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Biology

Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é usada para contornar o limite típico de difração de microscopia leve e para visualizar exosóis na escala de nanômetros. Pode ser empregado em duas e três dimensões para caracterizar exossomos.

Abstract

Vesículos extracelulares (EVs) são liberados por todos os tipos de células e desempenham um papel importante na sinalização celular e homeostase. A visualização de EVs muitas vezes requer métodos indiretos devido ao seu pequeno diâmetro (40-250 nm), que está abaixo do limite de difração da microscopia de luz típica. Desenvolvemos uma visualização de EVs baseada em microscopia de super resolução para contornar o limite de difração em duas e três dimensões. Usando esta abordagem, podemos resolver a forma tridimensional dos EVs para dentro de resolução de +/- 20 nm no eixo XY e resolução de +/- 50 nm ao longo do eixo Z. Em conclusão, propomos que a microscopia de super resolução seja considerada como um método de caracterização de EVs, incluindo exosósmos, bem como vírus envoltos.

Introduction

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas ligadas à membrana liberadas por todos os tipos de células. Eles contêm lipídios, proteínas, metabólitos e ácidos nucleicos e transferem esses materiais localmente entre as células e distally entre tecidos e órgãos. Existem três subtipos primários de EVs: corpos apoptóticos, microvesículos e exosóis1,2. Aqui, focamos nossa discussão sobre exossomos e suas proteínas associadas.

Exosóis são vesículas secretadas originárias do brotamento interno de endosários primitivos no corpo multivesicular (MVB). O MVB então se funde com a membrana plasmática, liberando os exossomos no espaço extracelular para viajar para outras células3,4. Os exosóis existem em um espectro de tamanhos que variam de 40 a 150 nm e são enriquecidos com proteínas transmembranas endossomais conhecidas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), complexo de triagem endosômico ligado à membrana necessário para o transporte (ESCRT), e proteínas lipídicas associadas à balsa1,2,5,6,7.

Caracterizar a composição bioquímica dos exossomos tornou-se um campo popular para os pesquisadores entenderem melhor sua natureza funcional. Existem muitos métodos para visualizar e caracterizar exossomos, incluindo citometria de fluxo nanoescala, análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia eletrônica de varredura e transmissão (TEM), ressonância de plasmon superficial, sensoriamento de pulso resistivo e microscopia de luz tradicional, cada uma das quais contém prós intrínsecos e contras8,9. TEM e crio-EM podem alcançar resolução baseada em nanômetros, mas muitas vezes requerem etapas de desidratação e fratura congelante, diminuindo ou reduzindo os EVs10,11. O NTA conta com a dispersão de luz, permitindo a caracterização de centenas de EVs de cada vez, mas é uma medição indireta do tamanho das partículas e não pode distinguir facilmente entre EVs, vírus e agregados proteicos12,13,14,15,16. A citometria de fluxo nanoescala emprega a dispersão de luz a partir de um caminho de excitação, que pode então ser traduzido em medidas de tamanho, mas é uma tecnologia emergente, e há pouco consenso sobre o tamanho das partículas dentro da faixa linear de detecção para vários instrumentos12,17,18.

A microscopia leve tradicional usando proteínas fluorescentes ou corantes tem sido uma das técnicas mais utilizadas para visualizar compartimentos subcelulares, complexos proteicos e máquinas de sinalização dentro de uma célula. Embora essa técnica se mostre útil na visualização da localização de complexos, o limite de difração da microscopia de luz tradicional (em torno de 250-400 nm) impede a clara resolução de proteínas ou estruturas na faixa de tamanho típico de um exososomo (40-150 nm)12,19,20.

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM), distingue-se da microscopia de luz convencional, empregando as propriedades fotosssuráveis de fluoroforos específicos e detectando esses eventos piscando para reconstruir imagens até a precisão de nanômetros21. Eventos de captura de fotos são coletados usando uma câmera de detecção de alta moldura ao longo de dezenas de milhares de exposições individuais, e uma função de propagação de pontos é usada para mapear com alta confiança a localização exata do fluoróforo de fotossar19,20,22. Isso permite que o dSTORM contorne o limite de difração da microscopia leve. Vários grupos relataram o uso de técnicas de super-resolução para visualização e rastreamento de exossomos e suas proteínas associadas22,23,24,25. A resolução final depende das propriedades biofísicas do fluoróforo, mas muitas vezes varia de +/-10-100 nm ao longo do eixo XY, permitindo a resolução de molécula única.

A capacidade de resolver fluoroforos individuais nesta escala no eixo XY revolucionou a microscopia. No entanto, há poucos dados sobre o dSTORM tridimensional (3-D) de um exossomo. Por isso, buscamos estabelecer um procedimento operacional padrão (SOP) para visualização e caracterização baseada em dSTORM de EVs purificados, incluindo exosóis à precisão de nanômetros em 3D.

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Protocol

1 Propagação e manutenção de linhas celulares

  1. Adquira células de osteossarcoma humanas (U2OS) e coloque as células no meio de crescimento suplementadas com soro bovino fetal livre de 10% e 1x solução de penicilina/estreptomicina.
    NOTA: O Soro Bovino Fetal livre de exosome foi gerado seguindo o protocolo apresentado em McNamara et. al.26.
  2. Mantenha as células U2OS em uma incubadora revestida de cobre a 37 °C em 5% de CO2 e células de passagem em frascos T17526,27. As células devem ser mantidas em fase de crescimento logarítmico médio para evitar que subpopulações surjam, ou do acúmulo de detritos apoptóticos durante a fase estacionária.

2 Isolamento e purificação exososome

  1. Cresça as linhas celulares U2OS para total confluência em 10 frascos T175 separados com 50 mL de mídia por frasco. Remova a célula sobrenante e, sucessivamente, passe-a através de um aparelho de filtragem de vácuo de 0,45 μm e 0,22 μm.
  2. Sujeito o supernatante à filtragem de fluxo cruzado (também conhecido como filtragem de fluxo tangencial) em um sistema de filtragem equipado com o cartucho de fibra oca de 750 kDa, a fim de remover proteínas menores ou metabólitos28.
    1. Passe o sobrenante através do operador de filtragem de fluxo tangencial a uma pressão constante para a frente de 30 psi, mantendo uma pressão de retenção de <20 psi para produzir uma pressão Δ de 10 ou mais psi. Coloque uma barra de agitação magnética no tanque de retentate e coloque para 150 rpm26.
    2. Mantenha a taxa de alimentação em 40 mL/min ou superior. Recolher o permeado em um reservatório e descartá-lo.
  3. Concentre o supernatante a 30 mL e, em seguida, equilibre-se com quatro volumes de 1x PBS. Colete a solução filtrada e equilibrada de fluxo cruzado em um tubo cônico de 50 mL.
  4. Precipitar os EVs a 4 °C durante a noite em uma concentração final de 40 mg/mL de polietileno glicol com um peso molecular de 8.000 Da. Centrifugar os EVs a 1.200 x g a 4 °C por 1 h e resuspend em 500 μL de 1x PBS.
  5. Incubar os EVs com 50 μg/mL de corante intercalante de membrana vermelha fotocretável e 50 μg/mL de RNase A em 1x PBS a 4 °C por 1 h.
  6. Remova o excesso de corante através de uma coluna em um sistema de purificação de proteínas ligado a um coletor de frações. Identifique frações de EV através da absorvância UV e insirá-las em um tubo de microcentrifuuagem26.
  7. Selecione um total de 200 μL de EVs usando contas magnéticas anti-CD81 equilibradas em 1x PBS.
    1. Diluir 100 μL das contas magnéticas anti-CD81 em 1x PBS a um volume total de 1 mL e permitir que elas se liguem a 4 °C por 2 h em um tubo de microcentrífuga de 2 mL com balanço contínuo.
  8. Lave as contas anti-CD81 e EV três vezes com 1x PBS. Elute CD81+ EV da solução com 100 mM Glycine no pH 2.0 por 30 min a 37 °C.
  9. Pipeta o CD81+ EV purificado em um volume igual de 100 mM Tris-HCl em pH 7.5 em 1x PBS.
    NOTA: Uma alíquota da solução EV CD81+ purificada pode ser reservada para análise de rastreamento de nanopartículas ou microscopia eletrônica, a fim de confirmar a pureza da solução e presença de EVs26.

3 Fixação e preparação

  1. Coloque EVs purificados de afinidade em placas de 8 poços de deslizamento de μ de vidro em um volume total de 200 μL (pode diluir a amostra de EV em 100 mM Tris-HCl em pH 7.5 em 1x PBS) e permitir aderir à superfície durante a noite a 4 °C.
  2. Sem remover a solução existente da placa de 8 poços, fixe os EVs nas placas adicionando 200 μL de 4% de paraformaldeído em 1x PBS à solução contendo EV em cada poço e deixe incubar por 30 min a temperatura ambiente21.
  3. Remova cuidadosamente a solução paraformaldeída e o excesso com uma micropipette para não perturbar os EVs. Lave o EV com 1x PBS para remover o excesso de paraformaldeído. Realize o procedimento de lavagem três vezes. Remova o excesso de 1x PBS.
  4. Prepare 250 μL de solução tampão dSTORM B por amostra, criando uma solução de 5 mM protocatechuato dioxygenase (Parte A) diluída em tampão de imagem (Parte B) por protocolo do fabricante.
    NOTA: A concentração da enzima no buffer pode ser dobrada para 10 mM se ocorrer fotobleaching.
    1. Adicione 250 μL do buffer preparado a cada poço por protocolo do fabricante por 20 minutos à temperatura ambiente antes da imagem para catarver moléculas oxidantes.
      NOTA: O EV pode então ser visto imediatamente ou armazenado a 4 °C por até uma semana. Substitua o buffer após o armazenamento antes de cada visualização.

4 Calibração direta da microscopia de reconstrução óptica estocástica

  1. Prepare as contas necessárias para a calibração do microscópio de super resolução diluindo microesferas de 100 nm para uma concentração de 0,5% na água de grau de biologia molecular e tubulação de 200 μL em cada poço de uma placa de fundo de vidro μ-slide 8-well.
    1. Deixe as contas se instalarem nos poços por 1h a temperatura ambiente.
  2. Sem remover a solução existente, adicione 200 μL de 4% de paraformaldeído em PBS a cada poço à solução de contas de calibração e deixe incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
  3. Remova cuidadosamente o paraformaldeído com uma micropipette para não perturbar as contas e lave as contas três vezes com 1x PBS. Prepare o buffer de acordo com a etapa 3.4.
  4. Remova 1x PBS e adicione 250 μL do buffer preparado a cada poço. Deixe o buffer descansar por 20 minutos antes da visualização.
  5. Antes de colocar qualquer coisa no palco, conecte-se ao microscópio 3D usando o botão Conectar o microscópio. Adicione óleo 100x ao objetivo e coloque o centro do poço em cima do objetivo. Na configuração Acquire, ligue os lasers de excitação de 473 e 640 nm e clique em Exibir.
    1. Sem a lente 3D ativada, visualize as contas sob a configuração de saturação de fótons clicando em Contagem de Fótons nas opções de exibição de imagem. Defina os poderes de laser iniciais para 8,4 mW para o laser de 473 nm e para 11,6 mW para o laser de 640 nm.
    2. Diminua o foco do laser para cerca de -300 nm ou o plano focal das contas de calibração para produzir uma resolução clara das contas individuais. Uma vez que o plano Z esteja focado, ajuste ainda mais os níveis de potência do laser para explicar a variação em cada campo de visão.
  6. Sob as funções do instrumento, complete a calibração do mapeamento 3D e a calibração do mapeamento do canal para obter os erros no eixo X-, Y e Z. Defina o número máximo de FOVs para 20, o número de pontos alvo para 4.000, a distância máxima entre os canais para 5,0 pixels e o raio de exclusão entre os canais para 10,0 pixels durante a calibração do mapeamento do canal.
  7. Certifique-se de que a calibração produz uma cobertura pontual de >90% e qualidade de mapeamento que seja boa. Salve os dados de calibração dado para futuras aquisições de imagens.

5 Visualização de EV em três dimensões

  1. Adicione óleo 100x no objetivo e coloque os EVs preparados no microscópio. Sem a lente 3D ativada, ligue o laser de excitação de 640 nm e inicialmente eleve-o para entre 1,2 mW e 12,5 mW, dependendo da intensidade do sinal e do campo de visão para excitar a membrana vermelha intercalando EVs manchados de corante.
    1. Nas opções de exibição de imagem, mude o método de visualização da saturação de fótons para percentis para melhor visualizar os EVs. Ajuste a potência do laser para minimizar o ruído, ao mesmo tempo em que maximiza o sinal. Mantenha todos os outros parâmetros.
    2. Ajuste o foco do plano Z clicando no ícone para cima ou para baixo no eixo Z.
      NOTA: O plano Z deve ser focado entre -200 e -350 nm, mas vai variar dependendo do campo de visão.
  2. Ajuste o tempo de exposição para 20 ms, a captura do quadro para 10.000 quadros, e a potência inicial do laser entre 1,2 mW e 12,5 mW, ou a potência laser determinada na etapa 5.1, dependendo da intensidade do sinal e do campo de visão.
    1. Ative a lente 3D usando o ícone e inicie a aquisição clicando no botão Adquirir.
  3. Ao longo da aquisição de imagens, eleve a potência laser em 3 incrementos de 10 a cada 1000 quadros, ou o suficiente para manter uma alta relação sinal-ruído. Não ajuste o plano Z durante a aquisição.
    NOTA: O laser pode ser elevado a um máximo de 90 mW de potência laser.

6 Modificação pós-aquisição e rastreamento de EV

  1. Após a aquisição da imagem, alterne para a janela de visualização Analisar. Execute a correção de deriva na imagem não filtrada e, em seguida, ative filtros. Ajuste a contagem de fótons, precisão de localização, sigmas e índice de quadros de acordo com a Tabela 1.
  2. Sobrepor uma ferramenta de visão de plano XYZ ao longo do eixo X de EVs individuais do campo de visão e exportação . Arquivos CSV de eventos de fototaria.
  3. Bisecte EVs individuais no eixo XY em um campo de visão X by Y usando uma ferramenta de histograma de linha, que bins eventos de fotossar em grupos de distância definidos.
  4. Pegue imagens de EVs únicos e salve-as como .tiff arquivos.
  5. Crie vídeos 3D de EVs individuais usando uma ferramenta de visualização 3D e cor de acordo com a colocação ao longo do eixo Z.

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Representative Results

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da microscopia de super resolução na visualização de EVs individuais com resolução de nanômetros em três dimensões (3D). Para analisar a forma e o tamanho dos EVs individuais, utilizamos corante fotocrável e incubamos os EVs com um corante de intercalação de membrana e removeram o excesso de corante através da cromatografia29. Os EVs anti-CD81 capturados por afinidade e vermelho foram então vistos no microscópio de super resolução sob o laser de excitação de 640 nm. Após a calibração do microscópio que produziu um erro médio de 16 nm no eixo XY e 38 nm no eixo Z (Figura 1A, B), os EVs U2OS purificados foram visualizados com sucesso com uma resolução de até 20 nm no eixo XY e 50 nm ao longo do eixo Z.

EVs individuais visualizados através de dSTORM em fotos 3D enfeitiçados ao longo da exposição de 10.000 quadros à medida que a potência do laser foi aumentada e foram prontamente aparentes na imagem adquirida(Figuras 2A,B). Correção de imagem pós-aquisição do plano Z, contagem de fótons, sigmas e precisão de localização da imagem reconstruída permitiram a resolução clara do EV em 3-D(Figura 2C,D). O EV na Figura 2C foi exibido durante apenas os primeiros 7.000 quadros, como visto pela legenda no canto superior direito. Isso é resultado de fotos que podem ter sido causadas por elevar a potência do laser muito rapidamente. O histograma confirma que a maioria dos eventos de fototareça ocorreram dentro de um raio de 100 nm(Figura 2E),validando que o EV visualizado é um exossomo e que o isolamento de EVs de um pequeno diâmetro foi bem sucedido.

A análise de distribuição de tamanho foi realizada em outros EVs rastreados individualmente usando uma ferramenta de histograma de linha e uma ferramenta de visualização de plano XYZ para confirmar que a maioria dos eventos de fototareçamento ocorreu dentro de um raio de 100 nm do centro (Figura 3A,C), validando ainda mais a capacidade do DSTORM de visualizar EVs de um pequeno diâmetro. Como visto por uma ferramenta de visualização 3D, o erro ao longo do eixo Z é aumentado, produzindo uma imagem final alongada do EV ao longo do eixo axial(Figura 3D, Vídeo 1). Os eventos de fototareçamento não foram correlacionados com o tamanho de EV(Figura 3E),demonstrando que a caracterização baseada em dSTORM pode ser usada para pequenos EVs, como exosós e pequenos vírus envoltos com menos de 100 nm de diâmetro.

Os parâmetros corretos para Z-plane e sigma são parte integrante da resolução adequada da membrana em 3D. Além disso, o tempo de exposição correto, o número de quadros capturados e o nível inicial de laser são cruciais para produzir uma imagem de um EV individual com uma membrana resolvida. Mais investigações devem ser feitas sobre como otimizar o microscópio e definir parâmetros pré e pós-aquisição para capturar as imagens de maior resolução de EVs.

Figure 1
Figura 1: Calibração do microscópio de super resolução em três dimensões usando microesferas de 100 nm. (A) Campo de visão em escala de cinza a partir da calibração do microscópio com microesferas após correções de imagem pós-aquisição. Barra de escala no lado inferior direito. (B) Erros absolutos de calibração no eixo XY e no eixo Z foram obtidos através da calibração de mapeamento de canais e calibração de mapeamento 3D, respectivamente. N = 10 réplicas biológicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: dSTORM de um único EV em três dimensões. (A) Campo de visão em escala de cinza de EVs purificados por afinidade CD81+ manchados com corante de membrana vermelha fotocrável e animado com o laser de excitação de 640 nm. Barra de escala no lado inferior direito. (B) Campo de visão de A rotulado de acordo com a cor do canal. (C) EV único a partir da visão ampliada da caixa branca em A, rotulada de acordo com o índice de quadros. O mapa de calor no canto superior direito indica o quadro em que os eventos de fototaria foram registrados. Barra de escala no lado inferior direito. (D) EV de C rotulado de acordo com a cor do canal. (E) A análise de distribuição de tamanho foi criada bisseccionando o EV na linha tracejada mostrada em D e separando o evento de fotocoditching em caixas de 15,4 nm usando uma ferramenta de histograma de linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Distribuição de eventos de fotoencamada durante a aquisição de um único EV em três dimensões. (A) Imagem reconstruída de um EV purificado por afinidade CD81+ rotulado com corante de membrana vermelha fotocrável e animado com o laser de excitação de 640 nm. Barra de escala no lado inferior direito. (B) Gráfico de caixa e bigode de diâmetros médios de EVs purificados por afinidade CD81+ obtidos utilizando a ferramenta de histograma de linha do microscópio ao longo do eixo XY. (média = 104 nm, desvio padrão = 28 nm). (C) Localização de eventos individuais de fotowitching ao longo da dimensão XY do EV em A, registrado ao longo da exposição de 10.000 quadros. (D) Localização de eventos individuais de fototareçamento ao longo do eixo XZ do EV em A, registrado ao longo da exposição de 10.000 quadros. (E) Dispersão do número de eventos de fotosstravação registrados em EVs individuais de diâmetros variados. O valor r-quadrado de 0,1065 não demonstra correlação entre o número de eventos de fotossartos detectados e o diâmetro do EV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Imagem 3D de um único EV purificado por afinidade CD81+ rotulado com corante de membrana vermelha fotocrável e animado com o laser de excitação de 640 nm. O esquema de cores é rotulado de acordo com a profundidade ao longo do eixo Z. O erro ao longo do eixo Z é alongado. Clique aqui para baixar este vídeo.

Variável Min Max
Contagem de fótons 200 10,000,000
Posição Z (nm) -300 300
Precisão de localização X (nm) 0 40
Precisão de localização Y (nm) 0 40
Precisão Sigma X (nm) 0 40
Precisão Sigma Y (nm) 0 40
Sigma X (nm) (Canal 0, laser de 640 nm) 100 350
Sigma Y (nm) (Canal 0, laser de 640 nm) 100 350
Sigma X (nm) (Canal 1, 473, 561 nm lasers) 100 350
Sigma Y (nm) (Canal 1, 473, 561 nm lasers) 100 350
Índice de quadros 0 10,000

Tabela 1: Parâmetros para o microscópio de super-resolução durante a aquisição de dSTORM 3D.

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Discussion

Os EVs tornaram-se uma área de estudo popular devido ao seu importante papel em muitos processos intracelulares e sinalização celular-celular1,30. No entanto, sua visualização se mostra difícil, pois seu pequeno tamanho fica abaixo do limite de difração da microscopia leve. A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é um método direto de visualização que contorna o limite de difração capturando eventos de fotofraco de fluoroforos individuais ao longo do tempo e reconstruindo uma imagem baseada nesses eventos piscando21,31. A microscopia de superrespeição foi realizada com sucesso em 3D em diversas estruturas celulares, como filamentos de actina, microtúbulos, receptores incorporados na membrana plasmática e proteínas virais em células infectadas32,33,34,35,36. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da microscopia de super resolução, especificamente dSTORM, para visualizar EVs em 3D com resolução de nanômetros. Utilizamos corante de membrana fotocrável para visualizar com sucesso EVs individuais de células U2OS através de dSTORM em até +/- resolução de 20 nm no eixo XY e resolução de +/- 50 nm no eixo Z. Nosso trabalho anterior mostrou que os EVs de múltiplas linhas celulares e fluidos primários têm perfis de distribuição de tamanho semelhantes analisados por NTA e TEM26,37. O uso de uma caracterização baseada em dSTORM de EVs pode adicionar mais confiança a este fenômeno, bem como potencialmente identificar subpopulações em um único campo de visão. Um refinamento adicional deste método é garantido. Uma vantagem notável para dSTORM é que a preparação da amostra não requer etapas duras ou prejudiciais que podem alterar a estrutura dos EVs. Nossos resultados demonstram ainda que a natureza bioquímica dos EVs é mantida durante a purificação do EV com contas anti-CD81 e glicinaácida 26,37. Fixamos os EVs com paraformaldeído para evitar permeabilizações de membrana causadas por outros fixativos como metanol e etanol. Isso nos permitiu concluir que o dSTORM captura com precisão a morfologia dos EVs como eles existem na solução. O uso do Capto Core 700 é necessário, no entanto, para purificar os EVs efetivamente longe de contaminantes como albumina e polietileno glicol para abaixo dos requisitos regulatórios38. Uma limitação notável do protocolo é que a eficiência vinculante entre o EV e os slides não é de 100%, de modo que alguns EVs são perdidos durante a preparação da amostra. Uma investigação mais aprofundada deve ser feita sobre a eficácia de slides revestidos de adesivo para melhor ligar os EVs.

Embora a preparação dos EVs para visualização seja simples, os parâmetros durante a aquisição e especialmente durante as modificações pós-aquisição variam substancialmente de amostra para amostra, dependendo da intensidade e estabilidade dos EVs e do fluorophore. Uma área de variabilidade no experimento é a intensidade dos lasers de excitação que devem ser delicadamente elevados ao longo da exposição para maximizar o sinal, mas evitar fotobleaching. Fotobleaching, ou quando um fluoróforo perde sua capacidade de fluoresce, é uma limitação significativa em toda a microscopia de super resolução12,39. Para evitar fotobleaching, a concentração da enzima no tampão pode ser aumentada para 10 mM para melhor ressarcimento de moléculas oxidantes e evitar fotobleaching. Além disso, definir a potência do laser de excitação para um nível inicial baixo e elevando-o lentamente ao longo da exposição para manter um sinal alto é fundamental para evitar fotobleaching.

Escolhemos um corante vermelho fotosssurável para manchar os EVs devido ao seu comprimento de onda de excitação, durabilidade e capacidade de suportar a fixação29. No entanto, o corante que escolhemos pode apresentar problemas durante a microscopia de super resolução quando animado muito rapidamente ou em intensidade muito alta. Os fluoroforos no corante de membrana vermelha fotossciável podem fotobleach após 10.000 quadros ou depois que a potência laser excede 75,6 mW. Além disso, a intensidade e a capacidade do corante de membrana de fluoresce diminui substancialmente após uma semana de armazenamento a 4 °C. Finalmente, os corantes intercalantes de membrana têm sido mostrados para formar micelas em uma solução aquosa, de modo que qualquer corante em excesso ainda presente na amostra de EV após a purificação pode ser detectado e confundido com um EV se não houver outro marcador para identificar o EV, como uma tetraspanina. Mais investigações devem ser feitas usando outros corantes de intercalação de membrana para otimizar para foto-estabilidade31,40. Anticorpos fluorescentes conjugados ao EV podem ser uma opção mais adequada, pois tendem a ser mais resistentes ao fotobleaching e podem amplificar o sinal41. No entanto, a desvantagem dos anticorpos é que o sinal do fluorohore é ligeiramente deslocado do EV devido à distância do epítope e fluoróforo no anticorpo.

Métodos existentes de visualização e caracterização de EV, como NTA, citometria de fluxo ou EM, podem exigir etapas de preparação prejudiciais ou são métodos indiretos de visualização. dSTORM requer pouca preparação amostral, conservando a natureza bioquímica natural dos EVs, e é um método direto de visualização que pode contornar o limite de difração e visualizar EVs de um pequeno diâmetro8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Outras técnicas de microscopia de super resolução podem ser otimizadas para caracterização de EV, como esgotamento estimulado de emissões (STED), microscopia confocrânea de disco giratório (SDCM) e microscopia de localização fotoativada (PALM)42,43. O presente estudo se concentra exclusivamente no dSTORM, mas o trabalho futuro na otimização da microscopia de super-resolução e na comparação/contraste dessas técnicas é garantido. Os EVs tornaram-se recentemente uma área popular de pesquisa à medida que seu papel na progressão do vírus tornou-se mais evidente. Muitos vírus evolutivamente distintos, como o Vírus Epstein Barr, o HIV e o Vírus da Hepatite A, evoluíram para aproveitar as vias de sinalização de EV para promover a progressão da doença e evitar a resposta imune do corpo37,44,45,46,47,48,49,50 . Esses vírus têm sido mostrados para incorporar fatores virais, como mRNAs ou proteínas virais, em EVs que podem então transferir esses componentes para células não infectadas, enquanto escapam da detecção imunológica6,51,52,53. Esses fatores virais associados exosômicos podem ser detectados e possivelmente utilizados como biomarcadores para progressão da doença54,55. Portanto, a visualização baseada em dSTORM de EVs individuais e suas proteínas associadas pode ser explorada como uma plataforma para biomarcadores de doenças e, talvez, progressão da doença de certos vírus54,55. Mais pesquisas devem ser feitas para avaliar a utilidade da DSTORM na visualização de ambos os conteúdos dentro de um EV e proteínas em sua membrana.

Em conclusão, demonstramos que a microscopia de super resolução deve ser considerada uma técnica eficaz para a visualização de EVs em 3D com resolução de nanômetros. Os resultados obtidos pelo dSTORM são consistentes com outras técnicas de caracterização de EV. Uma vantagem distinta do dSTORM é a capacidade de visualizar diretamente partículas abaixo do limite de difração de luz sem desidratação ou congelamento de etapas de fratura que podem alterar a natureza bioquímica dos EVs.

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Disclosures

M.G.C. não tem conflitos de interesse para declarar. R.P.M e D.P.D. recebem suporte material da Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. e Cytiva Inc. (anteriormente GE Healthcare). R.P.M. e D.P.D. declaram interesses concorrentes para a possível comercialização de algumas das informações apresentadas. Estes são gerenciados pela Universidade da Carolina do Norte. As fontes de financiamento não estavam envolvidas nas interpretações ou na escrita deste manuscrito.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Oxford Nanoimaging por seu feedback e orientação construtivas. Este trabalho foi financiado pelo 5UM1CA121947-10 para R.P.M. e o 1R01DA040394 para D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

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References

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Biologia Edição 174
Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões
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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

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