Summary
直接随机光学重建显微镜（dSTORM）用于绕过光学显微镜的典型衍射极限，并在纳米尺度上观察外泌体。它可以在二维和三维空间中用于表征外泌体。
Abstract
细胞外囊泡（EV）由所有细胞类型释放，并在细胞信号传导和体内平衡中起重要作用。电动汽车的可视化通常需要间接方法，因为它们的直径很小（40-250nm），低于典型光学显微镜的衍射极限。我们开发了一种基于超分辨率显微镜的电动汽车可视化，以绕过二维和三维的衍射极限。使用这种方法，我们可以将EV的三维形状解析为XY轴上的+/- 20nm分辨率和沿Z轴的+/- 50nm分辨率。总之，我们建议将超分辨率显微镜视为EV的表征方法，包括外泌体以及包膜病毒。
Introduction
细胞外囊泡（EV）是由所有细胞类型释放的膜结合囊泡。它们含有脂质，蛋白质，代谢物和核酸，并在细胞之间局部转移这些物质，并在组织和器官之间远端转移。EV有三种主要亚型：凋亡体，微囊泡和外泌体1，2。在这里，我们将讨论重点放在外泌体及其相关蛋白质上。
外泌体是分泌的囊泡，起源于早期内体向内萌芽进入多泡体（MVB）。然后，MVB与质膜融合，将外泌体释放到细胞外空间以传播到其他细胞3，4。外泌体存在于40至150nm的范围内，并富含称为四泛素（CD9，CD63，CD81）的内体跨膜蛋白，转运所需的膜结合内体分选复合物（ESCRT）和脂筏相关蛋白1，2，5，6，7。
表征外泌体的生化组成已成为研究人员更好地了解其功能性质的热门领域。存在许多用于可视化和表征外泌体的方法，包括纳米级流式细胞术，纳米颗粒跟踪分析（NTA），扫描和透射电子显微镜（TEM），表面等离子体共振，电阻脉冲传感和传统光学显微镜，每种方法都包含固有的优缺点8，9。TEM和冷冻电镜可以达到基于纳米的分辨率，但往往需要脱水和冷冻断裂步骤，从而缩小或裂解EV10、11。NTA依赖于光散射，允许一次表征数百个EV，但是对颗粒尺寸的间接测量，并且不能轻易区分EV，病毒和蛋白质聚集体12，13，14，15，16。纳米级流式细胞术采用来自激发路径的光散射，然后可以将其转换为尺寸测量，但这是一种新兴技术，并且对于各种仪器12，17，18的线性范围内的颗粒大小几乎没有共识。
使用荧光蛋白或染料的传统光学显微镜一直是可视化细胞内亚细胞区室，蛋白质复合物和信号传导机制的最常用技术之一。虽然这种技术被证明在可视化复合物的定位方面是有用的，但传统光学显微镜的衍射极限（约250-400nm）阻止了蛋白质或结构在外泌体（40-150nm）的典型尺寸范围内的清晰分辨率12，19，20。
超分辨率显微镜，即直接随机光学重建显微镜（dSTORM），通过利用特定荧光团的光开关特性并检测这些闪烁事件来重建精度低至纳米精度的图像，从而将自己与传统的光学显微镜区分开来21。在数以万计的单个曝光过程中，使用高帧率检测相机收集光开关事件，并使用点扩散函数以高置信度绘制光开关荧光团19，20，22的确切位置。这使得dSTORM绕过了光学显微镜的衍射极限。几个小组已经报道了使用超分辨率技术来可视化和跟踪外泌体及其相关蛋白质22，23，24，25。最终分辨率取决于荧光团的生物物理性质，但通常沿XY轴的范围为+/-10-100nm，允许单分子分辨率。
在XY轴上以这种尺度分辨单个荧光团的能力已经彻底改变了显微镜。然而，关于外泌体的三维（3-D）dSTORM的数据很少。因此，我们试图建立一种标准操作程序（SOP），用于基于dSTORM的纯化EV的可视化和表征，包括外泌体到3D的纳米精度。
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Protocol
1 细胞系的繁殖和维护
- 获取人骨肉瘤细胞（U2OS），并将细胞置于补充有10%外泌体游离胎牛血清和1x青霉素/链霉素溶液的生长培养基中。
注意：无外泌体的胎牛血清是按照McNamara等人提出的方案产生的。26. - 将U2OS细胞在37°C的铜包衣培养箱中保持在5%CO2中，并在T175烧瓶26，27中传代细胞。细胞必须保持在对数生长中期，以防止亚群在静止阶段出现或凋亡碎片的积累。
2 外泌体分离和纯化
- 将U2OS细胞系培养到10个单独的T175烧瓶中完全融合，每个烧瓶培养基为50 mL。除去细胞上清液，并依次通过0.45μm和0.22μm真空过滤装置。
- 在装有750 kDa空心纤维滤芯的过滤系统上对上清液进行错流过滤（也称为切向流过滤），以除去较小的蛋白质或代谢物28。
- 上清液以 30 psi 的恒定正向压力通过切向流过滤操作器，同时保持 <20 psi 的保持压力，以产生 10 或更大的 psi 的 Δ 压力。将磁性搅拌棒放入滞留罐中，并设置为150 rpm26。
- 将进料速率保持在 40 mL/min 或更高。将渗透物收集在储液罐中并进行处理。
- 将上清液浓缩至30 mL，然后用四体积的1x PBS平衡。将错流过滤和平衡的溶液收集在50 mL锥形管中。
- 将EV在4°C下沉淀过夜，终浓度为40mg / mL聚乙二醇，分子量为8，000 Da.在4°C下以1，200×g离心EV1小时，并重悬于500μL1x PBS中。
- 用50μg/ mL光开关红膜插层染料和50μg/ mL RNase A在4°C下在1x PBS中孵育EV1小时。
- 通过连接到馏分收集器的蛋白质纯化系统上的色谱柱去除多余的染料。通过紫外线吸光度鉴定EV组分，并将它们汇集到微量离心管26中。
- 亲和选择总共200μL的EV，使用抗CD81磁珠在1x PBS中平衡。
- 将1x PBS中的100μL抗CD81磁珠稀释至1mL的总体积，并允许它们在2mL微量离心管中在4°C下结合2小时，并连续摇摆。
- 用1x PBS洗涤抗CD81磁珠和EV三次。从溶液中洗脱CD81 + EV，在pH 2.0下在37°C下用100mM甘氨酸30分钟。
- 将纯化的CD81 + EV移液到等体积的100 mM Tris-HCl中，pH值为7.5，在1x PBS中。
注意：纯化的CD81 + EV溶液的等分试样可以保留用于纳米颗粒跟踪分析或电子显微镜检查，以确认溶液的纯度和EV26的存在。
3 固定和准备
- 将亲和纯化的EV以200μL的总体积（可在1x PBS中以pH 7.5的pH 7.5稀释EV样品）的玻璃底μ载玻片8孔板上（可在4°C下将EV样品稀释在100mM Tris-HCl中）。
- 在不从8孔板中取出现有溶液的情况下，通过将200μL4%多聚甲醛以1x PBS添加到每个孔中含有EV的溶液中，将EV固定在板上，并允许在室温下孵育30分钟21。
- 用微量移液管小心地除去多聚甲醛和多余的溶液，以免打扰电动汽车。用1x PBS清洗EV以去除多余的多聚甲醛。执行洗涤程序三次。取出多余的 1 倍 PBS。
- 根据制造商的协议，通过在成像缓冲液（B部分）中稀释的5mM原儿茶酸双加氧酶（A部分）溶液，为每个样品制备250μLdSTORM B立方缓冲液。
注意：如果发生光漂白，缓冲液中酶的浓度可以加倍至10mM。- 按照制造商的方案，在成像之前，将250μL准备好的缓冲液在室温下向每个孔中加入20分钟以清除氧化分子。
注意：然后可以立即查看EV，也可以在4°C下储存长达一周。在每次可视化之前更换存储后的缓冲区。
- 按照制造商的方案，在成像之前，将250μL准备好的缓冲液在室温下向每个孔中加入20分钟以清除氧化分子。
4 直接随机光学重建显微镜校准
- 通过将100nm微球稀释至分子生物学级水中浓度为0.5%，并将200μL移液到玻璃底μ载玻片8孔板的每个孔中，准备超分辨率显微镜校准所需的微珠。
- 让珠子在室温下在孔中沉降1小时。
- 在不去除现有溶液的情况下，将200μLPBS中的4%多聚甲醛加入到校准珠溶液的每个孔中，并允许在室温下孵育30分钟。
- 用微量移液管小心地除去多聚甲醛，以免干扰珠子，并用1x PBS洗涤珠子三次。根据步骤3.4准备缓冲液。
- 除去1x PBS并向每个孔中加入250μL制备的缓冲液。让缓冲液静置20分钟，然后进行可视化。
- 在将任何东西放在载物台上之前，请使用"连接显微镜"按钮连接到3D 显微镜 。向物镜中加入100倍油，并将井的中心放在物镜的顶部。在 "采集" 设置中，打开473和640 nm激发激光器，然后单击" 查看"。
- 在未激活 3D 镜头的情况下，通过单击"图像显示"选项中的"光子计数"，在光子饱和度设置下查看磁珠。对于 473 nm 激光器，将初始激光功率设置为 8.4 mW，对于 640 nm 激光器，将初始激光功率设置为 11.6 mW。
- 将激光的焦点降低到-300nm左右或校准微球的焦平面，以产生单个微球的清晰分辨率。Z平面聚焦后，进一步调整激光功率水平以考虑每个视场中的变化。
- 在仪器功能下，完成3D映射校准和通道映射校准，以获得X轴，Y轴和Z轴上的误差。在通道映射校准期间，将最大 FOV 数设置为 20，将目标点数设置为 4，000，将通道之间的最大距离设置为 5.0 像素，将通道之间的排除半径设置为 10.0 像素。
- 确保校准产生的点覆盖率为>90%，并且映射质量良好。保存给定的校准数据，以备将来图像采集。
5 EV的三维可视化
- 在物镜上加入100倍油，并将准备好的EV放入显微镜中。在未激活3D透镜的情况下，打开640 nm激发激光器，最初将其提高到1.2 mW至12.5 mW之间，具体取决于信号强度和视场，以激发红色膜插层染料染色EV。
- 在 "图像显示" 选项下，将查看方法从光子饱和度切换到百分位数，以更好地可视化 EV。调整激光功率以最小化噪声，同时最大化信号。保留所有其他参数。
- 通过单击 Z 轴上的向上或向下图标来调整 Z 平面的焦点。
注意：Z平面的聚焦应在-200和-350 nm之间，但会因视场而异。
- 将曝光时间设置为20 ms，帧捕获设置为10，000帧，初始激光功率设置为1.2 mW至12.5 mW之间，或步骤5.1中确定的激光功率，具体取决于信号和视野的强度。
- 使用图标激活3D镜头，然后单击"采集"按钮开始 采集 。
- 在整个图像采集过程中，将激光功率提高3次，每1000帧提高10次，或足以保持高信噪比。在采集过程中不要调整 Z 平面。
注：激光器可升至最大90 mW激光功率。
6 采集后修改和EV跟踪
- 图像采集后，切换到 "分析 "查看窗口。对未过滤的图像执行漂移校正，然后激活滤镜。根据 表1调整光子计数，定位精度，西格玛和帧指数。
- 从视野中沿单个EV的X轴覆盖XYZ平面视图工具并导出。照片切换事件的 CSV 文件。
- 使用线直方图工具将 XY 轴上的单个 EV 一分为二，在 X x Y 视野中，该工具将照片切换事件分箱到设定的距离组中。
- 拍摄单个电动汽车的图像并将其保存为.tiff文件。
- 使用 3-D 可视化工具创建单个 EV 的 3D 视频，并根据沿 Z 轴的位置使用颜色。
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Representative Results
本研究的目的是评估超分辨率显微镜在三维（3-D）中以纳米分辨率可视化单个电动汽车方面的有效性。为了分析单个EV的形状和大小，我们采用了光开关染料，并用远红色的膜插层染料孵育EV，并通过色谱法29除去多余的染料。然后在640 nm激发激光下在超分辨率显微镜下观察亲和捕获的抗CD81和红色染色的EV。在校准显微镜后，XY轴上产生16 nm的平均误差，Z轴上产生38 nm的平均误差（图1A，B），纯化的U2OS EV在XY轴上以高达20 nm的分辨率和沿Z轴的50 nm的分辨率成功可视化。
在10，000帧曝光期间，随着激光功率的增加，在3D照片中通过dSTORM可视化的单个EV随着激光功率的增加而切换，并且在获得的图像中显而易见（图2A，B）。对Z平面，光子计数，西格玛和重建图像的定位精度进行采集后图像校正，可以使EV在3-D中具有清晰的分辨率（图2C，D）。图2C照片中的EV仅在前7，000帧期间切换，如右上角的图例所示。这是光漂白的结果，可能是由于激光功率过快升高引起的。直方图证实大多数光开关事件发生在100nm半径内（图2E），验证了可视化的EV是外泌体，并且小直径EV的分离是成功的。
使用线直方图工具和XYZ平面视图工具对其他单独跟踪的EV进行尺寸分布分析，以确认大多数光开关事件发生在中心半径100nm范围内（图3A，C），进一步验证了dSTORM可视化小直径EV的能力。正如3D可视化工具所看到的，沿Z轴的误差增加，产生沿轴轴的EV的细长最终图像（图3D，视频1）。光开关事件与EV大小无关（图3E），表明基于dSTORM的表征可用于小型EV，如外泌体和直径小于100nm的小包膜病毒。
Z平面和西格玛的正确参数对于膜在3-D中的适当分辨率是不可或缺的，此外，正确的曝光时间，捕获的帧数和初始激光水平对于生成具有分辨膜的单个EV的图像至关重要。应进一步研究如何优化显微镜，并设置采集前和采集后参数，以捕获电动汽车的最高分辨率图像。
图1：使用100nm微球在三维空间中校准超分辨率显微镜（A）在采集后图像校正后用微球校准显微镜的灰度视野。右下角的比例尺。（B）XY轴和Z轴上的绝对标定误差分别通过通道映射标定和三维映射标定得到。N = 10 个生物重复。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：单个EV在三维空间中的dSTORM（A）用光开关红色膜插层染料染色并用640nm激发激光激发的CD81 +亲和纯化EV的灰度视野。右下角的比例尺。（B） 根据通道颜色标记的 A 的视野。（C） 单个 EV 从放大视图中的白色方框 A，根据帧索引进行标记。右上角的热图表示记录照片切换事件的帧。右下角的比例尺。（D）EV从C按通道颜色标记。（E） 尺寸分布分析是通过将D所示虚线上的EV一分为二，并使用线直方图工具将光开关事件分离成15.4 nm的条柱来创建的。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在三维空间中采集单个EV期间光转换事件的分布（A）用光开关红色膜插层染料标记并用640nm激发激光激发的CD81 +亲和纯化EV的重建图像。右下角的比例尺。（B） 使用显微镜的线直方图工具沿XY轴获得的CD81 +亲和纯化EV平均直径的箱形图和晶须图。（平均值 = 104 nm，标准偏差 = 28 nm）。（C） 在 A 中 EV 的 XY 维度上各个光转换事件的位置，在整个 10，000 帧曝光期间记录。（D） 在 A 中沿 EV XZ 轴的单个光转换事件的位置，在整个 10，000 帧曝光期间记录。（E） 记录在不同直径的单个EV上的光开关事件数量的散点图。R平方值0.1065表明检测到的光开关事件数量与EV直径之间没有相关性。请点击此处查看此图的放大版本。
视频1：用光开关红膜插层染料标记并用640 nm激发激光激发激发的单个CD81 +亲和纯化EV的3D图像。 配色方案根据沿 Z 轴的深度进行标记。沿 Z 轴的误差细长。 请点击此处下载此视频。
| 变量 | 最小值 | 麦克斯 |
| 光子计数 | 200 | 10,000,000 |
| Z 轴位置（海里） | -300 | 300 |
| 定位精度 X （纳米） | 0 | 40 |
| 定位精度 Y （nm） | 0 | 40 |
| 精密西格玛 X （纳米） | 0 | 40 |
| 精密西格玛 Y （纳米） | 0 | 40 |
| 西格玛 X （nm） （通道 0， 640 nm 激光） | 100 | 350 |
| 西格玛 Y （nm） （通道 0， 640 nm 激光） | 100 | 350 |
| Sigma X （nm） （通道 1， 473， 561 nm 激光器） | 100 | 350 |
| 西格玛 Y （nm） （通道 1， 473， 561 nm 激光器） | 100 | 350 |
| 帧索引 | 0 | 10,000 |
表1：3-DDSTORM采集过程中超分辨率显微镜的参数。
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Discussion
EV已成为一个受欢迎的研究领域，因为它们在许多细胞内过程和细胞间信号传导中起着重要作用1，30。然而，它们的可视化被证明是困难的，因为它们的小尺寸低于光学显微镜的衍射极限。直接随机光学重建显微镜（dSTORM）是一种直接的可视化方法，它通过捕获单个荧光团随时间推移的光开关事件并根据这些闪烁事件重建图像来绕过衍射极限21，31。超分辨率显微镜已成功在几种细胞结构上进行3D，例如肌动蛋白丝，微管，嵌入质膜中的受体以及感染细胞中的病毒蛋白32，33，34，35，36。本研究的目的是评估超分辨率显微镜（特别是dSTORM）以纳米分辨率在3D中可视化EV的功效。我们采用光开关膜插层染料，成功地将来自U2OS细胞的单个EV可视化到dSTORM，在XY轴上分辨率高达+/- 20 nm，在Z轴上分辨率高达+/- 50 nm。我们之前的研究表明，来自多个细胞系和初级流体的EV具有与NTA和TEM26，37分析的相似的尺寸分布曲线。使用基于dSTORM的电动汽车表征可以进一步增强这种现象的信心，并可能在单个视野中识别亚群。有必要进一步完善此方法。dSTORM的一个显着优点是样品制备不需要可能改变EV结构的苛刻或破坏性步骤。我们的研究结果进一步表明，在用抗CD81珠和酸性甘氨酸26，37纯化EV期间保持EV的生化性质。我们用多聚甲醛固定EV，以避免由甲醇和乙醇等其他固定剂引起的膜透化。这使我们能够得出结论，dSTORM准确地捕获了存在于溶液中的EV的形态。然而，使用Capto Core 700是必要的，以有效地净化电动汽车，使其远离白蛋白和聚乙二醇等污染物，使其低于监管要求38。该协议的一个显着限制是EV和载玻片之间的结合效率不是100%，因此在样品制备过程中会丢失一些EV。应进一步研究涂覆粘合剂的载玻片的功效，以更好地结合EV。
虽然用于可视化的EV的制备非常简单，但采集过程中的参数，特别是在采集后修改期间，根据EV和荧光团的强度和稳定性，每个样品的参数差异很大。实验中可变性的一个方面是激发激光器的强度，在整个曝光过程中必须小心地提高，以最大化信号，同时防止光漂白。光漂白，或者当荧光团失去其荧光能力时，在整个超分辨率显微镜12，39中是一个显着的限制。为了防止光漂白，缓冲液中酶的浓度可以增加到10mM，以更好地清除氧化分子并防止光漂白。此外，将激发激光功率设置为较低的初始水平并在整个曝光过程中缓慢升高以保持高信号对于防止光漂白至关重要。
我们选择了一种红色的可光开关染料来染色电动汽车，因为它的激发波长，耐用性和耐受固定的能力29。然而，我们选择的染料在超分辨率显微镜下，当激发太快或强度过高时，可能会出现问题。光开关红膜染料中的荧光团可以在10，000帧后或激光功率超过75.6 mW后光漂白。此外，膜染料的强度和荧光能力在4°C下储存一周后显着降低。 最后，膜插层染料已被证明在水溶液中形成胶束，因此纯化后EV样品中仍然存在的任何过量染料都可能被检测到，并且如果没有其他标记物来识别EV，例如四西班牙蛋白，则可能被误认为EV。应使用其他膜插层染料进行进一步研究，以优化光稳定性31，40。与EV偶联的荧光抗体可能是一个更合适的选择，因为它们往往对光漂白更具抵抗力并且可以放大信号41。然而，抗体的缺点是，由于与抗体上的表位和荧光团的距离，来自荧光团的信号与EV略有偏移。
现有的EV可视化和表征方法，如NTA，流式细胞术或EM，可能需要破坏性的制备步骤，或者是间接的可视化方法。dSTORM几乎不需要样品制备，保留了EV的天然生化性质，是一种直接的可视化方法，可以绕过衍射极限，可视化小直径8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，21， 26.超分辨率显微镜的其他技术可以针对EV表征进行优化，例如受激发射耗尽（STED），旋转盘共聚焦显微镜（SDCM）和光激活定位显微镜（PALM）42，43。目前的研究仅关注dSTORM，但未来需要优化超分辨率显微镜并比较/对比这些技术。电动汽车最近已成为一个受欢迎的研究领域，因为它们在病毒进展中的作用变得更加明显。许多进化上不同的病毒，如爱泼斯坦巴尔病毒，HIV和甲型肝炎病毒，已经进化到利用EV信号通路来促进疾病进展并逃避身体的免疫反应37，44，45，46，47，48，49，50.这些病毒已被证明将病毒因子（如mRNA或病毒蛋白）结合到EV中，然后可以将这些成分转移到未感染的细胞中，同时逃避免疫检测6，51，52，53。这些外泌体相关的病毒因子可以被检测到，并可能被用作疾病进展的生物标志物54，55。因此，可以探索基于dSTORM的单个EV及其相关蛋白质的可视化，作为疾病生物标志物的平台，也许还可以探索某些病毒的疾病进展54，55。应进行进一步的研究，以评估dSTORM在可视化EV内的内容物及其膜上的蛋白质方面的效用。
总之，我们已经证明，超分辨率显微镜应被视为以纳米分辨率以3D方式可视化EV的有效技术。通过dSTORM获得的结果与其他EV表征技术一致。dSTORM的一个明显优势是能够直接可视化光衍射极限下的颗粒，而不会发生可能改变电动汽车生化性质的脱水或冻结断裂步骤。
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Disclosures
M.G.C.没有利益冲突需要声明。R.P.M和D.P.D.获得Oxford Nanoimaging （ONI） Inc.和Cytiva Inc.（前身为GE Healthcare）的材料支持。R.P.M.和D.P.D.宣布对所提供的某些信息可能商业化的竞争利益。这些由北卡罗来纳大学管理。资金来源不参与本手稿的解释或写作。
Acknowledgments
我们要感谢Oxford Nanoimaging的建设性反馈和指导。这项工作由5UM1CA121947-10资助给R.P.M.和1R01DA040394给D.P.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
References
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