Summary
Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) används för att kringgå den typiska diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi och för att visa exosomer på nanometerskalan. Det kan användas i både två och tre dimensioner för att karakterisera exosomer.
Abstract
Extracellulära blåsor (EVs) frigörs av alla celltyper och spelar en viktig roll i cellsignalering och homeostas. Visualiseringen av EVs kräver ofta indirekta metoder på grund av deras lilla diameter (40-250 nm), vilket ligger under diffraktionsgränsen för typisk ljusmikroskopi. Vi har utvecklat en mikroskopibaserad visualisering av EL-apparater med superupplösning för att kringgå diffraktionsgränsen i både två och tre dimensioner. Med den här metoden kan vi lösa den tredimensionella formen av EVs till inom +/- 20 nm upplösning på XY-axeln och +/- 50 nm upplösning längs Z-axeln. Sammanfattningsvis föreslår vi att superupplösningsmikroskopi betraktas som en karakteriseringsmetod för EVs, inklusive exosomer, samt höljevirus.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är membranbundna blåsor som frigörs av alla celltyper. De innehåller lipider, proteiner, metaboliter och nukleinsyror och överför dessa material lokalt mellan celler och distally mellan vävnader och organ. Det finns tre primära undertyper av EVs: apoptotiska kroppar, mikrovesicles och exosomer1,2. Här fokuserar vi vår diskussion på exosomer och deras tillhörande proteiner.
Exosomer är utsöndrade blåsor som härrör från inåtgående spirande av tidiga endosomer i den multivesikulära kroppen (MVB). MVB smälter sedan samman med plasmamembranet och släpper ut exosomerna i det extracellulära utrymmet för att resa till andra celler3,4. Exosomer finns på ett spektrum av storlekar från 40 till 150 nm och är berikade med endosomala transmembranproteiner som kallas tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbunden endosomal sorteringskomplex som krävs för transporten (ESCRT) och lipidflotteassocierade proteiner1,2,5,6,7.
Att karakterisera exosomernas biokemiska sammansättning har blivit ett populärt område för forskare att bättre förstå deras funktionella natur. Många metoder finns för att visualisera och karakterisera exosomer, inklusive nanoskala flöde cytometri, nanopartikelspårningsanalys (NTA), skannings- och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ytplasmonresonans, resistiv pulsavkänning och traditionell ljusmikroskopi, som var och en innehåller inneboende fördelar och nackdelar8,9. TEM och cryo-EM kan uppnå nanometerbaserad upplösning, men kräver ofta uttorkning och frysfraktursteg och därmed krymper eller lysar EVs10,11. NTA förlitar sig på ljusspridning, vilket möjliggör karakterisering av hundratals EVs åt gången, men är en indirekt mätning av partikelstorlek och kan inte enkelt skilja mellan EVs, virus och proteinaggregat12,13,14,15,16. Nanoskala flöde cytometri använder ljusspridning från en excitationsväg, som sedan kan översättas till storleksmätningar, men är en framväxande teknik, och det finns lite konsensus om vilken storlek på partiklar som ligger inom det linjära detektionsområdet för olika instrument12,17,18.
Traditionell ljusmikroskopi med fluorescerande proteiner eller färgämnen har varit en av de mest använda teknikerna för att visualisera subcellulära fack, proteinkomplex och signalmaskiner i en cell. Medan denna teknik visar sig användbar för att visualisera lokalisering av komplex, förhindrar diffraktionsgränsen för traditionell ljusmikroskopi (cirka 250-400 nm) den tydliga upplösningen av proteiner eller strukturer i det typiska storleksområdet för en exosom (40-150 nm)12,19,20.
Superupplösningsmikroskopi, nämligen direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM), skiljer sig från konventionell ljusmikroskopi genom att använda de fotowitchable egenskaperna hos specifika fluoroforer och upptäcka dessa blinkande händelser för att rekonstruera bilder ner till nanometerprecision21. Fotowitching händelser samlas in med hjälp av en hög-framerate detekteringskamera under loppet av tiotusentals individuella exponeringar, och en punktspridningsfunktion används för att med hög säkerhet kartlägga den exakta platsen för den fotowitching fluorophore19,20,22. Detta gör det möjligt för dSTORM att kringgå diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Flera grupper har rapporterat användningen av superupplösningstekniker för att visualisera och spåra exosomer och deras associerade proteiner22,23,24,25. Den slutliga upplösningen beror på fluoroforens biofysiska egenskaper, men sträcker sig ofta från +/-10-100 nm längs XY-axeln, vilket möjliggör enmolekylsupplösning.
Förmågan att lösa enskilda fluoroforer i denna skala på XY-axeln har revolutionerat mikroskopi. Det finns dock lite data om den tredimensionella (3D) dSTORM av en exosom. Därför försökte vi upprätta ett standardförfarande (SOP) för dSTORM-baserad visualisering och karakterisering av renade EVs, inklusive exosomer till nanometerprecision i 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Spridning och underhåll av cellinjer
- Förvärva humana osteosarkomceller (U2OS) och placera cellerna i tillväxtmediet kompletterat med 10% exosomfritt fetalt bovinserum och 1x Penicillin/Streptomycin lösning.
OBS: Exosomfria fetala nötkreatur serum genererades efter protokollet presenteras i McNamara et. al.26. - Håll U2OS-cellerna i en kopparbelagd inkubator vid 37 °C i 5% CO2 och passageceller i T175-flaskorna26,27. Cellerna måste bibehållas i mitten av logaritmisk tillväxtfas för att förhindra att subpopulationer uppstår eller från ackumulering av apokatiska skräp under den stationära fasen.
2 Exosom isolering och rening
- Odla U2OS-cellinjerna till full sammanflöde i 10 separata T175-flaskor med 50 ml media per kolv. Ta bort cellens supernatant och passera den successivt genom en vakuumfiltreringsapparat på 0,45 μm och 0,22 μm.
- Utsätt supernatanten för korsflödesfiltrering (även känd som tangentiell flödesfiltrering) på ett filtreringssystem utrustat med 750 kDa ihålig fiberpatron för att avlägsna mindre proteiner eller metaboliter28.
- Passera supernatanten genom tangentiell flödesfiltreringsoperatör vid ett konstant framåttryck på 30 psi, samtidigt som ett retentionstryck på <20 psi bibehålls för att producera ett Δ-tryck på 10 eller mer psi. Placera en magnetisk omrörning i återintenttanken och ställ in den på 150varv/min 26.
- Håll matningshastigheten på 40 ml/min eller högre. Samla in genomträngeret i en reservoar och kassera det.
- Koncentrera supernatanten till 30 ml och balansera sedan med fyra volymer 1x PBS. Samla in korsflödet filtrerad och ekvilibrerad lösning i ett koniskt rör på 50 ml.
- Fäll ut EL-fordonen vid 4 °C över natten i en slutlig koncentration av 40 mg/ml polyetylenglykol med en molekylvikt på 8 000 Da. Centrifugera EV:erna vid 1 200 x g vid 4 °C i 1 timme och återsuspend i 500 μL 1x PBS.
- Inkubera EL-fordonen med 50 μg/ml fotowitchable rött membran intercalating färgämne och 50 μg/ml RNase A i 1x PBS vid 4 °C för 1 h.
- Ta bort överflödigt färgämne genom en kolumn på ett proteinreningssystem som är fäst vid en fraktionsamlare. Identifiera EV-fraktioner genom UV-absorbans och slå samman dem i ett mikrocentrifugerör26.
- Affinitet-välj totalt 200 μL EVs med anti-CD81 magnetiska pärlor som är ekvilibrerade i 1x PBS.
- Späd 100 μL av anti-CD81 magnetiska pärlor i 1x PBS till en total volym av 1 ml och låt dem binda vid 4 °C i 2 h i ett 2 mL mikrocentrifugerör med kontinuerlig gungning.
- Tvätta anti-CD81 pärlor och EV tre gånger med 1x PBS. Elute CD81+ EV från lösningen med 100 mM Glycin vid pH 2.0 i 30 min vid 37 °C.
- Pipettera den renade CD81+ EV till en lika stor volym på 100 mM Tris-HCl vid pH 7,5 i 1x PBS.
OBS: En alikvot renad CD81+ EV-lösning kan reserveras för nanopartikelspårningsanalys eller elektronmikroskopi för att bekräfta renheten hos lösningen och närvaron av EL26.
3 Fixering och förberedelse
- Placera affinitetsrenade EL-apparater på glasbotten μ-skjut 8-brunnsplattor i en total volym av 200 μL (kan späda EV-provet i 100 mM Tris-HCl vid pH 7,5 i 1x PBS) och låt hålla fast vid ytan över natten vid 4 °C.
- Utan att ta bort den befintliga lösningen från 8-brunnsplattan, fixera EVs på plattorna genom att tillsätta 200 μL 4% paraformaldehyd i 1x PBS till ev-innehållande lösning i varje brunn och låt inkubera i 30 min vid rumstemperatur21.
- Ta försiktigt bort paraformaldehyd och överskottslösning med en mikropipette för att inte störa EL:erna. Tvätta EV med 1x PBS för att avlägsna överskott av paraformaldehyd. Utför tvättproceduren tre gånger. Ta bort överflödig 1x PBS.
- Förbered 250 μL dSTORM B-kubiserad buffertlösning per prov genom att skapa en lösning på 5 mM protocatechuate dioxygenas (del A) utspädd i bildbuffert (del B) enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Koncentrationen av enzymet i bufferten kan fördubblas till 10 mM om fotobleaching inträffar.- Tillsätt 250 μL av den beredda bufferten till varje brunn enligt tillverkarens protokoll i 20 minuter vid rumstemperatur före avbildning för att rensa oxiderande molekyler.
OBS: EV kan sedan antingen ses omedelbart eller förvaras vid 4 °C i upp till en vecka. Ersätt bufferten efter lagring före varje visualisering.
- Tillsätt 250 μL av den beredda bufferten till varje brunn enligt tillverkarens protokoll i 20 minuter vid rumstemperatur före avbildning för att rensa oxiderande molekyler.
4 Direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi kalibrering
- Förbered de pärlor som krävs för kalibrering av superupplösningsmikroskopet genom att späda ut 100 nm mikrosfärer till en koncentration av 0,5% i molekylärbiologisk vattenkvalitet och pipettera 200 μL i varje brunn i en glasbotten μ-slide 8-brunnsplatta.
- Låt pärlorna bosätta sig i brunnarna i 1 h vid rumstemperatur.
- Utan att ta bort den befintliga lösningen, tillsätt 200 μL 4% paraformaldehyd i PBS till varje brunn till kalibreringspärlalösningen och låt inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort paraformaldehyden med en mikropipette för att inte störa pärlorna och tvätta pärlorna tre gånger med 1x PBS. Förbered bufferten enligt steg 3.4.
- Ta bort 1x PBS och tillsätt 250 μL av den beredda bufferten till varje brunn. Låt bufferten sitta i 20 minuter före visualisering.
- Innan du placerar något på scenen, anslut till 3D-mikroskopet med knappen Anslut mikroskopet. Tillsätt 100x olja till målet och placera mitten av brunnen ovanpå målet. Slå på excitationslasrarna 473 och 640 nm i inställningen Hämta och klicka på Visa.
- Utan 3D-objektivet aktiverat visar du pärlorna under inställningen fotonmättnad genom att klicka på Fotonantal i alternativen för bildvisning. Ställ in de ursprungliga laserkrafterna på 8,4 mW för 473 nm-lasern och på 11,6 mW för 640 nm-lasern.
- Minska laserns fokus till cirka -300 nm eller kalibreringspärornas brännplan för att producera en tydlig upplösning av de enskilda pärlorna. När Z-planet är fokuserat justerar du lasereffektnivåerna ytterligare för att ta hänsyn till variationen i varje synfält.
- Under instrumentfunktionerna slutför du kalibrering av 3D-mappning och kanalmappning för att få felen på X-, Y- och Z-axeln. Ställ in det maximala antalet FOV:er till 20, målantalet punkter till 4 000, det maximala avståndet mellan kanalerna till 5,0 bildpunkter och uteslutningsradien mellan kanalerna till 10,0 pixlar under kalibrering av kanalmappning.
- Se till att kalibreringen ger en punkttäckning på >90% och kartkvalitet som är bra. Spara givna kalibreringsdata för framtida bildförvärv.
5 Visualisering av EV i tre dimensioner
- Tillsätt 100x olja på målet och placera de beredda EL:erna i mikroskopet. Utan 3D-linsen aktiverad, slå på 640 nm excitationslaser och höj den initialt till mellan 1,2 mW och 12,5 mW beroende på intensiteten i signalen och synfältet för att excitera det röda membranet intercalating färgämne färgat EVs.
- Under alternativen bildvisning växlar du visningsmetoden från fotonmättnad till percentiler för att bättre visualisera EVs. Justera lasereffekten för att minimera bruset och samtidigt maximera signalen. Behåll alla andra parametrar.
- Justera Z-planets fokus genom att klicka på upp- eller nedikonen på Z-axeln.
OBS: Z-planet bör fokuseras mellan -200 och -350 nm, men varierar beroende på synfältet.
- Ställ in exponeringstiden på 20 ms, bildrutan fånga på 10 000 bildrutor och den ursprungliga lasereffekten till mellan 1,2 mW och 12,5 mW, eller lasereffekten som bestäms i steg 5.1, beroende på signalens intensitet och synfält.
- Aktivera 3D-objektivet med ikonen och starta förvärvet genom att klicka på knappen Hämta.
- Under hela bildförvärvet höjer du lasereffekten med 3 steg om 10 var 1 000:e bildrutor, eller tillräckligt för att upprätthålla ett högt signal-till-brus-förhållande. Justera inte Z-planet under förvärvet.
OBS: Lasern kan höjas till maximalt 90 mW lasereffekt.
6 Ändring efter förvärv och EV-spårning
- Efter bildförvärvet växlar du över till visningsfönstret Analysera. Utför driftkorrigering på den ofiltrerade bilden och aktivera sedan filter. Justera fotonantal, lokaliseringsprecision, sigmas och ramindex enligt tabell 1.
- Överlagra ett XYZ-planvyverktyg längs X-axeln för enskilda EVs från synfältet och exporten . CSV filer av fotowitching händelser.
- Dela enskilda EVs på XY-axeln i ett X x Y-synfält med hjälp av ett linje histogramverktyg, som bins photoswitching händelser i inställda avståndsgrupper.
- Ta bilder av enskilda EVs och spara dem som .tiff filer.
- Skapa 3D-videor med enskilda EL-fordon med ett 3D-visualiseringsverktyg och färg enligt placering längs Z-axeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denna studie var att utvärdera effektiviteten av superupplösningsmikroskopi vid visualisering av enskilda EVs med nanometerupplösning i tre dimensioner (3-D). För att analysera formen och storleken på enskilda EVs använde vi fotowitchable färgämne och inkuberade EVs med ett långt rött, membran intercalating färgämne och tog bort överflödigt färgämne genom kromatografi29. Affinitet-fångade anti-CD81 och röd-färgade EVs visades sedan i superupplösning mikroskop under 640 nm excitation laser. Efter kalibreringen av mikroskopet som gav ett genomsnittligt fel på 16 nm på XY-axeln och 38 nm på Z-axeln (figur 1A, B), visualiserades de renade U2OS-EVs framgångsrikt med en upplösning på upp till 20 nm på XY-axeln och 50 nm längs Z-axeln.
Enskilda EVs visualiseras genom dSTORM i 3D-bilderwitched under hela 10,000 frame exponering som laser kraften ökade och var lätt uppenbara i den förvärvade bilden (figurerna 2A, B). Efter förvärvet av bildkorrigering av Z-planet, fotonräkningar, sigmas och lokaliseringsprecision för den rekonstruerade bilden med möjlig att ev i 3D (figur 2C, D). EV i figur 2C-bilderwitched under endast de första 7 000 bildrutorna, som ses av legenden i det övre högra hörnet. Detta är ett resultat av fotobleaching som kan ha orsakats av att lasereffekten höjde för snabbt. Histogrammet bekräftar att majoriteten av fotowitching händelser inträffade inom en radie av 100 nm (figur 2E), validerar att den visualiserade EV är en exosome och att isoleringen av EVs med liten diameter lyckades.
Storleksfördelningsanalys utfördes på andra individuellt spårade EVs med hjälp av ett linje histogram verktyg och XYZ planvy verktyg för att bekräfta att majoriteten av fotowitching händelser inträffade inom en radie av 100 nm från mitten (figur 3A, C), ytterligare validera dSTORM förmåga att visualisera EVs med en liten diameter. Som framgår av ett 3D-visualiseringsverktyg ökar felet längs Z-axeln, vilket ger en långsträckt slutlig bild av EV längs axialaxeln (figur 3D, video 1). Fotowitching händelser var inte korrelerade med EV storlek (figur 3E), visar att dSTORM-baserade karakterisering kan användas för små EVs såsom exosomer och små höljen virus mindre än 100 nm i diameter.
De korrekta parametrarna för Z-plan och sigma är integrerade i membranets korrekta upplösning i 3D. Dessutom är rätt exponeringstid, antal bilder som fångas och initial lasernivå avgörande för att producera en bild av en enskild EV med ett löst membran. Ytterligare undersökningar bör göras om hur man optimerar mikroskopet och ställer in både parametrar före och efter förvärvet för att fånga bilder med högsta upplösning av EVs.
Bild 1: Kalibrering av superupplösningsmikroskopet i tre dimensioner med hjälp av 100 nm mikrosfärer. Skalningslist längst ner till höger. (B) Absoluta kalibreringsfel på XY-axeln och Z-axeln erhölls genom kanalkartläggningskalibrering respektive 3D-mappningskalibrering. N = 10 biologiska replikat. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: dSTORM av en enda EV i tre dimensioner. (A) Gråskala synfält av CD81 + affinitetsrenade EVs färgade med fotowitchable rött membran intercalating färgämne och upphetsad med 640 nm excitation laser. Skalningslist längst ner till höger. (B) Synfält från A märkt enligt kanalfärg. (C) Enkel EV från den inzoomade vyn av den vita rutan i A, märkt enligt ramindexet. Värmekartan längst upp till höger anger ramen där fotowitching-händelserna spelades in. Skalningslist längst ner till höger. (D) EV från C märkt enligt kanalfärg. (E) Storleksfördelningsanalys skapades genom att dela ev på den streckade linjen som visas i D och separera fotowitching händelsen i 15,4 nm behållare med hjälp av ett linje histogram verktyg. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Fördelning av fotowitching händelser under förvärvet av en enda EV i tre dimensioner. (A) Rekonstruerad bild av en CD81 + affinitetsrenad EV märkt med fotowitchable rött membran intercalating färgämne och upphetsad med 640 nm excitation laser. Skalningslist längst ner till höger. (B) Låda och whisker plot med genomsnittliga diametrar av CD81 + affinitetsrenade EVs erhållna med hjälp av mikroskopets linje histogramverktyg längs XY-axeln. (medelvärde = 104 nm, standardavvikelse = 28 nm). (C) Placering av enskilda fotowitching händelser längs XY dimensionen av EV i A, inspelad under hela 10,000 ram exponering. ( D) Placering av enskilda fotowitching händelser längs XZ-axeln av EV i A, inspelad under hela 10,000 bildtext exponering. (E)Spridning av antalet fotowitching händelser som registrerats på enskilda EVs med varierande diametrar. R-kvadratiskt värde på 0,1065 visar inget samband mellan antalet upptäckta fotowitching händelser och EV diameter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Video 1: 3D-bild av en enda CD81 + affinitetsrenad EV märkt med fotowitchable rött membran intercalating färgämne och upphetsad med 640 nm excitation laser. Färgschemat är märkt efter djup längs Z-axeln. Felet längs Z-axeln är långsträckt. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Variabel | Min | Max |
| Antal foton | 200 | 10,000,000 |
| Z-position (nm) | -300 | 300 |
| Lokaliseringsprecision X (nm) | 0 | 40 |
| Lokalisering Precision Y (nm) | 0 | 40 |
| Precision Sigma X (nm) | 0 | 40 |
| Precision Sigma Y (nm) | 0 | 40 |
| Sigma X (nm) (Kanal 0, 640 nm laser) | 100 | 350 |
| Sigma Y (nm) (Kanal 0, 640 nm laser) | 100 | 350 |
| Sigma X (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lasrar) | 100 | 350 |
| Sigma Y (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm lasrar) | 100 | 350 |
| Ramindex | 0 | 10,000 |
Tabell 1: Parametrar för superupplösningsmikroskopet vid 3D-dSTORM-förvärv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EVs har blivit ett populärt studieområde på grund av deras viktiga roll i många intracellulära processer och cell-till-cell-signalering1,30. Deras visualisering visar sig dock vara svår eftersom deras lilla storlek faller under diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) är en direkt visualiseringsmetod som kringgår diffraktionsgränsen genom att fånga fotowitching händelser av enskilda fluoroforer över tiden och rekonstruera en bild baserat på dessa blinkande händelser21,31. Superupplösningsmikroskopi har framgångsrikt utförts i 3D på flera cellulära strukturer som aktinfilament, mikrotubuli, receptorer inbäddade i plasmamembranet och virusproteiner i infekterade celler32,33,34,35,36. Syftet med denna studie var att utvärdera effekten av superupplösningsmikroskopi, särskilt dSTORM, för att visualisera EVs i 3D med nanometerupplösning. Vi använde fotowitchable membran intercalating färgämne för att framgångsrikt visualisera enskilda EVs från U2OS celler genom dSTORM i upp till +/- 20 nm upplösning på XY-axeln och +/- 50 nm upplösning på Z-axeln. Vårt tidigare arbete har visat att EVs från flera cellinjer och primära vätskor har liknande storleksfördelningsprofiler som analyseras av NTA och TEM26,37. Användningen av en dSTORM-baserad karakterisering av EVs kan ge ytterligare förtroende för detta fenomen, samt potentiellt identifiera subpopulationer inom ett enda synfält. Ytterligare förfining av denna metod är motiverad. En anmärkningsvärd fördel med dSTORM är att provberedningen inte kräver hårda eller skadliga steg som kan förändra strukturen hos EL-fordonen. Våra resultat visar vidare att den biokemiska karaktären hos EVs upprätthålls under EV-rening med anti-CD81 pärlor och sur glycin26,37. Vi fixade EVs med paraformaldehyd för att undvika membranpermeabiliseringar orsakade av andra fixativ som metanol och etanol. Detta gjorde det möjligt för oss att dra slutsatsen att dSTORM korrekt fångar morfologin hos EVs som de finns i lösningen. Användningen av Capto Core 700 är dock nödvändig för att effektivt rena elfordonen från föroreningar som albumin och polyetylenglykol till under lagstadgade krav38. En anmärkningsvärd begränsning av protokollet är att bindningseffektiviteten mellan EV och diabilder inte är 100%, så vissa EVs går förlorade under provberedning. Ytterligare undersökning bör göras på effekten av självhäftande belagda diabilder för att bättre binda EVs.
Även om det är enkelt att förbereda elfordon för visualisering, varierar parametrarna under förvärvet och särskilt vid ändringar efter förvärvet avsevärt från prov till prov, beroende på intensiteten och stabiliteten hos elfordon och fluorofor. Ett område med variabilitet i experimentet är intensiteten hos excitationslasrarna som måste höjas försiktigt under exponeringen för att maximera signalen men förhindra fotobleaching. Fotobleaching, eller när en fluorofor förlorar sin förmåga att fluorescera, är en betydande begränsning i hela superupplösningsmikroskopi12,39. För att förhindra fotobleaching kan koncentrationen av enzymet i bufferten ökas till 10 mM för att bättre rensa oxiderande molekyler och förhindra fotobleaching. Dessutom är det viktigt att ställa in excitationslasereffekten på en låg initial nivå och långsamt höja den under hela exponeringen för att upprätthålla en hög signal för att förhindra fotobleaching.
Vi valde ett rött fotowitchable färgämne för att färga EVs på grund av dess excitation våglängd, hållbarhet och förmåga att motstå fixering29. Färgämnet vi valde kan dock presentera problem under superupplösningsmikroskopi när det är upphetsad för snabbt eller med för hög intensitet. Fluoroforerna i det fotoskrivbara röda membranfärgen kan fotoblechera efter 10 000 bilder eller efter att lasereffekten överstiger 75,6 mW. Dessutom minskar membranfärgens intensitet och förmåga att fluorescera avsevärt efter en veckas lagring vid 4 °C. Slutligen har membraninterkalerande färgämnen visat sig bilda micelles i en vattenlösning, så alla överskott av färgämnen som fortfarande finns i EV-provet efter rening kan detekteras och misstas för en EV om det inte finns någon annan markör för att identifiera EV, såsom ett tetraspanin. Ytterligare undersökning bör göras med hjälp av andra membranintercalating färgämnen för att optimera för fotostabilitet31,40. Fluorescerande antikroppar som konjugeras till EV kan vara ett lämpligare alternativ eftersom de tenderar att vara mer motståndskraftiga mot fotobleaching och kan förstärka signalen41. Nackdelen med antikroppar är dock att signalen från fluoroforen är något förskjuten från EV på grund av avståndet från epitopen och fluoroforen på antikroppen.
Befintliga metoder för EV-visualisering och karakterisering, till exempel NTA, flödescytometri eller EM, kan kräva skadliga förberedelsesteg eller är indirekta visualiseringsmetoder. dSTORM kräver lite provberedning, bevarar den naturliga biokemiska karaktären hos EVs, och är en direkt visualiseringsmetod som kan kringgå diffraktionsgränsen och visualisera EVs med liten diameter8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Andra tekniker för superupplösningsmikroskopi kan optimeras för EV-karakterisering som stimulerad utarmning av utsläpp (STED), snurrande skivkonfokal mikroskopi (SDCM) och fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM)42,43. Den aktuella studien fokuserar uteslutande på dSTORM, men framtida arbete med att optimera superupplösningsmikroskopi och jämföra / kontrastera dessa tekniker är motiverat. EVs har nyligen blivit ett populärt forskningsområde eftersom deras roll i virusprogression har blivit tydligare. Många evolutionärt distinkta virus, såsom Epstein Barr Virus, HIV, och Hepatit A Virus, har utvecklats för att dra nytta av EV-signaleringsvägarna för att främja sjukdomsprogression och undvika kroppens immunsvar37,44,45,46,47,48,49,50 . Dessa virus har visat sig införliva virusfaktorer, såsom mRNAs eller virusproteiner, i EVs som sedan kan överföra dessa komponenter till oinfekterade celler, samtidigt som immundetektering6,51,52,53. Dessa exosomala associerade virusfaktorer kan detekteras och eventuellt användas som biomarkör för sjukdomsprogression54,55. Därför kan dSTORM-baserad visualisering av enskilda EVs och deras associerade proteiner utforskas som en plattform för sjukdomsbiomarkörer och kanske sjukdomsprogression av vissa virus54,55. Ytterligare forskning bör göras för att bedöma dSTORM: s nytta för att visualisera både innehåll inom en EV och proteiner på membranet.
Sammanfattningsvis har vi visat att superupplösningsmikroskopi bör betraktas som en effektiv teknik för visualisering av EVs i 3D med nanometerupplösning. Resultat som erhålls av dSTORM överensstämmer med andra EV-karakteriserande tekniker. En tydlig fördel med dSTORM är förmågan att direkt visualisera partiklar under ljusets diffraktiongräns utan uttorkning eller frysa fraktursteg som kan förändra EVs biokemiska natur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.G.C har inga intressekonflikter att deklarera. R.P.M och D.P.D. får materiellt stöd från Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. och Cytiva Inc. (tidigare GE Healthcare). R.P.M. och D.P.D. förklarar konkurrerande intressen för en eventuell kommersialisering av en del av den information som presenteras. Dessa förvaltas av University of North Carolina. Finansieringskällorna var inte involverade i tolkningarna eller skrivandet av detta manuskript.
Acknowledgments
Vi vill tacka Oxford Nanoimaging för deras konstruktiva feedback och vägledning. Detta arbete finansierades av 5UM1CA121947-10 till R.P.M. och 1R01DA040394 till D.P.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
References
- Pegtel, D. M., Gould, S. J.
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C.
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
- Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
- Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
- Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
- Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
- Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
- Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
- Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
- Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
- Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
- Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
- Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
- McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
- Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
- Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
- Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
- Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
- Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
- Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
- Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
- Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
- Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
- Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
- Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
- Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).
