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Biology

Microscopie à reconstruction optique stochastique directe de vésicules extracellulaires en trois dimensions

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est utilisée pour contourner la limite de diffraction typique de la microscopie optique et pour visualiser les exosomes à l’échelle nanométrique. Il peut être utilisé en deux et trois dimensions pour caractériser les exosomes.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (VE) sont libérées par tous les types de cellules et jouent un rôle important dans la signalisation cellulaire et l’homéostasie. La visualisation des véhicules électriques nécessite souvent des méthodes indirectes en raison de leur petit diamètre (40-250 nm), qui est inférieur à la limite de diffraction de la microscopie optique typique. Nous avons développé une visualisation des véhicules électriques basée sur la microscopie à super-résolution pour contourner la limite de diffraction en deux et trois dimensions. En utilisant cette approche, nous pouvons résoudre la forme tridimensionnelle des véhicules électriques à une résolution de +/- 20 nm sur l’axe XY et à une résolution de +/- 50 nm le long de l’axe Z. En conclusion, nous proposons que la microscopie à super-résolution soit considérée comme une méthode de caractérisation des VE, y compris les exosomes, ainsi que des virus enveloppés.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des vésicules liées à la membrane libérées par tous les types de cellules. Ils contiennent des lipides, des protéines, des métabolites et des acides nucléiques et transfèrent ces matériaux localement entre les cellules et distalement entre les tissus et les organes. Il existe trois sous-types primaires de VE : les corps apoptotiques, les microvésicules et les exosomes1,2. Ici, nous concentrons notre discussion sur les exosomes et leurs protéines associées.

Les exosomes sont des vésicules sécrétées provenant du bourgeonnement vers l’intérieur des endosomes précoces dans le corps multivésiculeux (MVB). Le MVB fusionne ensuite avec la membrane plasmique, libérant les exosomes dans l’espace extracellulaire pour se déplacer vers d’autres cellules3,4. Les exosomes existent sur un spectre de tailles allant de 40 à 150 nm et sont enrichis de protéines transmembranaires endosomales appelées tétraspanines (CD9, CD63, CD81), de complexe de tri endosomal lié à la membrane nécessaire au transport (ESCRT) et de protéines associées au radeau lipidique1,2,5,6,7.

La caractérisation de la composition biochimique des exosomes est devenue un domaine populaire pour les chercheurs afin de mieux comprendre leur nature fonctionnelle. De nombreuses méthodes existent pour visualiser et caractériser les exosomes, y compris la cytométrie en flux à l’échelle nanométrique, l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA), la microscopie électronique à balayage et à transmission (TEM), la résonance plasmonique de surface, la détection d’impulsions résistives et la microscopie optique traditionnelle, chacune contenant des avantages et des inconvénients intrinsèques8,9. Tem et cryo-EM peuvent atteindre une résolution basée sur le nanomètre, mais nécessitent souvent des étapes de déshydratation et de congélation-rupture, rétrécissant ou lysant ainsi les VÉHICULESélectriques 10,11. NTA repose sur la diffusion de la lumière, permettant la caractérisation de centaines de VE à la fois, mais est une mesure indirecte de la taille des particules et ne peut pas facilement distinguer entre les VE, les virus et les agrégats de protéines12,13,14,15,16. La cytométrie en flux à l’échelle nanométrique utilise la diffusion de la lumière à partir d’un chemin d’excitation, qui peut ensuite être traduite en mesures de taille, mais il s’agit d’une technologie émergente, et il existe peu de consensus sur la taille des particules dans la plage linéaire de détection pour divers instruments12,17,18.

La microscopie optique traditionnelle utilisant des protéines ou des colorants fluorescents a été l’une des techniques les plus utilisées pour visualiser les compartiments subcellulaires, les complexes protéiques et les mécanismes de signalisation au sein d’une cellule. Bien que cette technique s’avère utile pour visualiser la localisation des complexes, la limite de diffraction de la microscopie optique traditionnelle (environ 250-400 nm) empêche la résolution claire des protéines ou des structures dans la gamme de taille typique d’un exosome (40-150 nm)12,19,20.

La microscopie à super-résolution, à savoir la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM), se distingue de la microscopie optique conventionnelle en utilisant les propriétés photoscommutables de fluorophores spécifiques et en détectant ces événements clignotants pour reconstruire des images jusqu’à une précision nanométrique21. Les événements de commutation de photos sont collectés à l’aide d’une caméra de détection à fréquence d’images élevée au cours de dizaines de milliers d’expositions individuelles, et une fonction d’étalement de points est utilisée pour cartographier avec une grande confiance l’emplacement exact du fluorophore de commutation de photos19,20,22. Cela permet à dSTORM de contourner la limite de diffraction de la microscopie optique. Plusieurs groupes ont signalé l’utilisation de techniques de super-résolution pour visualiser et suivre les exosomes et leurs protéines associées22,23,24,25. La résolution finale dépend des propriétés biophysiques du fluorophore, mais varie souvent de +/-10 à 100 nm le long de l’axe XY, ce qui permet une résolution à molécule unique.

La capacité de résoudre les fluorophores individuels à cette échelle sur l’axe XY a révolutionné la microscopie. Cependant, il existe peu de données sur le dSTORM tridimensionnel (3D) d’un exosome. Par conséquent, nous avons cherché à établir une procédure d’exploitation standard (SOP) pour la visualisation et la caractérisation basées sur dSTORM des véhicules électriques purifiés, y compris les exosomes à la précision nanométrique en 3D.

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Protocol

1 Propagation et entretien des lignées cellulaires

  1. Acquérir des cellules d’ostéosarcome humain (U2OS) et placer les cellules dans le milieu de croissance complété par 10% de sérum fœtal bovin sans exosome et 1x solution de pénicilline / streptomycine.
    REMARQUE: Le sérum fœtal bovin sans exosomes a été généré conformément au protocole présenté dans McNamara et. al.26.
  2. Maintenir les cellules U2OS dans un incubateur revêtu de cuivre à 37 °C dans 5% de CO2 et les cellules de passage dans des flacons de T17526,27. Les cellules doivent être maintenues en phase de croissance mi-logarithmique pour empêcher l’apparition de sous-populations ou l’accumulation de débris apoptotiques pendant la phase stationnaire.

2 Isolement et purification des exosomes

  1. Cultivez les lignées cellulaires U2OS jusqu’à leur pleine confluence dans 10 flacons T175 distincts avec 50 mL de milieu par flacon. Retirez le surnageant de la cellule et passez-le successivement à travers un appareil de filtration sous vide de 0,45 μm et 0,22 μm.
  2. Soumettre le surnageant à une filtration à flux croisé (également appelée filtration à flux tangentiel) sur un système de filtration équipé de la cartouche à fibres creuses de 750 kDa afin d’éliminer les protéines ou métabolites plus petits28.
    1. Faire passer le surnageant à travers l’opérateur de filtration à écoulement tangentiel à une pression avant constante de 30 psi, tout en maintenant une pression de rétention de <20 psi pour produire une pression Δ de 10 psi ou plus. Placez une barre d’agitation magnétique dans le réservoir de rétentat et réglez à 150 tr/min26.
    2. Maintenir la vitesse d’alimentation à 40 mL/min ou plus. Recueillir le perméat dans un réservoir et l’éliminer.
  3. Concentrer le surnageant à 30 mL, puis équilibrer avec quatre volumes de 1x PBS. Recueillir la solution filtrée et équilibrée à flux croisé dans un tube conique de 50 mL.
  4. Précipiter les VE à 4 °C pendant la nuit à une concentration finale de 40 mg/mL de polyéthylène glycol d’un poids moléculaire de 8 000 Da. Centrifuger les VE à 1 200 x g à 4 °C pendant 1 h et remettre en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
  5. Incuber les VE avec 50 μg/mL de colorant d’intercalage à membrane rouge photoscommutable et 50 μg/mL de RNase A dans 1x PBS à 4 °C pendant 1 h.
  6. Enlevez l’excès de colorant à travers une colonne sur un système de purification des protéines attaché à un collecteur de fractions. Identifier les fractions EV grâce à l’absorbance UV et les regrouper dans un tube de microcentrifugation26.
  7. Sélectionnez par affinité un total de 200 μL de véhicules électriques à l’aide de billes magnétiques anti-CD81 équilibrées en 1x PBS.
    1. Diluer 100 μL des billes magnétiques anti-CD81 dans 1x PBS à un volume total de 1 mL et les laisser se lier à 4 °C pendant 2 h dans un tube de microcentrifugation de 2 mL à bascule continue.
  8. Lavez les billes anti-CD81 et EV trois fois avec 1x PBS. Elute CD81+ EV de la solution avec 100 mM de glycine à pH 2,0 pendant 30 min à 37 °C.
  9. Pipette le CD81+ EV purifié dans un volume égal de 100 mM Tris-HCl à pH 7,5 dans 1x PBS.
    REMARQUE: Une aliquote de solution purifiée de CD81+ EV peut être réservée à l’analyse de suivi des nanoparticules ou à la microscopie électronique afin de confirmer la pureté de la solution et la présence de VE26.

3 Fixation et préparation

  1. Placer les véhicules électriques purifiés par affinité sur des plaques de 8 puits à fond de verre μ-glissière dans un volume total de 200 μL (peut diluer l’échantillon EV dans 100 mM Tris-HCl à pH 7,5 dans 1x PBS) et laisser adhérer à la surface pendant la nuit à 4 ° C.
  2. Sans retirer la solution existante de la plaque à 8 puits, fixez les VE sur les plaques en ajoutant 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS à la solution contenant du VE dans chaque puits et laissez incuber pendant 30 min à température ambiante21.
  3. Retirez soigneusement le paraformaldéhyde et l’excès de solution à l’aide d’une micropipette afin de ne pas déranger les VE. Lavez le VE avec 1x PBS pour éliminer l’excès de paraformaldéhyde. Effectuez la procédure de lavage trois fois. Retirez l’excès de 1x PBS.
  4. Préparer 250 μL de solution tampon cubée dSTORM B par échantillon en créant une solution de 5 mM de protocatéchuate dioxygénase (partie A) diluée dans un tampon d’imagerie (partie B) selon le protocole du fabricant.
    REMARQUE: La concentration de l’enzyme dans le tampon peut être doublée à 10 mM en cas de photoblanchiment.
    1. Ajouter 250 μL du tampon préparé à chaque puits selon le protocole du fabricant pendant 20 min à température ambiante avant l’imagerie pour piéger les molécules oxydantes.
      REMARQUE: Le VE peut alors être visualisé immédiatement ou stocké à 4 ° C pendant une semaine. Remplacez la mémoire tampon après le stockage avant chaque visualisation.

4 Calibrage direct de la microscopie par reconstruction optique stochastique

  1. Préparer les billes nécessaires à l’étalonnage du microscope à super-résolution en diluant des microsphères de 100 nm à une concentration de 0,5 % dans de l’eau de qualité biologie moléculaire et en pipetant 200 μL dans chaque puits d’une plaque de 8 puits à fond de verre μ lame.
    1. Laisser les perles se déposer dans les puits pendant 1 h à température ambiante.
  2. Sans retirer la solution existante, ajouter 200 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS à chaque puits de la solution de billes d’étalonnage et laisser incuber pendant 30 min à température ambiante.
  3. Retirez soigneusement le paraformaldéhyde avec une micropipette pour ne pas déranger les perles et lavez les perles trois fois avec 1x PBS. Préparez le tampon conformément à l’étape 3.4.
  4. Retirez 1x PBS et ajoutez 250 μL du tampon préparé à chaque puits. Laissez la mémoire tampon reposer pendant 20 minutes avant la visualisation.
  5. Avant de placer quoi que ce soit sur la scène, connectez-vous au microscope 3D à l’aide du bouton Connecter le microscope. Ajoutez 100x d’huile à l’objectif et placez le centre du puits au-dessus de l’objectif. Dans le paramètre Acquérir, allumez les lasers d’excitation 473 et 640 nm et cliquez sur Afficher.
    1. Sans l’objectif 3D activé, visualisez les perles sous le paramètre de saturation des photons en cliquant sur Nombre de photons dans les options d’affichage de l’image. Réglez les puissances laser initiales à 8,4 mW pour le laser 473 nm et à 11,6 mW pour le laser 640 nm.
    2. Diminuez la mise au point du laser à environ -300 nm ou le plan focal des perles d’étalonnage pour produire une résolution claire des perles individuelles. Une fois le plan Z mis au point, ajustez davantage les niveaux de puissance du laser pour tenir compte de la variation dans chaque champ de vision.
  6. Sous les fonctions de l’instrument, effectuez l’étalonnage de la cartographie 3D et l’étalonnage de la cartographie des canaux pour obtenir les erreurs sur les axes X, Y et Z. Définissez le nombre maximal de FOV sur 20, le nombre cible de points sur 4 000, la distance maximale entre les canaux sur 5,0 pixels et le rayon d’exclusion entre les canaux sur 10,0 pixels lors de l’étalonnage du mappage des canaux.
  7. Assurez-vous que l’étalonnage produit une couverture ponctuelle de >90 % et une qualité de cartographie bonne. Enregistrez les données d’étalonnage données pour de futures acquisitions d’images.

5 Visualisation du VE en trois dimensions

  1. Ajoutez 100x d’huile sur l’objectif et placez les véhicules électriques préparés dans le microscope. Sans la lentille 3D activée, allumez le laser d’excitation de 640 nm et augmentez-le initialement entre 1,2 mW et 12,5 mW en fonction de l’intensité du signal et du champ de vision pour exciter les véhicules électriques colorés par colorant intercalé de membrane rouge.
    1. Sous les options d’affichage de l’image, basculez la méthode de visualisation de la saturation des photons aux percentiles pour mieux visualiser les véhicules électriques. Ajustez la puissance du laser pour minimiser le bruit, tout en maximisant le signal. Conservez tous les autres paramètres.
    2. Ajustez la mise au point du plan Z en cliquant sur l’icône haut ou bas sur l’axe Z.
      REMARQUE: Le plan Z doit être focalisé entre -200 et -350 nm, mais varie en fonction du champ de vision.
  2. Réglez le temps d’exposition à 20 ms, la capture d’image à 10 000 images et la puissance laser initiale entre 1,2 mW et 12,5 mW, ou la puissance laser déterminée à l’étape 5.1, en fonction de l’intensité du signal et du champ de vision.
    1. Activez l’objectif 3D à l’aide de l’icône et démarrez l’acquisition en cliquant sur le bouton Acquérir.
  3. Tout au long de l’acquisition d’images, augmentez la puissance du laser de 3 incréments de 10 toutes les 1000 images, soit suffisamment pour maintenir un rapport signal/bruit élevé. N’ajustez pas le plan Z pendant l’acquisition.
    REMARQUE: Le laser peut être porté à une puissance laser maximale de 90 mW.

6 Modification post-acquisition et traçage EV

  1. Après l’acquisition de l’image, basculez vers la fenêtre d’affichage Analyser. Effectuez une correction de dérive sur l’image non filtrée, puis activez les filtres. Ajustez le nombre de photons, la précision de localisation, les sigmas et l’indice de trame conformémentau tableau 1 .
  2. Superposer un outil de vue plane XYZ le long de l’axe X de véhicules électriques individuels à partir du champ de vision et exporter . Fichiers CSV d’événements de commutation de photos.
  3. Coupez en deux des véhicules électriques individuels sur l’axe XY dans un champ de vision X par Y à l’aide d’un outil d’histogramme de ligne, qui regroupe les événements de commutation de photos dans des groupes de distance définis.
  4. Prenez des images de véhicules électriques individuels et enregistrez-les en tant que fichiers .tiff.
  5. Créez des vidéos 3D de véhicules électriques individuels à l’aide d’un outil de visualisation 3D et colorez en fonction de leur emplacement le long de l’axe Z.

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Representative Results

L’objectif de cette étude était d’évaluer l’efficacité de la microscopie à super-résolution dans la visualisation de véhicules électriques individuels avec une résolution nanométrique en trois dimensions (3D). Pour analyser la forme et la taille des véhicules électriques individuels, nous avons utilisé un colorant photoscommutable et incubé les véhicules électriques avec un colorant intercalant membranaire rouge lointain et éliminé l’excès de colorant par chromatographie29. Les véhicules électriques anti-CD81 et colorés en rouge capturés par affinité ont ensuite été visualisés dans le microscope à super-résolution sous le laser d’excitation de 640 nm. Après l’étalonnage du microscope qui a produit une erreur moyenne de 16 nm sur l’axe XY et de 38 nm sur l’axe Z(Figure 1A,B),les véhicules électriques U2OS purifiés ont été visualisés avec succès avec une résolution allant jusqu’à 20 nm sur l’axe XY et 50 nm le long de l’axe Z.

Les véhicules électriques individuels visualisés par dSTORM en photos 3D commutés tout au long de l’exposition de 10 000 images à mesure que la puissance du laser augmentait et étaient facilement apparents dans l’image acquise (Figures 2A, B). La correction d’image post-acquisition du plan Z, le nombre de photons, les sigmas et la précision de localisation de l’image reconstruite ont permis la résolution claire de l’EV en 3D(Figure 2C,D). L’EV de la figure 2C n’a pris photo que pendant les 7 000 premières images, comme le montre la légende dans le coin supérieur droit. Ceci est le résultat d’un photoblanchiment qui peut avoir été causé par une augmentation trop rapide de la puissance du laser. L’histogramme confirme que la majorité des événements de photocommutation se sont produits dans un rayon de 100 nm(Figure 2E),validant que le VE visualisé est un exosome et que l’isolement des VE de petit diamètre a réussi.

L’analyse de la distribution de taille a été effectuée sur d’autres VÉHICULES tracés individuellement à l’aide d’un outil d’histogramme linéaire et d’un outil de vue plane XYZ pour confirmer que la majorité des événements de commutation de photos se sont produits dans un rayon de 100 nm du centre(Figure 3A,C),validant davantage la capacité de dSTORM à visualiser des VÉHICULES de petit diamètre. Comme le montre un outil de visualisation 3D, l’erreur le long de l’axe Z est augmentée, produisant une image finale allongée de l’EV le long de l’axe axial (Figure 3D, Vidéo 1). Les événements de commutation photographique n’étaient pas corrélés avec la taille du VE(Figure 3E),ce qui démontre que la caractérisation basée sur dSTORM peut être utilisée pour les petits véhicules électriques tels que les exosomes et les petits virus enveloppés de moins de 100 nm de diamètre.

Les paramètres corrects pour le plan Z et sigma font partie intégrante de la résolution appropriée de la membrane en 3D. De plus, le temps d’exposition correct, le nombre d’images capturées et le niveau laser initial sont cruciaux pour produire une image d’un VÉHICULE électrique individuel avec une membrane résolue. Des recherches plus approfondies devraient être menées sur la façon d’optimiser le microscope et de définir les paramètres pré et post-acquisition pour capturer les images à la plus haute résolution des véhicules électriques.

Figure 1
Figure 1: Étalonnage du microscope à super-résolution en trois dimensions à l’aide de microsphères de 100 nm. (A) Champ de vision en niveaux de gris à partir de l’étalonnage du microscope avec des microsphères après corrections d’image post-acquisition. Barre d’échelle en bas à droite. (B) Des erreurs d’étalonnage absolues sur l’axe XY et l’axe Z ont été obtenues par étalonnage de cartographie de canal et étalonnage de cartographie 3D, respectivement. N = 10 répliques biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: dSTORM d’un seul VE en trois dimensions. (A) Champ de vision en niveaux de gris des VÉHICULES PURIFIÉS par affinité CD81+ colorés avec un colorant d’intercalage à membrane rouge photoscommutable et excités avec le laser d’excitation de 640 nm. Barre d’échelle en bas à droite. (B) Champ de vision de A étiqueté en fonction de la couleur du canal. (C) Single EV à partir de la vue zoomée de la boîte blanche en A, étiquetée en fonction de l’index du cadre. La carte thermique en haut à droite indique le cadre dans lequel les événements de commutation de photos ont été enregistrés. Barre d’échelle en bas à droite. (D) EV de C étiqueté selon la couleur du canal. (E) L’analyse de la distribution de taille a été créée en coupant le VE en deux sur la ligne pointillée indiquée en D et en séparant l’événement de commutation de photos en bacs de 15,4 nm à l’aide d’un outil d’histogramme de ligne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Répartition des événements de photocommutation lors de l’acquisition d’un seul VE en trois dimensions. (A) Image reconstruite d’un VE purifié par affinité CD81+ étiqueté avec un colorant d’intercalage à membrane rouge photoscommutable et excité avec le laser d’excitation de 640 nm. Barre d’échelle en bas à droite. (B) Diagramme en boîte et moustache des diamètres moyens des véhicules électriques purifiés par affinité CD81+ obtenus à l’aide de l’outil d’histogramme linéaire du microscope le long de l’axe XY. (moyenne = 104 nm, écart-type = 28 nm). (C) Localisation des événements individuels de commutation de photos le long de la dimension XY du VE en A, enregistrés tout au long de l’exposition de 10 000 images. (D) Localisation des événements individuels de commutation de photos le long de l’axe XZ de l’EV en A, enregistrés tout au long de l’exposition de 10 000 images. (E) Nuage de points du nombre d’événements de commutation de photos enregistrés sur des véhicules électriques individuels de diamètres variables. La valeur R-carré de 0,1065 ne démontre aucune corrélation entre le nombre d’événements de commutation de photos détectés et le diamètre du VE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Image 3D d’un seul VÉHICULE ÉLECTRIQUE purifié par affinité CD81+ étiqueté avec un colorant d’intercalage à membrane rouge photoscommutable et excité avec le laser d’excitation de 640 nm. La palette de couleurs est étiquetée en fonction de la profondeur le long de l’axe Z. L’erreur le long de l’axe Z est allongée. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Variable Min Max
Nombre de photons 200 10,000,000
Position Z (nm) -300 300
Précision de localisation X (nm) 0 40
Précision de localisation Y (nm) 0 40
Précision Sigma X (nm) 0 40
Précision Sigma Y (nm) 0 40
Sigma X (nm) (canal 0, laser 640 nm) 100 350
Sigma Y (nm) (canal 0, laser 640 nm) 100 350
Sigma X (nm) (lasers canal 1, 473, 561 nm) 100 350
Sigma Y (nm) (lasers canal 1, 473, 561 nm) 100 350
Index de trame 0 10,000

Tableau 1 : Paramètres du microscope à super-résolution lors de l’acquisition de dSTORM 3D.

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Discussion

Les VE sont devenus un domaine d’étude populaire en raison de leur rôle important dans de nombreux processus intracellulaires et la signalisation de cellule à cellule1,30. Cependant, leur visualisation s’avère difficile car leur petite taille tombe en dessous de la limite de diffraction de la microscopie optique. La microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) est une méthode directe de visualisation qui contourne la limite de diffraction en capturant les événements de commutation de photos de fluorophores individuels au fil du temps et en reconstruisant une image basée sur ces événementsclignotants 21,31. La microscopie à super-résolution a été réalisée avec succès en 3D sur plusieurs structures cellulaires telles que les filaments d’actine, les microtubules, les récepteurs intégrés dans la membrane plasmique et les protéines virales danslescellules infectées32,33,34,35,36. Le but de cette étude était d’évaluer l’efficacité de la microscopie à super-résolution, en particulier dSTORM, pour visualiser les véhicules électriques en 3D avec une résolution nanométrique. Nous avons utilisé un colorant d’intercalage à membrane photoscommutable pour visualiser avec succès les véhicules électriques individuels des cellules U2OS via dSTORM dans une résolution allant jusqu’à +/- 20 nm sur l’axe XY et une résolution de +/- 50 nm sur l’axe Z. Nos travaux antérieurs ont montré que les VE de plusieurs lignées cellulaires et fluides primaires ont des profils de distribution de taille similaires à ceux analysés par NTA et TEM26,37. L’utilisation d’une caractérisation des véhicules électriques basée sur dSTORM peut ajouter plus de confiance à ce phénomène, ainsi que potentiellement identifier des sous-populations dans un seul champ de vision. Il est justifié d’affiner davantage cette méthode. Un avantage notable de dSTORM est que la préparation de l’échantillon ne nécessite pas d’étapes difficiles ou dommageables qui peuvent altérer la structure des véhicules électriques. Nos résultats démontrent en outre que la nature biochimique des VE est maintenue pendant la purification des VE avec des billes anti-CD81 et de la glycineacide 26,37. Nous avons fixé les VE avec du paraformaldéhyde pour éviter les perméabilisations membranaires causées par d’autres fixateurs tels que le méthanol et l’éthanol. Cela nous a permis de conclure que dSTORM capture avec précision la morphologie des véhicules électriques tels qu’ils existent en solution. L’utilisation de Capto Core 700 est toutefois nécessaire pour purifier efficacement les véhicules électriques des contaminants tels que l’albumine et le polyéthylène glycol en deçà des exigences réglementaires38. Une limitation notable du protocole est que l’efficacité de liaison entre le VE et les lames n’est pas de 100%, de sorte que certains VE sont perdus lors de la préparation de l’échantillon. Des recherches plus approfondies devraient être menées sur l’efficacité des lames revêtues d’adhésif pour mieux lier les véhicules électriques.

Bien que la préparation des VE pour la visualisation soit simple, les paramètres lors de l’acquisition et en particulier lors des modifications post-acquisition varient considérablement d’un échantillon à l’autre, en fonction de l’intensité et de la stabilité des VE et du fluorophore. Une zone de variabilité dans l’expérience est l’intensité des lasers d’excitation qui doivent être délicatement élevés tout au long de l’exposition pour maximiser le signal mais empêcher le photoblanchiment. Le photoblanchiment, ou lorsqu’un fluorophore perd sa capacité à fluorescence, est une limitation significative tout au long de la microscopie à super-résolution12,39. Pour prévenir le photoblanchiment, la concentration de l’enzyme dans le tampon peut être augmentée à 10 mM pour mieux piéger les molécules oxydantes et prévenir le photoblanchiment. De plus, il est essentiel de régler la puissance du laser d’excitation à un niveau initial bas et de l’augmenter lentement tout au long de l’exposition pour maintenir un signal élevé afin d’éviter le photoblanchiment.

Nous avons choisi un colorant rouge photoscommutable pour tacher les véhicules électriques en raison de sa longueur d’onde d’excitation, de sa durabilité et de sa capacité à résister à la fixation29. Cependant, le colorant que nous avons choisi peut présenter des problèmes lors de la microscopie à super-résolution lorsqu’il est excité trop rapidement ou à une intensité trop élevée. Les fluorophores dans le colorant à membrane rouge photoscommutable peuvent photoblanchiment après 10 000 images ou après que la puissance laser dépasse 75,6 mW. De plus, l’intensité du colorant membranaire et sa capacité à fluorescence diminuent considérablement après une semaine de stockage à 4 °C. Enfin, il a été démontré que les colorants d’intercalation de la membrane forment des micelles dans une solution aqueuse, de sorte que tout excès de colorant encore présent dans l’échantillon EV après purification peut être détecté et confondu avec un EV s’il n’y a pas d’autre marqueur pour identifier l’EV, tel qu’une tétraspanine. Une enquête plus approfondie doit être effectuée à l’aide d’autres colorants d’intercalage de membrane pour optimiser la photo-stabilité31,40. Les anticorps fluorescents conjugués à l’EV peuvent être une option plus appropriée car ils ont tendance à être plus résistants au photoblanchiment et peuvent amplifier le signal41. Cependant, l’inconvénient des anticorps est que le signal du fluorophore est légèrement décalé par rapport à l’EV en raison de la distance de l’épitope et du fluorophore sur l’anticorps.

Les méthodes existantes de visualisation et de caractérisation des VE, telles que la NTA, la cytométrie en flux ou l’EM, peuvent nécessiter des étapes de préparation dommageables ou sont des méthodes indirectes de visualisation. dSTORM nécessite peu de préparation d’échantillons, conservant la nature biochimique naturelle des VE, et est une méthode directe de visualisation qui peut contourner la limite de diffraction et visualiser les VE d’un petit diamètre8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. D’autres techniques de microscopie à super-résolution peuvent être optimisées pour la caractérisation EV telles que l’épuisement par émission stimulée (STED), la microscopie confocale à disque rotatif (SDCM) et la microscopie de localisation photo-activée (PALM)42,43. L’étude actuelle se concentre exclusivement sur dSTORM, mais des travaux futurs sur l’optimisation de la microscopie à super-résolution et la comparaison / contraste de ces techniques sont justifiés. Les véhicules électriques sont récemment devenus un domaine de recherche populaire à mesure que leur rôle dans la progression du virus est devenu plus évident. De nombreux virus distincts sur le plan de l’évolution, tels que le virus d’Epstein Barr, le VIH et le virus de l’hépatite A, ont évolué pour tirer parti des voies de signalisation EV afin de favoriser la progression de la maladie et d’échapper à la réponse immunitaire du corps37,44,45,46 , 47,48,49,50 . Il a été démontré que ces virus incorporent des facteurs viraux, tels que des ARNm ou des protéines virales, dans les VE qui peuvent ensuite transférer ces composants à des cellules non infectées, tout en échappant à la détection immunitaire6,51,52,53. Ces facteurs viraux associés à l’exosomale peuvent être détectés et éventuellement utilisés comme biomarqueur de la progression de la maladie54,55. Par conséquent, la visualisation basée sur dSTORM des VE individuels et de leurs protéines associées peut être explorée comme une plate-forme pour les biomarqueurs de la maladie et, peut-être, la progression de la maladie de certains virus54,55. D’autres recherches devraient être effectuées pour évaluer l’utilité de dSTORM dans la visualisation du contenu d’un VE et des protéines sur sa membrane.

En conclusion, nous avons démontré que la microscopie à super-résolution devrait être considérée comme une technique efficace pour la visualisation des véhicules électriques en 3D avec une résolution nanométrique. Les résultats obtenus par dSTORM sont cohérents avec d’autres techniques de caractérisation EV. Un avantage distinct de dSTORM est la possibilité de visualiser directement les particules sous la limite de diffraction de la lumière sans déshydratation ni geler les étapes de fracture qui peuvent modifier la nature biochimique des VE.

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Disclosures

M.G.C. n’a aucun conflit d’intérêts à déclarer. R.P.M et D.P.D. reçoivent un soutien matériel d’Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. et de Cytiva Inc. (anciennement GE Healthcare). R.P.M. et D.P.D. déclarent des intérêts concurrents pour la commercialisation éventuelle de certaines des informations présentées. Ceux-ci sont gérés par l’Université de Caroline du Nord. Les sources de financement n’ont pas participé à l’interprétation ou à la rédaction de ce manuscrit.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Oxford Nanoimaging pour ses commentaires constructifs et ses conseils. Ce travail a été financé par le 5UM1CA121947-10 à R.P.M. et le 1R01DA040394 à D.P.D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

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Biologie numéro 174
Microscopie à reconstruction optique stochastique directe de vésicules extracellulaires en trois dimensions
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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

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