пополам отдельные электромобили по оси XY в поле зрения X на Y с помощью инструмента линейной гистограммы, который объединяет события переключения фотографий в заданные группы расстояний.
  4. Делайте снимки отдельных электромобилей и сохраняйте их в виде .tiff файлов.
  5. Создавайте 3D-видео отдельных электромобилей с помощью инструмента 3D-визуализации и раскрашивайте их в соответствии с размещением вдоль оси Z.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Целью этого исследования была оценка эффективности микроскопии сверхвысокого разрешения в визуализации отдельных электромобилей с нанометровым разрешением в трех измерениях (3-D). Чтобы проанализировать форму и размер отдельных электромобилей, мы использовали фотопереключаемый краситель и инкубировали электромобили с темно-красным мембранным интеркалирующим красителем и удаляли избыток красителя с помощью хроматографии29. Затем захваченные аффинностью анти-CD81 и окрашенные красным цветом электромобили были просмотрены в микроскопе со сверхвысоким разрешением под лазером возбуждения 640 нм. После калибровки микроскопа, которая произвела среднюю погрешность 16 нм по оси XY и 38 нм по оси Z(рисунок 1A,B),очищенные электромобили U2OS были успешно визуализированы с разрешением до 20 нм по оси XY и 50 нм по оси Z.

Отдельные электромобили, визуализированные через dSTORM в 3D-фотографиях, переключались на протяжении 10 000 кадров по мере увеличения мощности лазера и были легко видны на полученномизображении (рисунки 2A, B). Коррекция после получения изображения Z-плоскости, количества фотонов, сигм и точности локализации реконструированного изображения позволила получить четкое разрешение EV в 3-D(рисунок 2C,D). EV на рисунке 2C переключался только в течение первых 7000 кадров, как видно по легенде в правом верхнем углу. Это результат фотоотбеливания, которое, возможно, было вызвано слишком быстрым повышением мощности лазера. Гистограмма подтверждает, что большинство событий фотопереключения произошло в радиусе 100 нм(рисунок 2E),подтверждая, что визуализированный EV является экзосомой и что изоляция электромобилей небольшого диаметра была успешной.

Анализ распределения размеров был выполнен на других индивидуально отслеживаемых электромобилях с использованием инструмента линейной гистограммы и инструмента XYZ plane view, чтобы подтвердить, что большинство событий переключения фотографий произошло в радиусе 100 нм от центра(рисунок 3A,C),что дополнительно подтверждает способность dSTORM визуализировать электромобили небольшого диаметра. Как видно из инструмента 3D-визуализации, погрешность вдоль оси Z увеличивается, создавая удлиненное конечное изображение EV вдоль осевой оси(рисунок 3D,видео 1). События фотопереключения не коррелировали с размером EV(рисунок 3E),демонстрируя, что характеристика на основе dSTORM может использоваться для небольших электромобилей, таких как экзосомы и небольшие оболочки вирусов диаметром менее 100 нм.

Правильные параметры для Z-плоскости и сигмы являются неотъемлемой частью правильного разрешения мембраны в 3D. Кроме того, правильное время экспозиции, количество захваченных кадров и начальный лазерный уровень имеют решающее значение для получения изображения отдельного электромобиля с разрешенной мембраной. Следует продолжить изучение того, как оптимизировать микроскоп и установить как предварительные, так и постпознавательные параметры для захвата изображений с самым высоким разрешением электромобилей.

Figure 1
Рисунок 1:Калибровка микроскопа сверхвысокого разрешения в трех измерениях с использованием 100 нм микросфер. (A) Поле зрения в оттенках серого от калибровки микроскопа с микросферами после коррекции изображения после получения. Шкала в правом нижнем углу. (B)Абсолютные погрешности калибровки по оси XY и оси Z были получены путем калибровки отображения каналов и калибровки 3D-отображения, соответственно. N = 10 биологических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:dSTORM одного электромобиля в трех измерениях. (A) Поле зрения оттенков серого для CD81+ очищенных сродством электромобилей, окрашенных фотопереключаемым красным мембранным интеркалирующим красителем и возбужденных лазером возбуждения 640 нм. Шкала в правом нижнем углу. (B) Поле зрения от A, помеченное в соответствии с цветом канала. (C) Одиночный EV из увеличенного вида белого прямоугольника в A, помеченный в соответствии с индексом кадра. Тепловая карта в правом верхнем углу показывает кадр, в котором были записаны события переключения фотографий. Шкала в правом нижнем углу. (D)EV из C, маркированный в соответствии с цветом канала. (E) Анализ распределения размеров был создан путем разделения EV пополам на пунктирной линии, показанной в D, и разделения события фотопереключения на бункеры 15,4 нм с помощью инструмента гистограммы линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Распределение событий фотопереключения во время получения одного EV в трех измерениях. (A) Реконструированное изображение CD81+ очищенного сродством EV, помеченного фотопереключаемым красным мембранным интеркалирующим красителем и возбужденного лазером возбуждения 640 нм. Шкала в правом нижнем углу. (B)График коробки и усов средних диаметров CD81+ очищенных сродством ev, полученных с помощью инструмента линейной гистограммы микроскопа вдоль оси XY. (среднее = 104 нм, стандартное отклонение = 28 нм). (C)Местоположение отдельных событий переключения фотографий вдоль измерения XY EV в A, записанных на протяжении 10 000 кадровой экспозиции. (D)Местоположение отдельных событий переключения фотографий вдоль оси XZ EV в A, записанных на протяжении 10 000 кадровой экспозиции. (E)Диаграмма рассеяния количества событий переключения фотографий, записанных на отдельных электромобилях различного диаметра. Значение R-квадрата 0,1065 демонстрирует отсутствие корреляции между количеством обнаруженных событий фотопереключения и диаметром EV. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: 3-D изображение одного электромобиля, очищенного сродством CD81+, помеченного фотопереключаемым красным мембранным интеркалирующим красителем и возбужденного лазером возбуждения 640 нм. Цветовая схема обозначена в соответствии с глубиной вдоль оси Z. Погрешность вдоль оси Z вытянута. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Переменная Мин Макс
Количество фотонов 200 10,000,000
Z-положение (нм) -300 300
Точность локализации X (нм) 0 40
Точность локализации Y (нм) 0 40
Прецизионная Сигма X (нм) 0 40
Прецизионная сигма Y (нм) 0 40
Sigma X (нм) (канал 0, лазер 640 нм) 100 350
Sigma Y (нм) (канал 0, лазер 640 нм) 100 350
Sigma X (нм) (лазеры канала 1, 473, 561 нм) 100 350
Sigma Y (нм) (лазеры канала 1, 473, 561 нм) 100 350
Индекс кадра 0 10,000

Таблица 1: Параметры микроскопа сверхвысокого разрешения при получении 3-D dSTORM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Электромобили стали популярной областью исследований из-за их важной роли во многих внутриклеточных процессах и межклеточной передаче сигналов1,30. Однако их визуализация оказывается сложной, поскольку их небольшой размер падает ниже дифракционного предела световой микроскопии. Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) представляет собой прямой метод визуализации, который обходит дифракционный предел путем захвата событий фотопереключения отдельных флуорофоров с течением времени и реконструкции изображения на основе этих мигающих событий21,31. Микроскопия сверхвысокого разрешения была успешно выполнена в 3D на нескольких клеточных структурах, таких как актиновые нити, микротрубочки, рецепторы, встроенные в плазматическую мембрану, и вирусные белки в инфицированных клетках32,33,34,35,36. Целью этого исследования была оценка эффективности микроскопии сверхвысокого разрешения, в частности dSTORM, для визуализации электромобилей в 3D с нанометровым разрешением. Мы использовали фотопереключаемый мембранный интеркалирующий краситель для успешной визуализации отдельных электромобилей из ячеек U2OS через dSTORM с разрешением до +/- 20 нм по оси XY и разрешением +/- 50 нм по оси Z. Наша предыдущая работа показала, что электромобили из нескольких клеточных линий и первичных жидкостей имеют аналогичные профили распределения по размеру, проанализированные NTA и TEM26,37. Использование характеристики электромобилей на основе dSTORM может добавить дополнительную уверенность в этом явлении, а также потенциально идентифицировать субпопуляции в одном поле зрения. Дальнейшее совершенствование этого метода оправдано. Одним из заметных преимуществ dSTORM является то, что подготовка образца не требует резких или разрушительных шагов, которые могут изменить структуру электромобилей. Наши результаты также демонстрируют, что биохимическая природа EV сохраняется во время очистки EV с помощью бусин против CD81 и кислогоглицина 26,37. Мы закрепили электромобили параформальдегидом, чтобы избежать мембранной пермеабилизации, вызванной другими фиксаторами, такими как метанол и этанол. Это позволило нам сделать вывод, что dSTORM точно фиксирует морфологию электромобилей в том виде, в котором они существуют в растворе. Однако использование Capto Core 700 необходимо для эффективной очистки электромобилей от загрязняющих веществ, таких как альбумин и полиэтиленгликоль, до уровня ниже нормативных требований38. Одним из заметных ограничений протокола является то, что эффективность связывания между EV и слайдами не составляет 100%, поэтому некоторые электромобили теряются во время подготовки образца. Следует провести дальнейшее исследование эффективности слайдов с адгезивным покрытием для лучшего связывания электромобилей.

В то время как подготовка электромобилей к визуализации проста, параметры во время сбора и особенно во время постпознавательных модификаций существенно варьируются от образца к образцу, в зависимости от интенсивности и стабильности EV и флуорофора. Одной из областей изменчивости в эксперименте является интенсивность лазеров возбуждения, которые должны быть деликатно повышены на протяжении всей экспозиции, чтобы максимизировать сигнал, но предотвратить фотоотбеливание. Фотоотбеливание, или когда флуорофор теряет способность к флуоресценции, является существенным ограничением во всей микроскопии сверхвысокого разрешения12,39. Чтобы предотвратить фотоотбеливание, концентрация фермента в буфере может быть увеличена до 10 мМ, чтобы лучше поглощать окисляющие молекулы и предотвращать фотоотбеливание. Кроме того, установка мощности лазера возбуждения на низкий начальный уровень и медленное повышение ее на протяжении всей экспозиции для поддержания высокого сигнала имеет решающее значение для предотвращения фотоотбеливания.

Мы выбрали красный фотопереключаемый краситель для окрашивания электромобилей из-за его длины волны возбуждения, долговечности и способности выдерживать фиксацию29. Тем не менее, краситель, который мы выбрали, может представлять проблемы во время микроскопии со сверхвысоким разрешением при слишком быстром возбуждении или при слишком высокой интенсивности. Флуорофоры в фотопереключаемом красном мембранном красителе могут фотоотбеливаться через 10 000 кадров или после того, как мощность лазера превысит 75,6 мВт. Кроме того, интенсивность мембранного красителя и его способность к флуоресценции существенно снижается после недели хранения при 4 °C. Наконец, было показано, что мембранные интеркалирующие красители образуют мицеллы в водном растворе, поэтому любой избыток красителя, все еще присутствующий в образце EV после очистки, может быть обнаружен и ошибочно принят за EV, если нет другого маркера для идентификации EV, такого как тетраспанин. Дальнейшее исследование должно быть проведено с использованием других мембранных интеркалирующих красителей для оптимизации для фотостабильности31,40. Флуоресцентные антитела, конъюгированные с EV, могут быть более подходящим вариантом, поскольку они, как правило, более устойчивы к фотоотбеливанию и могут усиливать сигнал41. Однако недостатком антител является то, что сигнал от флуорофора немного смещен от EV из-за расстояния от эпитопа и флуорофора на антителе.

Существующие методы визуализации и характеристики ЭЛЕКТРОМОБИЛЕЙ, такие как NTA, проточная цитометрия или ЭМ, могут потребовать повреждающих этапов подготовки или являются косвенными методами визуализации. dSTORM требует небольшой пробоподготовки, сохраняя естественную биохимическую природу EV, и является прямым методом визуализации, который может обойти дифракционный предел и визуализировать EV небольшогодиаметра8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18,21, 26г. Другие методы микроскопии со сверхвысоким разрешением могут быть оптимизированы для характеристик электромобилей, такие как стимулированное истощение излучения (STED), конфокальная микроскопия вращающегося диска (SDCM) и фотоактивированная микроскопия локализации (PALM)42,43. Текущее исследование сосредоточено исключительно на dSTORM, но будущая работа по оптимизации микроскопии сверхвысокого разрешения и сравнению / контрастированию этих методов оправдана. Электромобили в последнее время стали популярной областью исследований, поскольку их роль в прогрессировании вируса стала более очевидной. Многие эволюционно различные вирусы, такие как вирус Эпштейна Барра, ВИЧ и вирус гепатита А, эволюционировали, чтобы использовать преимущества EV-сигнальных путей для содействия прогрессированию заболевания и уклонения от иммунного ответа организма37,44,45,46,47,48,49,50 . Было показано, что эти вирусы включают вирусные факторы, такие как мРНК или вирусные белки, в EV, которые затем могут передавать эти компоненты неинфицированным клеткам, избегая иммунного обнаружения6,51,52,53. Эти экзосомально-ассоциированные вирусные факторы могут быть обнаружены и, возможно, использованы в качестве биомаркера прогрессирования заболевания54,55. Поэтому визуализация отдельных EV и связанных с ними белков на основе dSTORM может быть изучена в качестве платформы для биомаркеров заболевания и, возможно, прогрессирования заболевания некоторых вирусов54,55. Дальнейшие исследования должны быть проведены для оценки полезности dSTORM в визуализации как содержимого в EV, так и белков на его мембране.

В заключение мы продемонстрировали, что микроскопию сверхвысокого разрешения следует считать эффективным методом визуализации электромобилей в 3D с нанометровым разрешением. Результаты, полученные dSTORM, согласуются с другими методами характеристики EV. Явным преимуществом dSTORM является способность непосредственно визуализировать частицы ниже дифракционного предела света без обезвоживания или замораживания стадий разрушения, которые могут изменить биохимическую природу EV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.G.C. не имеет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить. R.P.M и D.P.D. получают материальную поддержку от Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. и Cytiva Inc. (ранее GE Healthcare). R.P.M. и D.P.D. заявляют о конкурирующих интересах для возможной коммерциализации части представленной информации. Они управляются Университетом Северной Каролины. Источники финансирования не участвовали в интерпретации или написании этой рукописи.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Oxford Nanoimaging за их конструктивную обратную связь и руководство. Эта работа финансировалась 5UM1CA121947-10 для R.P.M. и 1R01DA040394 для D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

Биология выпуск 174
Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия внеклеточных везикул в трех измерениях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, M. G., McNamara, R. P.,… More

Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter