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Biology

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62845
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von allen Zelltypen freigesetzt und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und Homöostase. Die Visualisierung von EVs erfordert aufgrund ihres geringen Durchmessers (40-250 nm), der unterhalb der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie liegt, oft indirekte Methoden. Wir haben eine hochauflösende mikroskopiebasierte Visualisierung von Elektrofahrzeugen entwickelt, um die Beugungsgrenze sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen zu umgehen. Mit diesem Ansatz können wir die dreidimensionale Form von Elektrofahrzeugen auf eine Auflösung von +/- 20 nm auf der XY-Achse und eine Auflösung von +/- 50 nm entlang der Z-Achse auflösen. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die hochauflösende Mikroskopie als Charakterisierungsmethode für EVs, einschließlich Exosomen, sowie von behüllten Viren betrachtet wird.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Vesikel, die von allen Zelltypen freigesetzt werden. Sie enthalten Lipide, Proteine, Metaboliten und Nukleinsäuren und übertragen diese Materialien lokal zwischen Zellen und distal zwischen Geweben und Organen. Es gibt drei primäre Subtypen von EVs: apoptotische Körper, Mikrovesikel und Exosomen1,2. Hier konzentrieren wir unsere Diskussion auf Exosomen und ihre assoziierten Proteine.

Exosomen sind sezernierte Vesikel, die aus dem nach innen gerichteten Austrieb früher Endosomen in den multivesikulären Körper (MVB) stammen. Das MVB verschmilzt dann mit der Plasmamembran und setzt die Exosomen in den extrazellulären Raum frei, um zu anderen Zellen zu gelangen3,4. Exosomen existieren in einem Spektrum von Größen von 40 bis 150 nm und sind angereichert mit endosomalen Transmembranproteinen, die als Tetraspanine (CD9, CD63, CD81), membrangebundener endosomaler Sortierkomplex, der für den Transport erforderlich ist (ESCRT), und Lipid-Raft-assoziierten Proteinen1,2,5,6,7.

Die Charakterisierung der biochemischen Zusammensetzung von Exosomen ist zu einem beliebten Feld für Forscher geworden, um ihre funktionelle Natur besser zu verstehen. Es gibt viele Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung von Exosomen, einschließlich nanoskaliger Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Oberflächenplasmonresonanz, resistiver Pulserfassung und traditioneller Lichtmikroskopie, von denen jede intrinsische Vor- und Nachteileenthält 8,9. TEM und Kryo-EM können eine nanometerbasierte Auflösung erreichen, erfordern jedoch häufig Dehydratisierungs- und Gefrierbruchschritte, wodurch EVs10,11geschrumpft oder lysiert werden. NTA beruht auf Lichtstreuung, die die Charakterisierung von Hunderten von EVs gleichzeitig ermöglicht, ist aber eine indirekte Messung der Partikelgröße und kann nicht leicht zwischen EVs, Viren und Proteinaggregatenunterscheiden 12,13,14,15,16. Die nanoskalige Durchflusszytometrie verwendet Lichtstreuung aus einem Anregungspfad, der dann in Größenmessungen übersetzt werden kann, ist aber eine aufkommende Technologie, und es gibt wenig Konsens darüber, welche Größe der Partikel innerhalb des linearen Detektionsbereichs für verschiedene Instrumente12,17,18 liegt.

Die traditionelle Lichtmikroskopie mit fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen war eine der am häufigsten eingesetzten Techniken zur Visualisierung subzellulärer Kompartimente, Proteinkomplexe und Signalmaschinen innerhalb einer Zelle. Während sich diese Technik bei der Visualisierung der Lokalisation von Komplexen als nützlich erweist, verhindert die Beugungsgrenze der traditionellen Lichtmikroskopie (etwa 250-400 nm) die klare Auflösung von Proteinen oder Strukturen im typischen Größenbereich eines Exosoms (40-150 nm)12,19,20.

Die hochauflösende Mikroskopie, nämlich die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM), unterscheidet sich von der konventionellen Lichtmikroskopie dadurch, dass sie die photoschaltbaren Eigenschaften bestimmter Fluorophore nutzt und diese blinkenden Ereignisse detektiert, um Bilder bis zu einer Nanometergenauigkeit zu rekonstruieren21. Photoswitching-Ereignisse werden mit einer Kamera mit hoher Bildrate im Verlauf von Zehntausenden von Einzelbelichtungen gesammelt, und eine Punktspreizfunktion wird verwendet, um den genauen Standort des photoswitching Fluorophors19,20 , 22mithoher Sicherheitabzubilden. Dadurch kann dSTORM die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie umgehen. Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von hochauflösenden Techniken zur Visualisierung und Verfolgung von Exosomen und ihren assoziierten Proteinen berichtet22,23,24,25. Die endgültige Auflösung hängt von den biophysikalischen Eigenschaften des Fluorophors ab, liegt aber oft zwischen +/-10-100 nm entlang der XY-Achse, was eine Einzelmolekülauflösung ermöglicht.

Die Fähigkeit, einzelne Fluorophore in dieser Größenordnung auf der XY-Achse aufzulösen, hat die Mikroskopie revolutioniert. Es gibt jedoch nur wenige Daten über den dreidimensionalen (3-D) dSTORM eines Exosoms. Daher haben wir versucht, eine Standardarbeitsanweisung (SOP) für die dSTORM-basierte Visualisierung und Charakterisierung von gereinigten Elektrofahrzeugen, einschließlich Exosomen mit Nanometer-Genauigkeit in 3-D, zu etablieren.

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Protocol

1 Vermehrung und Erhaltung von Zelllinien

  1. Erwerben Sie humane Osteosarkomzellen (U2OS) und legen Sie die Zellen in das Wachstumsmedium, ergänzt mit 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin-Lösung.
    HINWEIS: Exosomenfreies fetales Rinderserum wurde nach dem in McNamara et. al.26.
  2. Halten Sie die U2OS-Zellen in einem kupferbeschichteten Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 und Passagezellen in T175-Kolben26,27. Die Zellen müssen in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase gehalten werden, um zu verhindern, dass Subpopulationen entstehen oder sich während der stationären Phase apoptotische Trümmer ansammeln.

2 Exosomenisolierung und -reinigung

  1. Die U2OS-Zelllinien werden in 10 separaten T175-Kolben mit 50 ml Medien pro Kolben bis zum vollen Konfluenz gezüchtet. Entfernen Sie den Zellüberstand und passieren Sie ihn nacheinander durch eine 0,45 μm und 0,22 μm Vakuumfiltrationsapparatur.
  2. Der Überstand wird einer Querstromfiltration (auch als tangentiale Strömungsfiltration bezeichnet) auf einem mit der 750 kDa Hohlfaserkartusche ausgestatteten Filtrationssystem unterzogen, um kleinere Proteine oder Metaboliten zu entfernen28.
    1. Führen Sie den Überstand durch den tangentialen Strömungsfiltrationsoperator mit einem konstanten Vorwärtsdruck von 30 psi, während Sie einen Rückhaltedruck von <20 psi beibehalten, um einen Δ-Druck von 10 oder mehr psi zu erzeugen. Legen Sie einen magnetischen Rührstab in den Retentattank und stellen Sie ihn auf 150 U / min26.
    2. Halten Sie die Vorschubgeschwindigkeit bei 40 ml/min oder höher. Sammeln Sie das Permeat in einem Reservoir und entsorgen Sie es.
  3. Konzentrieren Sie den Überstand auf 30 ml und gleichen Sie ihn dann mit vier Volumina von 1x PBS aus. Sammeln Sie die querstromgefilterte und gleichgewichtete Lösung in einem konischen 50-ml-Rohr.
  4. Die EVs werden bei 4 °C über Nacht in einer Endkonzentration von 40 mg/ml Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 8.000 Da ausgefällt. Die EVs bei 1.200 x g bei 4 °C für 1 h zentrifugieren und in 500 μL 1x PBS resuspenieren.
  5. Inkubieren Sie die EVs mit 50 μg/ml photoschaltbarem rotem Membran-Interkalationsfarbstoff und 50 μg/ml RNase A in 1x PBS bei 4 °C für 1 h.
  6. Entfernen Sie überschüssigen Farbstoff durch eine Säule auf einem Proteinreinigungssystem, das an einem Fraktionssammler befestigt ist. Identifizieren Sie EV-Fraktionen durch UV-Absorption und bündeln Sie sie in einem Mikrozentrifugenrohr26.
  7. Affinität wählt insgesamt 200 μL EVs mit Anti-CD81-Magnetperlen aus, die in 1x PBS äquilibriert sind.
    1. Verdünnen Sie 100 μL der Anti-CD81-Magnetperlen in 1x PBS auf ein Gesamtvolumen von 1 mL und lassen Sie sie bei 4 °C für 2 h in einem 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit kontinuierlichem Schaukeln binden.
  8. Waschen Sie die Anti-CD81-Perlen und ev dreimal mit 1x PBS. Elute CD81+ EV aus der Lösung mit 100 mM Glycin bei pH 2,0 für 30 min bei 37 °C.
  9. Pipettieren Sie den gereinigten CD81+ EV in ein gleiches Volumen von 100 mM Tris-HCl bei pH 7,5 in 1x PBS.
    HINWEIS: Ein Aliquot aus gereinigter CD81+ EV-Lösung kann für die Nanopartikel-Tracking-Analyse oder Elektronenmikroskopie reserviert werden, um die Reinheit der Lösung und das Vorhandensein von EVs26zu bestätigen.

3 Fixierung und Zubereitung

  1. Platzieren Sie affinitätsgereinigte EVs auf Glasboden-μ-Objektträger-8-Well-Platten in einem Gesamtvolumen von 200 μL (kann EV-Probe in 100 mM Tris-HCl bei pH 7,5 in 1x PBS verdünnen) und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C an der Oberfläche haften.
  2. Ohne die vorhandene Lösung von der 8-Well-Platte zu entfernen, befestigen Sie EVs auf den Platten, indem Sie 200 μL 4% Paraformaldehyd in 1x PBS in die EV-haltige Lösung in jeder Vertiefung geben und 30 minuten bei Raumtemperatur21inkubieren lassen.
  3. Entfernen Sie vorsichtig Paraformaldehyd und überschüssige Lösung mit einer Mikropipette, um die EVs nicht zu stören. Waschen Sie das EV mit 1x PBS, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen. Führen Sie den Waschvorgang dreimal durch. Entfernen Sie überschüssige 1x PBS.
  4. Bereiten Sie 250 μL dSTORM B-cubed Buffer Solution pro Probe vor, indem Sie eine Lösung aus 5 mM Protocatechuat-Dioxygenase (Teil A) erzeugen, die in Imaging-Puffer (Teil B) gemäß Herstellerprotokoll verdünnt ist.
    ANMERKUNG: Die Konzentration des Enzyms im Puffer kann auf 10 mM verdoppelt werden, wenn photobleichnet wird.
    1. Fügen Sie 250 μL des vorbereiteten Puffers zu jedem Bohrloch pro Herstellerprotokoll für 20 minuten bei Raumtemperatur hinzu, bevor Sie eine Bildgebung durchführen, um oxidierende Moleküle abzufangen.
      HINWEIS: Das EV kann dann entweder sofort betrachtet oder bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Ersetzen Sie den Puffer nach dem Speicher vor jeder Visualisierung.

4 Direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie Kalibrierung

  1. Bereiten Sie die für die Kalibrierung des hochauflösenden Mikroskops erforderlichen Perlen vor, indem Sie 100 nm Mikrokugeln auf eine Konzentration von 0,5% in molekularbiologischem Wasser verdünnen und 200 μL in jede Vertiefung einer Glasbodenplatte μ 8-Well-Platten pipettieren.
    1. Lassen Sie die Perlen bei Raumtemperatur 1 h in den Vertiefungen absetzen.
  2. Ohne die vorhandene Lösung zu entfernen, geben Sie 200 μL 4% Paraformaldehyd in PBS zu jeder Vertiefung in die Kalibrierperlenlösung und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Entfernen Sie das Paraformaldehyd vorsichtig mit einer Mikropipette, um die Perlen nicht zu stören, und waschen Sie die Perlen dreimal mit 1x PBS. Bereiten Sie den Puffer gemäß Schritt 3.4 vor.
  4. Entfernen Sie 1x PBS und geben Sie 250 μL des vorbereiteten Puffers zu jeder Vertiefung hinzu. Lassen Sie den Puffer vor der Visualisierung 20 Minuten ruhen.
  5. Bevor Sie etwas auf die Bühne stellen, schließen Sie es mit der Taste Mikroskop anschließen an das 3D-Mikroskop an. Fügen Sie dem Objektiv 100x Öl hinzu und platzieren Sie die Mitte des Bohrlochs auf dem Objektiv. Schalten Sie in der Einstellung Erfassen die Anregungslaser 473 und 640 nm ein und klicken Sie auf Ansicht.
    1. Wenn das 3D-Objektiv aktiviert ist, können Sie die Perlen unter der Einstellung für die Photonensättigung anzeigen, indem Sie in den Bildanzeigeoptionen auf Photonenanzahl klicken. Stellen Sie die anfänglichen Laserleistungen für den 473-nm-Laser auf 8,4 mW und für den 640-nm-Laser auf 11,6 mW ein.
    2. Verringern Sie den Fokus des Lasers auf etwa -300 nm oder die Brennebene der Kalibrierperlen, um eine klare Auflösung der einzelnen Perlen zu erzeugen. Sobald die Z-Ebene fokussiert ist, passen Sie die Laserleistungspegel weiter an, um die Variation in jedem Sichtfeld zu berücksichtigen.
  6. Führen Sie unter den Gerätefunktionen die 3D-Mapping-Kalibrierung und die Kanal-Mapping-Kalibrierung durch, um die Fehler auf der X-, Y- und Z-Achse zu erhalten. Legen Sie die maximale Anzahl der FOVs auf 20, die Zielanzahl der Punkte auf 4.000, den maximalen Abstand zwischen den Kanälen auf 5,0 Pixel und den Ausschlussradius zwischen den Kanälen auf 10,0 Pixel während der Kanalzuordnungskalibrierung fest.
  7. Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung eine Punktabdeckung von >90% und eine gute Mapping-Qualität liefert. Speichern Sie die angegebenen Kalibrierdaten für zukünftige Bildaufnahmen.

5 Visualisierung von EV in drei Dimensionen

  1. Fügen Sie 100x Öl auf das Objektiv und legen Sie die vorbereiteten EVs in das Mikroskop. Schalten Sie den 640-nm-Anregungslaser ein, ohne dass die 3D-Linse aktiviert ist, und erhöhen Sie ihn je nach Intensität des Signals und des Sichtfelds zunächst auf 1,2 mW bis 12,5 mW, um die roten Membran-Interkalationsfarbstoff-gefärbten EVs anzuregen.
    1. Wechseln Sie unter den Optionen für die Bildanzeige die Anzeigemethode von photonensättigung zu Perzentilen, um die EVs besser zu visualisieren. Passen Sie die Laserleistung an, um das Rauschen zu minimieren und gleichzeitig das Signal zu maximieren. Behalten Sie alle anderen Parameter bei.
    2. Passen Sie den Fokus der Z-Ebene an, indem Sie auf das Aufwärts- oder Abwärtssymbol auf der Z-Achse klicken.
      HINWEIS: Die Z-Ebene sollte zwischen -200 und -350 nm fokussiert sein, variiert jedoch je nach Sichtfeld.
  2. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 ms, die Bildaufnahme auf 10.000 Bilder und die anfängliche Laserleistung auf 1,2 mW bis 12,5 mW oder die in Schritt 5.1 ermittelte Laserleistung ein, abhängig von der Intensität des Signals und des Sichtfelds.
    1. Aktivieren Sie das 3D-Objektiv über das Symbol und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Erfassen klicken.
  3. Erhöhen Sie während der gesamten Bildaufnahme die Laserleistung um 3 Schritte von 10 alle 1000 Frames oder genug, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Z-Ebene während der Erfassung nicht ein.
    HINWEIS: Der Laser darf auf maximal 90 mW Laserleistung angehoben werden.

6 Modifikation nach der Erfassung und EV-Tracing

  1. Wechseln Sie nach der Bildaufnahme zum Anzeigefenster Analysieren. Führen Sie eine Driftkorrektur für das ungefilterte Bild durch, und aktivieren Sie dann Filter. Passen Sie photonenzahl, Lokalisierungsgenauigkeit, Sigmas und Rahmenindex gemäß Tabelle 1 an.
  2. Überlagern Sie ein XYZ-Ebenenansichtswerkzeug entlang der X-Achse einzelner EVs aus dem Sichtfeld und exportieren . CSV-Dateien von Photoswitching-Ereignissen.
  3. Halbieren Sie einzelne EVs auf der XY-Achse in einem X by Y-Sichtfeld mit einem Linienhistogramm-Werkzeug, das Fotoumschaltereignisse in festgelegte Entfernungsgruppen einteilt.
  4. Nehmen Sie Bilder von einzelnen Elektrofahrzeugen auf und speichern Sie sie als .tiff Dateien.
  5. Erstellen Sie 3D-Videos von einzelnen Elektrofahrzeugen mit einem 3D-Visualisierungstool und Farbe entsprechend der Platzierung entlang der Z-Achse.

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Representative Results

Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit der hochauflösenden Mikroskopie bei der Visualisierung einzelner EVs mit Nanometerauflösung in drei Dimensionen (3-D) zu bewerten. Um die Form und Größe einzelner EVs zu analysieren, verwendeten wir photosschaltbaren Farbstoff und inkubierten die EVs mit einem fernroten, membraninterkalierenden Farbstoff und entfernten überschüssigen Farbstoff durch Chromatographie29. Die affinitätsgefangenen Anti-CD81- und rotgefärbten EVs wurden dann im hochauflösenden Mikroskop unter dem 640-nm-Anregungslaser betrachtet. Nach der Kalibrierung des Mikroskops, das einen durchschnittlichen Fehler von 16 nm auf der XY-Achse und 38 nm auf der Z-Achse erzeugte (Abbildung 1A,B), wurden die gereinigten U2OS EVs erfolgreich mit einer Auflösung von bis zu 20 nm auf der XY-Achse und 50 nm entlang der Z-Achse visualisiert.

Einzelne EVs, die durch dSTORM in 3D-Fotos visualisiert wurden, die während der gesamten Belichtung mit 10.000 Bildern geschaltet wurden, als die Laserleistung erhöht wurde und im aufgenommenen Bild leicht ersichtlich war (Abbildungen 2A, B). Die Bildkorrektur der Z-Ebene, der Photonenzahl, der Sigmas und der Lokalisierungspräzision des rekonstruierten Bildes nach der Aufnahme ermöglichte eine klare Auflösung des EV in 3-D(Abbildung 2C,D). Der EV in Abbildung 2C wurde nur während der ersten 7.000 Frames umgeschaltet, wie die Legende in der oberen rechten Ecke zeigt. Dies ist ein Ergebnis von Photobleichen, die möglicherweise durch eine zu schnelle Erhöhung der Laserleistung verursacht wurden. Das Histogramm bestätigt, dass die Mehrheit der Photoschaltereignisse innerhalb eines Radius von 100 nm auftrat (Abbildung 2E), was bestätigt, dass das visualisierte EV ein Exosom ist und dass die Isolierung von EVs mit kleinem Durchmesser erfolgreich war.

Die Größenverteilungsanalyse wurde an anderen einzeln verfolgten Elektrofahrzeugen unter Verwendung eines Linienhistogramm-Werkzeugs und eines XYZ-Ebenenansichtswerkzeugs durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Mehrheit der Photoschaltereignisse in einem Radius von 100 nm um das Zentrum stattfand(Abbildung 3A,C),was die Fähigkeit von dSTORM, EVs mit kleinem Durchmesser zu visualisieren, weiter validiert. Wie von einem 3D-Visualisierungswerkzeug gesehen, wird der Fehler entlang der Z-Achse erhöht, wodurch ein längliches Endbild des EV entlang der axialen Achse erzeugt wird (Abbildung 3D, Video 1). Photoswitching-Ereignisse wurden nicht mit der EV-Größe korreliert (Abbildung 3E), was zeigt, dass dSTORM-basierte Charakterisierung für kleine EVs wie Exosomen und kleine behüllte Viren mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm verwendet werden kann.

Die richtigen Parameter für Z-Ebene und Sigma sind integraler Bestandteil der richtigen Auflösung der Membran in 3-D. Darüber hinaus sind die richtige Belichtungszeit, die Anzahl der erfassten Frames und die anfängliche Laserebene entscheidend für die Erzeugung eines Bildes eines einzelnen EV mit einer aufgelösten Membran. Es sollte weiter untersucht werden, wie das Mikroskop optimiert und sowohl Die Parameter vor als auch nach der Aufnahme festgelegt werden können, um die Bilder mit der höchsten Auflösung von Elektrofahrzeugen aufzunehmen.

Figure 1
Abbildung 1: Kalibrierung des hochauflösenden Mikroskops in drei Dimensionen unter Verwendung von 100 nm Mikrosphären. (A) Sichtfeld in Graustufen aus der Kalibrierung des Mikroskops mit Mikrokugeln nach Bildkorrekturen nach der Aufnahme. Maßstabsleiste unten rechts. (B) Absolute Kalibrierungsfehler auf der XY-Achse und der Z-Achse wurden durch Kanal-Mapping-Kalibrierung bzw. 3D-Mapping-Kalibrierung erhalten. N = 10 biologische Replikate. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: dSTORM eines einzelnen EV in drei Dimensionen. (A) Graustufen-Sichtfeld von CD81+ affinitätsgereinigten EVs, die mit photoschaltbarem rotem Membran-Interkalationsfarbstoff gefärbt und mit dem 640 nm Anregungslaser angeregt wurden. Maßstabsleiste unten rechts. (B) Sichtfeld von A entsprechend der Kanalfarbe beschriftet. (C) Einzelnes EV aus der vergrößerten Ansicht der weißen Box in A, beschriftet nach dem Frame-Index. Die Heatmap oben rechts zeigt den Frame an, in dem die Photoswitching-Ereignisse aufgezeichnet wurden. Maßstabsleiste unten rechts. (D) EV von C beschriftet nach Kanalfarbe. (E) Die Größenverteilungsanalyse wurde erstellt, indem der EV auf der in D gezeigten gestrichelten Linie halbiert und das Photoswitching-Ereignis mit einem Linienhistogramm-Tool in 15,4-nm-Behälter aufgeteilt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Verteilung der Photoschaltereignisse während der Erfassung eines einzelnen EV in drei Dimensionen. (A) Rekonstruiertes Bild eines CD81+ affinitätsgereinigten EV, das mit einem photoschaltbaren roten Membran-Interkalationsfarbstoff markiert und mit dem 640 nm Anregungslaser angeregt wurde. Maßstabsleiste unten rechts. (B) Box und Whisker-Diagramm der durchschnittlichen Durchmesser von CD81+ affinitätsgereinigten EVs, die mit dem Line Histogram Tool des Mikroskops entlang der XY-Achse erhalten wurden. (Mittelwert = 104 nm, Standardabweichung = 28 nm). (C) Lage einzelner Photoschaltereignisse entlang der XY-Dimension des EV in A, aufgezeichnet während der gesamten 10.000-Frame-Belichtung. (D) Lage einzelner Photoschaltereignisse entlang der XZ-Achse des EV in A, aufgezeichnet während der gesamten 10.000-Frame-Belichtung. (E) Streudiagramm der Anzahl der Photoschaltereignisse, die auf einzelnen Elektrofahrzeugen unterschiedlichen Durchmessers aufgezeichnet wurden. Der R-Quadrat-Wert von 0,1065 zeigt keine Korrelation zwischen der Anzahl der erkannten Photoschaltereignisse und dem EV-Durchmesser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Video 1: 3D-Bild eines einzelnen CD81+ affinitätsgereinigten EV, das mit einem photoschaltbaren roten Membran-Interkalationsfarbstoff beschriftet und mit dem 640-nm-Anregungslaser angeregt wurde. Das Farbschema ist entlang der Z-Achse nach Tiefe beschriftet. Der Fehler entlang der Z-Achse ist länglich. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Variable Min Max
Photonenzahl 200 10,000,000
Z-Position (nm) -300 300
Lokalisierung Präzision X (nm) 0 40
Lokalisierungsgenauigkeit Y (nm) 0 40
Präzision Sigma X (nm) 0 40
Präzision Sigma Y (nm) 0 40
Sigma X (nm) (Kanal 0, 640 nm Laser) 100 350
Sigma Y (nm) (Kanal 0, 640 nm Laser) 100 350
Sigma X (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm Laser) 100 350
Sigma Y (nm) (Kanal 1, 473, 561 nm Laser) 100 350
Frame-Index 0 10,000

Tabelle 1: Parameter für das hochauflösende Mikroskop während der 3D-dSTORM-Erfassung.

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Discussion

EVs sind aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen und der Zell-zu-Zell-Signalgebung zueinembeliebten Untersuchungsgebiet geworden 1,30. Ihre Visualisierung erweist sich jedoch als schwierig, da ihre geringe Größe unter die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie fällt. Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ist eine direkte Visualisierungsmethode, die die Beugungsgrenze umgeht, indem sie Photoschaltereignisse einzelner Fluorophore im Laufe der Zeit erfasst und ein Bild basierend auf diesen blinkenden Ereignissenrekonstruiert 21,31. Die hochauflösende Mikroskopie wurde erfolgreich in 3-D an mehreren zellulären Strukturen wie Aktinfilamenten, Mikrotubuli, in die Plasmamembran eingebetteten Rezeptoren und viralen Proteinen in infizierten Zellendurchgeführt 32,33,34,35,36. Der Zweck dieser Studie war es, die Wirksamkeit der hochauflösenden Mikroskopie, insbesondere dSTORM, zu bewerten, um EVs in 3-D mit Nanometerauflösung zu visualisieren. Wir verwendeten photoschaltbaren Membran-Interkalationsfarbstoff, um einzelne EVs von U2OS-Zellen über dSTORM in einer Auflösung von bis zu +/- 20 nm auf der XY-Achse und einer Auflösung von +/- 50 nm auf der Z-Achse erfolgreich zu visualisieren. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass EVs aus mehreren Zelllinien und Primärflüssigkeiten ähnliche Größenverteilungsprofile aufweisen, wie sie von NTA und TEM26analysiert wurden,37. Die Verwendung einer dSTORM-basierten Charakterisierung von Elektrofahrzeugen kann diesem Phänomen weitere Sicherheit verleihen und möglicherweise Subpopulationen in einem einzigen Sichtfeld identifizieren. Eine weitere Verfeinerung dieser Methode ist gerechtfertigt. Ein bemerkenswerter Vorteil von dSTORM ist, dass die Probenvorbereitung keine harten oder schädlichen Schritte erfordert, die die Struktur der EVs verändern können. Unsere Ergebnisse zeigen weiterhin, dass die biochemische Natur von EVs während der EV-Reinigung mit Anti-CD81-Perlen und saurem Glycin26,37erhalten bleibt. Wir haben die EVs mit Paraformaldehyd fixiert, um Membranpermeabilisierungen zu vermeiden, die durch andere Fixiermittel wie Methanol und Ethanol verursacht werden. Daraus konnten wir schließen, dass dSTORM die Morphologie von Elektrofahrzeugen, wie sie in Lösung existieren, genau erfasst. Die Verwendung von Capto Core 700 ist jedoch notwendig, um die EVs effektiv von Verunreinigungen wie Albumin und Polyethylenglykol zu reinigen, bis sie unter die regulatorischen Anforderungen38 fallen. Eine bemerkenswerte Einschränkung des Protokolls besteht darin, dass die Bindungseffizienz zwischen EV und Objektträgern nicht 100% beträgt, so dass einige EVs während der Probenvorbereitung verloren gehen. Weitere Untersuchungen sollten über die Wirksamkeit von klebstoffbeschichteten Objektträgern durchgeführt werden, um EVs besser zu binden.

Während die Vorbereitung von EVs für die Visualisierung einfach ist, variieren die Parameter während der Erfassung und insbesondere während der Modifikationen nach dem Erwerb von Probe zu Probe erheblich, abhängig von der Intensität und Stabilität der EVs und des Fluorophors. Ein Bereich der Variabilität im Experiment ist die Intensität der Anregungslaser, die während der gesamten Exposition fein angehoben werden müssen, um das Signal zu maximieren, aber Photobleichen zu verhindern. Photobleichen oder wenn ein Fluorophor seine Fähigkeit zur Fluoreszenz verliert, ist eine signifikante Einschränkung in der hochauflösendenMikroskopie 12,39. Um Photobleichen zu verhindern, kann die Konzentration des Enzyms im Puffer auf 10 mM erhöht werden, um oxidierende Moleküle besser abzufangen und Photobleichen zu verhindern. Darüber hinaus ist es wichtig, die Anregungslaserleistung auf ein niedriges Ausgangsniveau einzustellen und sie während der gesamten Exposition langsam zu erhöhen, um ein hohes Signal aufrechtzuerhalten, um Photobleichen zu verhindern.

Wir haben uns für einen roten, photoschaltbaren Farbstoff entschieden, um die EVs aufgrund seiner Anregungswellenlänge, Haltbarkeit und Fähigkeit, der Fixierung zu widerstehen, zu färben29. Der von uns gewählte Farbstoff kann jedoch während der hochauflösenden Mikroskopie Probleme bereiten, wenn er zu schnell oder mit zu hoher Intensität angeregt wird. Die Fluorophore im photoschaltbaren roten Membranfarbstoff können nach 10.000 Bildern oder nach überschreiten der Laserleistung von 75,6 mW photobleichen. Darüber hinaus nimmt die Intensität und Fluoreszenzfähigkeit des Membranfarbstoffs nach einer Woche Lagerung bei 4 °C erheblich ab. Schließlich wurde gezeigt, dass die Membraninterkalationsfarbstoffe in einer wässrigen Lösung Mizellen bilden, so dass jeder überschüssige Farbstoff, der nach der Reinigung noch in der EV-Probe vorhanden ist, nachgewiesen und mit einem EV verwechselt werden kann, wenn es keinen anderen Marker zur Identifizierung des EV gibt, wie z. B. ein Tetraspanin. Weitere Untersuchungen sollten unter Verwendung anderer Membraninterkalationsfarbstoffe durchgeführt werden, um die Photostabilität31,40zu optimieren. Fluoreszierende Antikörper, die an das EV konjugiert sind, können eine geeignetere Option sein, da sie tendenziell resistenter gegen Photobleiche sind und das Signal verstärken können41. Der Nachteil von Antikörpern besteht jedoch darin, dass das Signal des Fluorophors aufgrund der Entfernung vom Epitop und Fluorophor auf dem Antikörper leicht vom EV versetzt ist.

Bestehende Methoden der EV-Visualisierung und -Charakterisierung, wie NTA, Durchflusszytometrie oder EM, können schädliche Vorbereitungsschritte erfordern oder sind indirekte Visualisierungsmethoden. dSTORM erfordert wenig Probenvorbereitung, bewahrt die natürliche biochemische Natur von Elektrofahrzeugen und ist eine direkte Visualisierungsmethode, die die Beugungsgrenze umgehen und EVs mit einem kleinen Durchmesservon 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,21, 26. Andere Techniken der hochauflösenden Mikroskopie können für die EV-Charakterisierung optimiert werden, wie z.B. stimulierte Emissionsverarmung (STED), Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie (SDCM) und photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)42,43. Die aktuelle Studie konzentriert sich ausschließlich auf dSTORM, aber zukünftige Arbeiten zur Optimierung der hochauflösenden Mikroskopie und zum Vergleich / Kontrast dieser Techniken sind gerechtfertigt. Elektrofahrzeuge sind in letzter Zeit zu einem beliebten Forschungsgebiet geworden, da ihre Rolle bei der Virusprogression deutlicher geworden ist. Viele evolutionär unterschiedliche Viren, wie das Epstein-Barr-Virus, HIV und das Hepatitis-A-Virus, haben sich entwickelt, um die Vorteile der EV-Signalwege zu nutzen, um das Fortschreiten der Krankheit zu fördern und die Immunantwort des Körpers zu umgehen37,44,45,46,47,48,49,50 . Es wurde gezeigt, dass diese Viren virale Faktoren wie mRNAs oder virale Proteine in EVs einbauen, die diese Komponenten dann auf nicht infizierte Zellen übertragen können, während sie dem Immunnachweisentkommen 6,51,52,53. Diese exosomal-assoziierten viralen Faktoren können nachgewiesen und möglicherweise als Biomarker für das Fortschreiten der Erkrankung verwendet werden54,55. Daher kann die dSTORM-basierte Visualisierung einzelner EVs und ihrer assoziierten Proteine als Plattform für Krankheitsbiomarker und möglicherweise krankheitsbereinigte Bestimmte Viren erforscht werden54,55. Weitere Forschung sollte durchgeführt werden, um den Nutzen von dSTORM bei der Visualisierung sowohl des Inhalts eines EV als auch der Proteine auf seiner Membran zu bewerten.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die hochauflösende Mikroskopie als eine effektive Technik für die Visualisierung von Elektrofahrzeugen in 3-D mit Nanometerauflösung angesehen werden sollte. Die von dSTORM erhaltenen Ergebnisse stimmen mit anderen EV-Charakterisierungstechniken überein. Ein deutlicher Vorteil von dSTORM ist die Fähigkeit, Partikel unterhalb der Beugungsgrenze des Lichts direkt zu visualisieren, ohne dass Dehydratisierungs- oder Gefrierbruchschritte auftreten, die die biochemische Natur von Elektrofahrzeugen verändern können.

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Disclosures

M.G.C. hat keine Interessenkonflikte zu erklären. R.P.M und D.P.D. erhalten materielle Unterstützung von Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. und Cytiva Inc. (ehemals GE Healthcare). R.P.M. und D.P.D. erklären konkurrierende Interessen für die mögliche Kommerzialisierung einiger der präsentierten Informationen. Diese werden von der University of North Carolina verwaltet. Die Finanzierungsquellen waren nicht an den Interpretationen oder dem Schreiben dieses Manuskripts beteiligt.

Acknowledgments

Wir danken Oxford Nanoimaging für das konstruktive Feedback und die Anleitung. Diese Arbeit wurde durch die 5UM1CA121947-10 an R.P.M. und die 1R01DA040394 an D.P.D. finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW

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Biologie Heft 174
Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen
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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).

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