Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي للحوالق خارج الخلية في ثلاثة أبعاد

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

يستخدم المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) لتجاوز حد الحيود النموذجي للتنظير المجهري للضوء وعرض الاكسوسومات على مقياس النانومتر. ويمكن استخدامه في كل من البعدين وثلاثة لتوصيف exosomes.

Abstract

يتم تحرير الحويصلات خارج الخلية (EVs) من قبل جميع أنواع الخلايا وتلعب دورا هاما في إشارات الخلايا و التوازن. غالبا ما يتطلب تصور المركبات الكهربائية طرقا غير مباشرة بسبب قطرها الصغير (40-250 نانومتر) ، والذي هو تحت حد الحيود للتنظير الضوئي النموذجي. لقد طورنا تصورا فائق الدقة قائم على المجهر للمركبات الكهربائية لتجاوز حد الحيود في بعدين وثلاثة أبعاد على حد سواء. باستخدام هذا النهج، يمكننا حل شكل ثلاثي الأبعاد من المركبات الكهربائية إلى داخل +/- 20 نانومتر القرار على محور س ص و +/- 50 نانومتر القرار على طول المحور Z. في الختام، نقترح أن يعتبر الفحص المجهري فائق الدقة كطريقة توصيف للمركبات الكهربائية، بما في ذلك الإكسوسومات، وكذلك الفيروسات المغلفة.

Introduction

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات المرتبطة بالغشاء الصادرة عن جميع أنواع الخلايا. أنها تحتوي على الدهون والبروتينات والأيض والأحماض النووية ونقل هذه المواد محليا بين الخلايا وdistally بين الأنسجة والأعضاء. هناك ثلاثة أنواع فرعية أساسية من المركبات الكهربائية: الهيئات المبرمج، microvesicles، وإكسوسومات1،2. هنا، نركز مناقشتنا على الإكسوسومات والبروتينات المرتبطة بها.

يتم إفراز الحويصلات الخارجية الناشئة من الداخل الناشئة من الاندوسومات المبكرة في الجسم متعدد المركبات (MVB). ثم يندمج MVB مع غشاء البلازما ، ويطلق الإكسوسومات في الفضاء خارج الخلية للسفر إلى خلايا أخرى3،4. Exosomes موجودة على مجموعة من الأحجام تتراوح بين 40 إلى 150 نانومتر ويتم إثراء مع بروتينات ترانسممبران الاندوسومال المعروفة باسم tetraspanins (CD9، CD63، CD81)، مجمع الفرز الاندوسومالية المرتبطة بالغشاء المطلوبة للنقل (ESCRT)، والبروتينات المرتبطة طوف الدهون1،2،5،6،7.

أصبح توصيف التركيبة الكيميائية الحيوية للإكسوسومات مجالا شائعا للباحثين لفهم طبيعتهم الوظيفية بشكل أفضل. توجد العديد من الطرق لتصور وتميز exosomes ، بما في ذلك قياس التدفق النانوي ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، والمسح الضوئي ونقل المجهر الإلكتروني (TEM) ، وصدى البلازمون السطحي ، واستشعار النبض المقاوم ، والمجهر الخفيف التقليدي ، كل منها يحتوي على إيجابيات وسلبيات جوهرية8،9. TEM و cryo-EM يمكن تحقيق القرار القائم على نانومتر، ولكن غالبا ما تتطلب الجفاف وتجميد كسر الخطوات، وبالتالي تقليص أو lysing المركبات الكهربائية10،11. يعتمد NTA على تشتت الضوء ، مما يسمح بتحديد خصائص مئات المركبات الكهربائية في وقت واحد ، ولكنه قياس غير مباشر لحجم الجسيمات ولا يمكنه التمييز بسهولة بين المركبات الكهربائية والفيروساتومجاميع البروتين12و13و14و15و16. يستخدم قياس التدفق الخلوي النانوي الضوء المتناثر من مسار الإثارة ، والذي يمكن ترجمته بعد ذلك إلى قياسات الحجم ، ولكنه تقنية ناشئة ، وهناك القليل من الإجماع حول حجم الجسيمات ضمن النطاق الخطي للكشف عن الأدوات المختلفة12و17و18.

كان المجهر الخفيف التقليدي باستخدام البروتينات الفلورية أو الأصباغ أحد التقنيات الأكثر توظيفا لتصور المقصورات دون الخلوية ومجمعات البروتين وآلات الإشارات داخل الخلية. في حين أن هذه التقنية تثبت فائدتها في تصور توطين المجمعات ، فإن حد الحيود للتنظير المجهري الخفيف التقليدي (حوالي 250-400 نانومتر) يمنع الدقة الواضحة للبروتينات أو الهياكل في نطاق الحجم النموذجي للإكسوسوم (40-150 نانومتر)12،19،20.

المجهر فائق الدقة ، وهي المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي (dSTORM) ، يميز نفسه عن المجهر الضوئي التقليدي من خلال توظيف الخصائص القابلة للضوء للفلوروفوريس المحددة والكشف عن هذه الأحداث الوامضة لإعادة بناء الصور وصولا إلى الدقة نانومتر21. يتم جمع أحداث Photoswitching باستخدام كاميرا كشف عالية الإطار على مدار عشرات الآلاف من التعرض الفردي ، ويتم استخدام وظيفة انتشار نقطة لرسم خريطة بثقة عالية الموقع الدقيق للفلوروفور الساحرللضوء 19،20،22. وهذا يسمح dSTORM لتجاوز الحد الحيود من المجهر الخفيفة. وأفادت عدة مجموعات استخدام تقنيات فائقة الدقة لتصور وتتبع exosomes والبروتينات المرتبطة بها22،23،24،25. يعتمد القرار النهائي على الخصائص الفيزيائية الحيوية للفلوروفور ، ولكنه يتراوح في كثير من الأحيان من +/-10-100 نانومتر على طول محور XY ، مما يسمح بدقة جزيء واحد.

القدرة على حل الفلوروفوريس الفردية على هذا النطاق على محور XY قد أحدثت ثورة في المجهر. ومع ذلك ، هناك القليل من البيانات عن ثلاثي الأبعاد (3 - D) dSTORM من exosome. لذلك ، سعينا إلى إنشاء إجراء تشغيل قياسي (SOP) للتصور القائم على dSTORM وتوصيف المركبات الكهربائية النقية ، بما في ذلك exosomes إلى الدقة نانومتر في 3-D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 نشر وصيانة خطوط الخلايا

  1. الحصول على خلايا هشاشة العظام البشرية (U2OS) ووضع الخلايا في المتوسط النمو تستكمل مع 10٪ خالية من المصل البقري الجنين و1x البنسلين / Streptomycin الحل.
    ملاحظة: تم إنشاء مصل الأبقار الجنينية الخالية من Exosome بعد البروتوكول المقدم في مكنمارا وآخرون. آل26.
  2. الحفاظ على خلايا U2OS في حاضنة النحاس المغلفة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 وخلايا المرور في قوارير T17526،27. يجب الحفاظ على الخلايا في مرحلة النمو في منتصف اللوغاريتمي لمنع الملوثات الفرعية من النشأة، أو من تراكم الحطام المبرمج خلال المرحلة الثابتة.

2 عزلة إكسوسوم وتنقية

  1. تنمو خطوط الخلية U2OS إلى التقاء كامل في 10 قوارير T175 منفصلة مع 50 مل من وسائل الإعلام لكل قارورة. إزالة supernatant الخلية وتمريرها على التوالي من خلال جهاز الترشيح فراغ 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر.
  2. تخضع supernatant لترشيح التدفق العرضي (المعروف أيضا باسم ترشيح تدفق عرضي) على نظام الترشيح مجهزة 750 كيلودا خرطوشة الألياف المجوفة من أجل إزالة أصغر البروتينات أو الأيض28.
    1. مرور supernatant من خلال عامل الترشيح تدفق عرضية في ضغط مستمر إلى الأمام من 30 psi، مع الحفاظ على ضغط الاحتفاظ من <20 psi لإنتاج ضغط Δ من 10 أو أكثر من psi. ضع شريط تحريك مغناطيسي في خزان الرتنة وحدد إلى 150 دورة في الدقيقة26.
    2. حافظ على معدل التغذية عند 40 مل/دقيقة أو أعلى. جمع تتخلل في خزان والتخلص منه.
  3. ركز الفائق إلى 30 مل، ثم توازن مع أربعة مجلدات من برنامج تلفزيوني 1x. جمع حل التدفق العرضي تصفية ومتوازنة في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. عجل المركبات الكهربائية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها في تركيز نهائي من 40 ملغ / مل البولي ايثيلين غليكول مع الوزن الجزيئي من 8000 دا. الطرد المركزي في EVs في 1200 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وإعادة الإنفاق في 500 ميكروغرام من 1x PBS.
  5. احتضان المركبات الكهربائية مع 50 ميكروغرام / مل من صبغة الغشاء الأحمر القابلة للوورية المتشابكة و 50 ميكروغرام / مل من RNase A في برنامج تلفزيوني 1x عند 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  6. إزالة الصبغة الزائدة من خلال عمود على نظام تنقية البروتين تعلق على جامع كسر. تحديد الكسور EV من خلال امتصاص الأشعة فوق البنفسجية وتجمع لهم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق26.
  7. تقارب اختيار ما مجموعه 200 ميكرولتر من المركبات الكهربائية باستخدام الخرز المغناطيسي المضادة CD81 متساوية في برنامج تلفزيوني 1x.
    1. تمييع 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضاد للCD81 في برنامج تلفزيوني 1x إلى حجم إجمالي قدره 1 مل والسماح لهم بربط في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 مل مع هزاز مستمر.
  8. غسل الخرز المضادة CD81 وEV ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. Elute CD81 + EV من الحل مع 100 mM الجليسين في درجة الحموضة 2.0 لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  9. ماصة CD81 + EV تنقية في حجم متساو من 100 mM تريس-HCl في الرقم الحموضة 7.5 في برنامج تلفزيوني 1x.
    ملاحظة: قد يتم حجز a aliquot من محلول CD81 + EV المنقى لتحليل تتبع الجسيمات النانوية أو المجهر الإلكتروني من أجل تأكيد نقاء الحل ووجود المركبات الكهربائية26.

3 التثبيت والإعداد

  1. ضع المركبات الكهربائية المنقية للتقارب على لوحات 8-well ذات القاع الزجاجي μ بحجم إجمالي قدره 200 ميكرولتر (يمكن أن تمييع عينة EV في 100 mM Tris-HCl عند درجة الحموضة 7.5 في 1x PBS) والسماح بالتمسك بالسطح بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
  2. دون إزالة الحل الحالي من لوحة 8-جيدا، إصلاح المركبات الكهربائية على لوحات بإضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني 1x إلى الحل المحتوي على EV في كل بئر والسماح لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة21.
  3. إزالة بارافورمالدهيد بعناية والحل الزائد مع micropipette من أجل عدم إزعاج المركبات الكهربائية. غسل EV مع برنامج تلفزيوني 1x لإزالة paraformaldehyde الزائدة. إجراء عملية الغسيل ثلاث مرات. إزالة فائض 1x برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد 250 ميكرولتر من محلول المخزن المؤقت dSTORM B-مكعبات لكل عينة عن طريق إنشاء حل من 5 mM protocatechuate ديوكسيجيناز (الجزء أ) المخفف في المخزن المؤقت التصوير (الجزء باء) لكل بروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: قد يتضاعف تركيز الإنزيم في العازلة إلى 10 mM في حالة حدوث photobleaching.
    1. أضف 250 ميكرولتر من العازلة المعدة لكل بئر لكل بروتوكول الشركة المصنعة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير لمسح جزيئات مؤأكسدة.
      ملاحظة: يمكن بعد ذلك عرض EV على الفور أو تخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. استبدال المخزن المؤقت التالي التخزين قبل كل التصور.

4 معايرة المجهر البصري المباشر لإعادة الإعمار العشوائي

  1. إعداد الخرز اللازمة لمعايرة المجهر فائقة الدقة عن طريق تمييع 100 نانومتر ميكروسفير إلى تركيز 0.5٪ في البيولوجيا الجزيئية درجة المياه والأنابيب 200 ميكرولتر في كل بئر من الزجاج القاع μ الشريحة 8-لوحة جيدا.
    1. السماح للخرزات لتسوية في الآبار لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. دون إزالة الحل الحالي، إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر إلى حل حبة المعايرة والسماح لاحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة بعناية paraformaldehyde مع micropipette لعدم إزعاج الخرز وغسل الخرز ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x. قم بإعداد المخزن المؤقت وفقا للخطوة 3.4.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني 1x وإضافة 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعدة لكل بئر. السماح للمخزن المؤقت بالجلوس لمدة 20 دقيقة قبل التصور.
  5. قبل وضع أي شيء على المسرح، اتصل بالمجهر ثلاثي الأبعاد باستخدام زر توصيل المجهر. إضافة 100x النفط إلى الهدف ووضع مركز البئر على رأس الهدف. في الإعداد اكتساب، بدوره على الليزر 473 و 640 نانومتر الإثارة وانقر على عرض.
    1. بدون تنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد، اعرض الخرز أسفل إعداد تشبع الفوتون بالنقر على عدد الفوتونات في خيارات عرض الصور. تعيين القوى الليزر الأولية إلى 8.4 كيلوواط لليزر 473 نانومتر و 11.6 كيلوواط لليزر 640 نانومتر.
    2. تقليل تركيز الليزر إلى حوالي -300 نانومتر أو المستوى البؤري من حبات المعايرة لإنتاج دقة واضحة من الخرز الفردية. بمجرد تركيز الطائرة Z، قم بتعديل مستويات طاقة الليزر بشكل أكبر لمراعاة التباين في كل مجال من مجالات الرؤية.
  6. تحت وظائف الجهاز ، واستكمال معايرة رسم الخرائط ثلاثية الأبعاد ومعايرة رسم خرائط القناة للحصول على الأخطاء على المحور س ، ص ، و ض. تعيين الحد الأقصى لعدد FOVs إلى 20، والعدد المستهدف من النقاط إلى 4000، والمسافة القصوى بين القنوات إلى 5.0 بكسل، ونصف قطر الاستبعاد بين القنوات إلى 10.0 بكسل أثناء معايرة رسم خرائط القناة.
  7. تأكد من أن المعايرة تنتج تغطية نقطة من >90٪ ونوعية رسم الخرائط التي هي جيدة. حفظ بيانات المعايرة المعطاة لاكتساب الصور في المستقبل.

5 تصور EV في ثلاثة أبعاد

  1. إضافة 100x النفط على الهدف ووضع المركبات الكهربائية المعدة في المجهر. دون تنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد، قم بتشغيل ليزر الإثارة 640 نانومتر ورفعه في البداية إلى ما بين 1.2 كيلوواط و 12.5 كيلوواط اعتمادا على كثافة الإشارة ومجال الرؤية لإثارة صبغة الغشاء الأحمر المتشابكة الملون المركبات الكهربائية.
    1. ضمن خيارات عرض الصور، قم بتبديل طريقة العرض من تشبع الفوتون إلى المئينات لتصور المركبات الكهربائية بشكل أفضل. ضبط طاقة الليزر لتقليل الضوضاء، مع تعظيم الإشارة. الاحتفاظ بكافة المعلمات الأخرى.
    2. ضبط التركيز من Z-الطائرة بالنقر فوق رمز أعلى أو أسفل على المحور Z.
      ملاحظة: يجب أن يكون مركزة Z-plane بين -200 و-350 نانومتر، ولكن سوف تختلف تبعا لحقل الرؤية.
  2. تعيين وقت التعرض إلى 20 مللي ثانية، والتقاط الإطار إلى 10،000 إطار، وقوة الليزر الأولية إلى ما بين 1.2 كيلوواط و 12.5 كيلوواط، أو قوة الليزر المحددة في الخطوة 5.1، اعتمادا على كثافة الإشارة ومجال الرؤية.
    1. قم بتنشيط العدسة ثلاثية الأبعاد باستخدام الرمز وابدأ عملية الاستحواذ بالنقر على زر الحصول.
  3. في جميع أنحاء الحصول على الصورة، ورفع قوة الليزر من قبل 3 زيادات من 10 كل 1000 إطارات، أو ما يكفي للحفاظ على نسبة عالية من إشارة إلى الضوضاء. لا تقم بضبط الطائرة Z أثناء عملية الامتلاك.
    ملاحظة: قد يتم رفع الليزر إلى طاقة ليزر 90 كيلوواط كحد أقصى.

6 تعديل ما بعد الاستحواذ وتتبع EV

  1. بعد الحصول على الصورة، قم بالتبديل إلى نافذة تحليل العرض. قم بإجراء تصحيح الانجراف على الصورة غير المصفاة، ثم قم بتنشيط عوامل التصفية. ضبط عدد الفوتونات ودقة التعريب و sigmas و فهرس الإطار وفقا للجدول 1.
  2. تراكب أداة عرض طائرة XYZ على طول المحور X من المركبات الكهربائية الفردية من مجال الرؤية والتصدير . ملفات CSV للأحداث الضوئية.
  3. تقسيم المركبات الكهربائية الفردية على محور XY في حقل X حسب Y من العرض باستخدام أداة مخطط تكراري خط، الذي صناديق الأحداث photoswitching في مجموعات المسافة المحددة.
  4. التقاط صور من المركبات الكهربائية واحدة وحفظها كملفات .tiff.
  5. إنشاء مقاطع فيديو ثلاثية الأبعاد لمركبات EVs الفردية باستخدام أداة مرئية ثلاثية الأبعاد ولون وفقا للموضع على طول المحور Z.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كان الهدف من هذه الدراسة تقييم فعالية المجهر فائق الدقة في تصور المركبات الكهربائية الفردية بدقة نانومتر في ثلاثة أبعاد (ثلاثي الأبعاد). لتحليل شكل وحجم المركبات الكهربائية الفردية، قمنا بتوظيف صبغة قابلة للسحر الضوئي واحتضان المركبات الكهربائية بصبغة حمراء بعيدة التشفير، وإزالة الصبغة الزائدة من خلال الكروماتوغرافيا29. ثم تم عرض المركبات الكهربائية المضادة للCD81 والملطخة باللون الأحمر في المجهر فائق الدقة تحت ليزر الإثارة 640 نانومتر. بعد معايرة المجهر الذي أنتج خطأ متوسط 16 نانومتر على محور XY و 38 نانومتر على المحور Z (الشكل 1A، B) ، تم تصور المركبات EVs U2OS المنقى بنجاح بدقة تصل إلى 20 نانومتر على محور XY و 50 نانومتر على طول المحور Z.

تصور المركبات الكهربائية الفردية من خلال dSTORM في الصور 3-D سحر في جميع أنحاء التعرض الإطار 10000 كما تم زيادة قوة الليزر وكانت واضحة بسهولة في الصورةالمكتسبة (الأرقام 2A، B). بعد اقتناء صورة تصحيح الطائرة Z ، الفوتون التهم ، سيغماس ، ودقة توطين الصورة المعاد بناؤها يسمح لقرار واضح من EV في 3 - D (الشكل 2C، D). وEV في الشكل 2C photowitched خلال الإطارات 7000 الأولى فقط ، كما يتضح من أسطورة في الزاوية اليمنى العليا. هذا هو نتيجة photobleaching التي قد تكون ناجمة عن رفع طاقة الليزر بسرعة كبيرة جدا. الرسم البياني يؤكد أن غالبية الأحداث photoswitching وقعت ضمن دائرة نصف قطرها 100 نانومتر (الشكل 2E)، والتحقق من أن EV تصور هو exosome وأن عزل المركبات الكهربائية من قطر صغير كان ناجحا.

تم إجراء تحليل توزيع الحجم على المركبات الكهربائية الأخرى التي تم تتبعها بشكل فردي باستخدام أداة الرسم البياني للخط وأداة عرض الطائرة XYZ لتأكيد أن غالبية أحداث التعقب الضوئي وقعت داخل دائرة نصف قطرها 100 نانومتر من المركز (الشكل 3A، C) ، مما يؤكد قدرة dSTORM على تصور المركبات الكهربائية ذات القطر الصغير. كما يتضح من أداة التصور ثلاثي الأبعاد ، يتم زيادة الخطأ على طول المحور Z ، مما ينتج صورة نهائية ممدودة لل EV على طول المحور المحوري(الشكل 3D، فيديو 1). لم ترتبط أحداث الوورة الضوئية بحجم EV (الشكل 3E) ، مما يدل على أنه يمكن استخدام التوصيف القائم على dSTORM للمركبات الكهربائية الصغيرة مثل exosomes والفيروسات الصغيرة المغلفة التي يقل قطرها عن 100 نانومتر.

المعلمات الصحيحة لZ-plane و sigma هي جزء لا يتجزأ من الدقة المناسبة للغشاء في 3-D. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وقت التعرض الصحيح وعدد الإطارات الملتقطة ومستوى الليزر الأولي حاسم لإنتاج صورة EV فردية ذات غشاء محلول. وينبغي إجراء مزيد من التحقيقات بشأن كيفية تحسين المجهر ووضع معلمات ما قبل وبعد الاقتناء لالتقاط أعلى الصور دقة للمركبات الكهربائية.

Figure 1
الشكل 1: معايرة المجهر فائق الدقة في ثلاثة أبعاد باستخدام 100 نانومتر ميكروسفير. (أ) مجال الرؤية في تدرج رمادي من معايرة المجهر مع ميكروسفيرس بعد تصحيحات الصورة بعد الاستحواذ. شريط المقياس في أسفل اليمين. (ب)تم الحصول على أخطاء المعايرة المطلقة على محور س ص ومحور Z من خلال معايرة رسم الخرائط القناة ومعايرة الخرائط ثلاثية الأبعاد، على التوالي. N = 10 تكرارات بيولوجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: dSTORM من EV واحد في ثلاثة أبعاد. (A) حقل رمادي من وجهة نظر CD81 + تقارب تنقية المركبات الكهربائية ملطخة غشاء أحمر قابل للسحر صبغة متشابكة ومتحمس مع ليزر الإثارة 640 نانومتر. شريط المقياس في أسفل اليمين. (ب) مجال الرؤية من A المسمى وفقا لون القناة. (C) EV واحد من عرض التكبير في المربع الأبيض في A، وصفت وفقا لمؤشر الإطار. تشير خريطة الحرارة في أعلى اليمين إلى الإطار الذي تم فيه تسجيل أحداث السهر الضوئي. شريط المقياس في أسفل اليمين. (D) EV من C المسمى وفقا لون القناة. (ه)تم إنشاء تحليل توزيع الحجم عن طريق تقسيم EV على الخط المتقطع الموضح في D وفصل حدث السويتورينج إلى صناديق 15.4 نانومتر باستخدام أداة مخطط بياني للخط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: توزيع الأحداث photoswitching خلال الحصول على EV واحد في ثلاثة أبعاد. (أ) صورة أعيد بناؤها من EV CD81+ تقارب تنقية المسمى مع صبغة الغشاء الأحمر قابلة للسحر المتشابكة ومتحمس مع ليزر 640 نانومتر الإثارة. شريط المقياس في أسفل اليمين. (ب) مربع ومؤامرة شعيرات من متوسط أقطار CD81 + تقارب تنقية المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها باستخدام المجهر خط الرسم البياني أداة على طول المحور س ص. (متوسط = 104 نانومتر، الانحراف المعياري = 28 نانومتر). (ج) موقع أحداث التجول الضوئي الفردية على طول البعد XY لل EV في A ، المسجلة في جميع أنحاء التعرض للإطار 10000. (D) موقع أحداث التجول الضوئي الفردية على طول محور XZ لل EV في A ، المسجلة في جميع أنحاء التعرض للإطار 10000. (ه) مبعثر من عدد من الأحداث photoswitching المسجلة على المركبات الكهربائية الفردية من أقطار متفاوتة. لا تظهر القيمة R-squared البالغة 0.1065 أي ارتباط بين عدد أحداث السحر الضوئي المكتشفة وقطر EV. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: صورة ثلاثية الأبعاد ل EV واحد CD81+ تنقية تقارب المسمى مع صبغة الغشاء الأحمر قابلة للسحر متشابكة ومتحمس مع ليزر الإثارة 640 نانومتر. يتم تسمية نظام الألوان وفقا للعمق على طول المحور Z. الخطأ على طول المحور Z هو elongated. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.

متغير دقيقه ماكس
عدد فوتون 200 10,000,000
Z-position (نانومتر) -300 300
ترجمة الدقة X (نانومتر) 0 40
دقة التعريب Y (نانومتر) 0 40
الدقة سيغما X (نانومتر) 0 40
الدقة سيغما Y (نانومتر) 0 40
سيغما X (نانومتر) (القناة 0، 640 نانومتر ليزر) 100 350
سيجما Y (نانومتر) (القناة 0، 640 نانومتر ليزر) 100 350
سيجما X (نانومتر) (القناة 1، 473، 561 نانومتر ليزر) 100 350
سيجما Y (نانومتر) (القناة 1، 473، 561 نانومتر ليزر) 100 350
فهرس الإطارات 0 10,000

الجدول 1: معلمات المجهر فائق الدقة أثناء اقتناء dSTORM ثلاثي الأبعاد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أصبحت المركبات الكهربائية مجال الدراسة شعبية نظرا لدورها الهام في العديد من العمليات داخل الخلايا والخلايا إلى الخلية الإشارات1،30. ومع ذلك ، فإن تصورها يثبت أن يكون صعبا كما حجمها الصغير يقع تحت الحد الحيود من المجهر الخفيفة. المباشرة الاستوشاستيك البصرية إعادة الإعمار المجهري (dSTORM) هو وسيلة مباشرة للتصور الذي يتجاوز حد الحيود عن طريق التقاط أحداث photowitching من الفلوروفور الفردية مع مرور الوقت وإعادة بناء صورة على أساس هذه الأحداث وامض21،31. وقد تم إجراء المجهر فائقة الدقة بنجاح في 3-D على العديد من الهياكل الخلوية مثل خيوط أكتين، microtubules، المستقبلات جزءا لا يتجزأ من غشاء البلازما، والبروتينات الفيروسية في الخلايا المصابة32،33،34،35،36. كان الغرض من هذه الدراسة هو تقييم فعالية الفحص المجهري فائق الدقة ، وتحديدا dSTORM ، لتصور المركبات الكهربائية في 3-D مع دقة النانومتر. لقد قمنا بتوظيف صبغة غشاء قابلة للفضالة لتصور المركبات الكهربائية الفردية بنجاح من خلايا U2OS من خلال dSTORM بدقة تصل إلى +/- 20 نانومتر على محور XY و +/- دقة 50 نانومتر على محور Z. وقد أظهرت أعمالنا السابقة أن المركبات الكهربائية من خطوط الخلايا المتعددة والسوائل الأولية لديها ملامح توزيع حجم مماثل كما تم تحليلها من قبل NTA وTEM26،37. ويمكن أن يؤدي استخدام توصيف المركبات الكهربائية القائم على العواصف العاتية إلى زيادة الثقة في هذه الظاهرة، فضلا عن إمكانية تحديد الاكتظاظ السكاني الفرعي في مجال واحد من مجالات النظر. وهناك ما يبرر المزيد من التحسين لهذه الطريقة. ميزة واحدة ملحوظة لdSTORM هو أن إعداد العينة لا يتطلب خطوات قاسية أو ضارة التي قد تغير هيكل المركبات الكهربائية. نتائجنا تثبت كذلك أن يتم الحفاظ على الطبيعة الكيميائية الحيوية للمركبات الكهربائية خلال تنقية EV مع الخرز المضادة CD81 والغليسينالحمضية 26،37. لقد أصلحنا المركبات الكهربائية مع البارافورمالديهيد لتجنب البيرمابيليزات الغشائية الناجمة عن مثبتات أخرى مثل الميثانول والإيثانول. هذا سمح لنا أن نستنتج أن dSTORM يلتقط بدقة مورفولوجيا المركبات الكهربائية كما هي موجودة في الحل. استخدام كابتو كور 700 ضروري، ومع ذلك، لتنقية المركبات الكهربائية بشكل فعال بعيدا عن الملوثات مثل الألبومين والبولي ايثيلين غليكول إلى أقل من المتطلبات التنظيمية38. أحد القيود الملحوظة على البروتوكول هو أن كفاءة الربط بين EV والشرائح ليست 100٪، لذلك يتم فقدان بعض المركبات الكهربائية أثناء إعداد العينة. وينبغي إجراء مزيد من التحقيق في فعالية الشرائح المغلفة لاصقة لربط أفضل المركبات الكهربائية.

في حين أن إعداد المركبات الكهربائية للتصور واضح ، فإن المعلمات أثناء الاستحواذ وخاصة أثناء التعديلات بعد الاستحواذ تختلف بشكل كبير من عينة إلى عينة ، اعتمادا على كثافة واستقرار المركبات الكهربائية والفلوروفور. مجال واحد من التباين في التجربة هو كثافة الليزر الإثارة التي يجب أن تكون مرتفعة بدقة في جميع أنحاء التعرض لتحقيق أقصى قدر من الإشارة ولكن منع photobleaching. Photobleaching ، أو عندما يفقد الفلوروفور قدرته على الفلورس ، هو قيد كبير في جميع أنحاء المجهر فائقة الدقة12،39. لمنع الbleaching الضوئي ، يمكن زيادة تركيز الإنزيم في العازلة إلى 10 mM لمسح أفضل جزيئات المؤأكسدة ومنع photobleaching. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ضبط طاقة الليزر على مستوى أولي منخفض ورفعها ببطء طوال فترة التعرض للحفاظ على إشارة عالية أمر بالغ الأهمية لمنع الbleaching الضوئي.

اخترنا صبغة حمراء قابلة للوصم بالصبغة الكهربائية بسبب طول موجيتها ومتانتها وقدرتها على تحمل التثبيت29. ومع ذلك ، فإن الصبغة التي اخترناها قد تمثل مشكلات أثناء الفحص المجهري فائق الدقة عندما تكون متحمسة بسرعة كبيرة أو عالية جدا من الكثافة. يمكن للفلوروفوريس في صبغة الغشاء الأحمر القابلة للووتش الضوئي أن تحمل bleach بعد 10000 إطار أو بعد أن تتجاوز طاقة الليزر 75.6 ميجاوات. بالإضافة إلى ذلك ، تنخفض كثافة صبغة الغشاء وقدرته على الفلورسي بشكل كبير بعد أسبوع من التخزين عند 4 درجة مئوية. وأخيرا، تبين أن الأصباغ المتشابكة الغشاء لتشكيل micelles في محلول مائي، لذلك أي صبغة الزائدة لا تزال موجودة في عينة EV بعد تنقية قد يتم الكشف عن ويخطئ لEV إذا لم يكن هناك علامة أخرى لتحديد EV، مثل tetraspanin. وينبغي إجراء مزيد من التحقيق باستخدام الأصباغ الأخرى غشاء intercalating لتحسين الصورة الاستقرار31،40. قد تكون الأجسام المضادة الفلورية المصاحبة لل EV خيارا أكثر ملاءمة لأنها تميل إلى أن تكون أكثر مقاومة للbleaching الضوئية ويمكن تضخيمالإشارة 41. ومع ذلك ، فإن عيب الأجسام المضادة هو أن الإشارة من الفلوروفور يتم تعويضها قليلا عن EV بسبب المسافة من الظهارة والفلوروفور على الأجسام المضادة.

يمكن أن تتطلب الطرق الحالية لتصور EV وتوصيفها ، مثل NTA أو قياس التدفق الخلوي أو EM ، خطوات إعداد ضارة أو هي طرق غير مباشرة للتصور. dSTORM يتطلب القليل من إعداد العينة، والحفاظ على الطبيعة الكيميائية الحيوية الطبيعية للمركبات الكهربائية، وهي طريقة مباشرة للتصور التي يمكن أن تتجاوز حد الحيود وتصور المركبات الكهربائية ذات القطر الصغير8،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،21، 26. ويمكن تحسين تقنيات أخرى من المجهر فائقة الدقة لتوصيف EV مثل استنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، والغزل قرص المجهر confocal (SDCM) ، وتصوير تنشيط المجهر التعريب (PALM)42،43. وتركز الدراسة الحالية حصرا على dSTORM، ولكن العمل في المستقبل على تحسين المجهر فائقة الدقة ومقارنة / تباين هذه التقنيات له ما يبرره. أصبحت المركبات الكهربائية مؤخرا مجالا شائعا للبحث حيث أصبح دورها في تطور الفيروس أكثر وضوحا. تطورت العديد من الفيروسات المتميزة تطوريا، مثل فيروس إبشتاين بار وفيروس نقص المناعة البشرية وفيروس التهاب الكبد A، للاستفادة من مسارات إشارات EV لتعزيز تطور المرض والتهرب من الاستجابة المناعية للجسم37و44و45و46و47و48و49و50 . وقد ثبت أن هذه الفيروسات لدمج العوامل الفيروسية, مثل الرناس أو البروتينات الفيروسية, في المركبات الكهربائية التي يمكن أن تنقل بعد ذلك هذه المكونات إلى الخلايا غير المصابة, في حين الهروب من الكشف المناعي6,51,52,53. يمكن الكشف عن هذه العوامل الفيروسية المرتبطة بالنسور وربما استخدامها كعلامة بيولوجية لتطور المرض54،55. لذلك ، يمكن استكشاف التصور القائم على dSTORM للمركبات الكهربائية الفردية والبروتينات المرتبطة بها كمنصة للمؤشرات الحيوية للأمراض ، وربما تطور المرض لبعض الفيروسات54،55. وينبغي إجراء مزيد من البحوث لتقييم فائدة dSTORM في تصور كل من محتويات داخل EV والبروتينات على غشاءه.

في الختام، أثبتنا أنه ينبغي اعتبار المجهر فائق الدقة تقنية فعالة لتصور المركبات الكهربائية ثلاثية الأبعاد بدقة نانومتر. النتائج التي تم الحصول عليها من قبل dSTORM تتفق مع تقنيات توصيف EV الأخرى. ميزة متميزة من dSTORM هو القدرة على تصور مباشرة الجسيمات تحت حد الحيود من الضوء دون الجفاف أو تجميد خطوات الكسر التي يمكن أن تغير الطبيعة الكيميائية الحيوية للمركبات الكهربائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى .C تضارب في المصالح للإعلان عنه. R.P.M وD.P.D. تلقي الدعم المادي من أكسفورد Nanoimaging (ONI) وشركة Cytiva (سابقا جنرال الكتريك للرعاية الصحية). وتعلن .M وجمهورية جمهورية الولايات المتحدة مصالح متنافسة على إمكانية تسويق بعض المعلومات المقدمة. وتدار هذه من قبل جامعة كارولينا الشمالية. لم تشارك مصادر التمويل في تفسير أو كتابة هذه المخطوطة.

Acknowledgments

نود أن نشكر أكسفورد Nanoimaging على ردود فعلهم البناءة والتوجيه. تم تمويل هذا العمل من قبل 5UM1CA121947-10 إلى R.P.M و1R01DA040394 إلى D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  3. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  4. Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  6. McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
  7. Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
  8. Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
  9. Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
  10. Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
  11. Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
  12. Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
  13. Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
  14. Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
  15. Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
  16. Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
  17. Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
  18. Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
  19. Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
  20. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
  21. van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
  22. Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
  23. Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
  24. Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
  25. Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
  26. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  27. Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  28. Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
  29. Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
  30. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  31. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  32. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  33. Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
  34. Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
  35. Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
  36. Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
  37. McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
  38. Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
  39. Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
  40. Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
  41. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
  42. Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
  43. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  44. Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
  45. Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
  46. Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
  47. Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
  48. Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
  49. Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
  50. Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
  51. Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
  52. Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
  53. Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
  54. Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
  55. Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 174،
المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي للحوالق خارج الخلية في ثلاثة أبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, M. G., McNamara, R. P.,… More

Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter