Summary
هنا ، يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، باستخدام اختبار لوني بسيط وراسخ يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات.
Abstract
الحديد هو أحد المغذيات الدقيقة الأساسية. كل من الحمل الزائد للحديد ونقصه ضاران للغاية بالبشر ، ويتم تنظيم مستويات الحديد في الأنسجة بدقة. كان استخدام النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد مفيدا لتعزيز المعرفة بالآليات التي ينطوي عليها التنظيم النظامي والخلوي لتوازن الحديد. عادة ما يتم قياس مستويات الحديد الكلية في الأنسجة الحيوانية باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الذري أو باستخدام فحص قياس الألوان بناء على تفاعل الحديد غير الهيم مع كاشف باثوفينانثرولين. لسنوات عديدة ، تم استخدام فحص الألوان لقياس محتوى الحديد غير الهيم في مجموعة واسعة من الأنسجة الحيوانية. على عكس التحليل الطيفي للامتصاص الذري ، فإنه يستبعد مساهمة حديد الهيم المشتق من الهيموغلوبين الموجود في خلايا الدم الحمراء. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يتطلب مهارات تحليلية متطورة أو معدات باهظة الثمن، وبالتالي يمكن تنفيذه بسهولة في معظم المختبرات. وأخيرا، يمكن أن يكون الفحص اللوني إما قائما على كوفيت أو متكيفا مع تنسيق صفيحة صغيرة، مما يسمح بإنتاجية أعلى للعينة. يوفر هذا العمل بروتوكولا راسخا مناسبا للكشف عن التغيرات في مستويات الحديد في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد للحديد أو نقص الحديد.
Introduction
الحديد هو أحد المغذيات الدقيقة الأساسية ، اللازمة لوظيفة البروتينات المشاركة في العمليات البيولوجية الحاسمة مثل نقل الأكسجين أو إنتاج الطاقة أو تخليق الحمض النووي. الأهم من ذلك ، أن كل من فائض الحديد ونقص الحديد ضاران للغاية بصحة الإنسان ، ويتم تنظيم مستويات الحديد في الأنسجة بدقة. يعد امتصاص الحديد الغذائي غير الطبيعي ، والوجبات الغذائية التي تعاني من نقص الحديد ، وعمليات نقل الدم المتكررة ، والالتهابات المزمنة من الأسباب الشائعة للاضطرابات المرتبطة بالحديد التي تؤثر على مليارات الأشخاص في جميع أنحاء العالم1،2،3.
كانت النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد مفيدة لتعزيز معرفتنا بالآليات التي ينطوي عليها التنظيم النظامي والخلوي لتوازن الحديد4. وعلى الرغم من التقدم الكبير المحرز خلال العقدين الماضيين، لا تزال العديد من الجوانب الرئيسية بعيدة المنال. في السنوات القادمة ، سيظل القياس الدقيق لمستويات الحديد الإجمالية في الأنسجة الحيوانية خطوة حاسمة للمضي قدما في البحث في مجال بيولوجيا الحديد.
تقوم معظم المختبرات بقياس كمية حديد الأنسجة إما باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص الذري (AAS) أو قياس الطيف الكتلي للبلازما المقترن بالحث (ICP-MS) أو فحص الألوان بناء على تفاعل الحديد غير الهيم مع كاشف باثوفينانثرولين. يعتمد هذا الأخير على الطريقة الأصلية التي وصفها تورانس وبوثويل منذ أكثر من 50 عاما5,6. في حين تم تطوير شكل مختلف من هذه الطريقة في وقت لاحق باستخدام الفيروزين كبديل ل bathophenanthroline7 ، فإن هذا الأخير لا يزال الكاشف الكروموجيني الأكثر استشهادا على نطاق واسع في الأدبيات.
تعتمد طريقة الاختيار غالبا على الخبرة والبنية التحتية المتاحة. في حين أن AAS و ICP-MS أكثر حساسية ، إلا أن اختبار قياس الألوان لا يزال يستخدم على نطاق واسع لأنه يقدم المزايا الهامة التالية: أ) يستبعد مساهمة حديد الهيم المشتق من الهيموغلوبين الموجود في خلايا الدم الحمراء. ب) لا يتطلب مهارات تحليلية متطورة أو معدات باهظة الثمن ؛ و iii) يمكن تكييف الفحص الأصلي القائم على cuvette مع تنسيق microplate ، مما يسمح بإنتاجية أعلى للعينة. يستخدم نهج قياس الألوان المقدم في هذا العمل بشكل روتيني لقياس التغيرات في مستويات الحديد غير الهيم في الأنسجة في مجموعة متنوعة من النماذج الحيوانية التجريبية للحمل الزائد للحديد الزائد أو نقص الحديد ، من القوارض إلى الأسماك وذبابة الفاكهة. هنا ، يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، باستخدام اختبار بسيط وراسخ ومقياس الألوان يجب أن تجده معظم المختبرات سهل التنفيذ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم شراء الفئران C57BL/6 تجاريا وكانت الفئران الهيبسيدين الخالية (Hamp1−/−) على خلفية C57BL/68 هدية كريمة من صوفي فولونت (معهد كوتشين، فرنسا). تم إيواء الحيوانات في منشأة الحيوانات i3S في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، في بيئة يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة والضوء ، مع حرية الوصول إلى تشاو القوارض القياسية والمياه. تم شراء قاروص البحر الأوروبي (Dicentrarchus labrax) من مزرعة سمكية تجارية وتم إيواؤه في منشأة ICBAS الحيوانية ، في بيئة يتم التحكم في درجة حرارتها وضوءها ، وتم تغذيتها يوميا بتغذية قاروص البحر القياسية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات الفقارية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات i3S والسلطة الوطنية ، Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). يتم سرد معلومات حول الكواشف التجارية والمعدات والحيوانات في جدول المواد.
1. إعداد الحل
ملاحظة: قم بالتعامل مع جميع الكواشف والمحاليل وإعدادها باستخدام الأواني الزجاجية الخالية من الحديد أو الأواني البلاستيكية التي تستخدم لمرة واحدة. لا تسمح للمواد المختبرية المعدنية (مثل ملاعق الفولاذ المقاوم للصدأ) بالتلامس مع أي كاشف أو محلول ، بسبب خطر تلوث الحديد. تأكد من أن أي أواني زجاجية قابلة لإعادة الاستخدام خالية من الحديد. اغسل المواد بالمنظفات المخبرية المناسبة لمدة 30-60 دقيقة ، وشطفها بالماء منزوع الأيونات ، وانقع طوال الليل في محلول حمض النيتريك بنسبة 37٪ المخفف 1: 3 بالماء منزوع الأيونات ، وشطف مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات ، واتركه حتى يجف.
- خليط الحمض: أضف 10 غرام من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك إلى 82.2 مل من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ في زجاجة زجاجية ، وتذوب تماما ، وتضبط الحجم النهائي إلى 100 مل بالماء منزوع الأيونات. رجه قبل الاستخدام. بدلا من ذلك ، استخدم 37٪ فقط من حمض الهيدروكلوريك لهضم الأنسجة.
ملاحظة: الحل مستقر لمدة 2 أشهر على الأقل عند تخزينه في زجاجات كاشف زجاجية بنية داكنة.
تحذير: حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك مسببان للتآكل، وتطلق الأشكال المركزة أبخرة حمضية سامة. ارتد الملابس الواقية والقفازات المقاومة للمواد الكيميائية والنظارات الواقية من الرذاذ الكيميائي في جميع الأوقات عند التعامل مع الأحماض. تجنب استنشاقها وتعامل دائما مع الأحماض أثناء وجودك تحت غطاء الدخان. - خلات الصوديوم المشبعة: أضف 228 جم من خلات الصوديوم اللامائية إلى 400 مل من الماء منزوع الأيونات في زجاجة زجاجية وحرك طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. دع المحلول يرتاح ويعجل لمدة يوم. في حالة عدم حدوث هطول أمطار ، استمر في إضافة كميات صغيرة من خلات الصوديوم. تخزين الحل في زجاجة زجاجية.
- كاشف كروموجين: لإعداد 1 مل من كاشف الكروموجين ، أضف 1 ملغ من 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline disulfonic acid disodium salt إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 10 ميكرولتر من حمض الثيوغليكوليك المركز (100٪) ، ويذوب تماما. تشكل الحجم النهائي إلى 1 مل مع الماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: قم بإعداد أكبر قدر ممكن من كاشف الكروموجين حسب الحاجة. الحل مستقر لمدة 1 شهر عند حمايته من الضوء. - كاشف كروموجين العامل (WCR): أضف 1 حجم من كاشف الكروموجين إلى 5 أحجام من خلات الصوديوم المشبعة و 5 أحجام من الماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: يجب تحضير هذا المحلول طازجا في يوم الاستخدام. - الحل القياسي للحديد المخزون: لإعداد محلول حديد مخزون 20 ملليمتر ، ضع 111.5 ملغ من مسحوق حديد الكربونيل في قارورة حجمية سعة 250 مل تحتوي على 5480 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪. اتركيه ليذوب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (أو احتضنيه في حمام مائي مغلي). ثم ، قم بتكوين المحلول إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل بالماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالحل القياسي إلى أجل غير مسمى عند تخزينه في وعاء مغلق بإحكام. - محلول الحديد القياسي العامل (WISS): أضف 13.5 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك بنسبة 37٪ إلى 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 10 ميكرولتر من محلول ستوك الحديد القياسي وشكل الحجم النهائي إلى 1 مل بالماء منزوع الأيونات (11.169 ميكروغرام من Fe / mL ، 200 ميكرومتر ؛ مقاسة بواسطة AAS).
ملاحظة: يجب إعداد حل العمل طازجا في يوم الاستخدام.
2. تجفيف العينات
- قطع عينة من الأنسجة التي تزن 10-100 ملغ باستخدام شفرة مشرط. قم بوزنه بدقة في ميزان تحليلي / دقيق على قطعة صغيرة من البارافيلم (الوزن الطازج).
- باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع قطعة الأنسجة في صفيحة من 24 بئرا (غير مغطاة للسماح بتبخر الماء) واتركها تجف على حاضنة قياسية عند 65 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- بدلا من ذلك ، استخدم فرن هضم الميكروويف المختبري لتجفيف عينات الأنسجة. باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع قطعة الأنسجة الموزونة في كوب تفلون خال من الحديد وجففها في الميكروويف. اضبط معلمات التشغيل وفقا لدليل تعليمات الأداة.
ملاحظة: كمرجع، تظهر معلمات التشغيل لتجفيف عينات الكبد باستخدام فرن الهضم المحدد (انظر جدول المواد) في الجدول 1. - باستخدام ملاقط بلاستيكية ، ضع كل قطعة مجففة من الأنسجة فوق قطعة صغيرة من البارافيلم داخل ميزان تحليلي / دقيق وقم بوزنها بدقة (الوزن الجاف).
3. عينة الهضم الحمضي
- باستخدام ملاقط بلاستيكية ، انقل كل قطعة مجففة من الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
- أضف 1 مل من خليط الحمض وأغلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قم بإعداد حمض فارغ بنفس الطريقة ، باستثناء حذف الأنسجة.
تحذير: خليط الحمض قابل للتآكل ويطلق أبخرة سامة. ارتد ملابس واقية وقفازات مقاومة للمواد الكيميائية ونظارات رذاذ كيميائية عند التعامل مع خليط الحمض. تجنب استنشاقه وتعامل معه دائما أثناء وجوده تحت غطاء الدخان. - هضم الأنسجة عن طريق احتضان أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في حاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
- بعد التبريد إلى درجة حرارة الغرفة ، انقل 500 ميكرولتر من مستخلص الحمض الصافي (الأصفر) (supernatant) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل باستخدام ماصة دقيقة مزودة بأطراف بلاستيكية. إذا لم يكن من الممكن الحصول على مادة فائقة واضحة ، فقم بإجراء دورة طرد مركزي قصيرة.
تحذير: السوبرناتانت شديد الحموضة. ارتد الملابس الواقية والقفازات المقاومة للمواد الكيميائية والنظارات الواقية من الرذاذ الكيميائي عند التعامل مع المواد الخارقة. تعامل معها دائما أثناء وجودك تحت غطاء الدخان.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام مستخلصات الحمض على الفور لفحص قياس الألوان أو تجميدها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. قم بإذابة العينات المجمدة تماما إلى درجة حرارة الغرفة ودوامتها قبل الاستخدام.
4. تطوير اللون
- قم بإعداد تفاعلات الكروموجين كما هو موضح في الجدول 2 في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل أو ، للحصول على إنتاجية أعلى ، مباشرة في القاع المسطح ، 96 بئرا ، واضحة ، غير معالجة صفائح البوليسترين الدقيقة. قم بإعداد جميع التفاعلات (الحمض الفارغ والقياسي والعينة) على الأقل في نسختين.
- تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
5. قراءة الامتصاص
- قياس امتصاص العينة في مقياس الطيف الضوئي أو قارئ الصفائح عند طول موجي يبلغ 535 نانومتر مقابل مرجع مائي منزوع الأيونات. يمكن قراءة اللوحات بدون غطاء أو غطاء. في العلبة المغطاة ، قم بإزالة أي تكثيف يتشكل بسبب إطلاق أبخرة الحمض من الغطاء قبل القياس مباشرة لتجنب التداخل المحتمل مع قراءة الامتصاص.
ملاحظة: يجب أن يكون الامتصاص البصري للحمض الفارغ المقروء مقابل الماء منزوع الأيونات (المرجع) أقل من 0.015 ؛ يجب أن يكون الامتصاص البصري للمعيار والعينات بين 0.100 و 1.000. بالنسبة للعينات ذات المحتوى العالي جدا أو المنخفض جدا من الحديد ، قد تحتاج أحجام مستخلص الحمض (supernatant) و diH2O إلى التعديل (الجدول 2): إذا كان الامتصاص أكبر من 1.0 ، فاستخدم حجم عينة أصغر (supernatant) ؛ عندما يكون الامتصاص أقل من 0.1 ، استخدم حجما أكبر من supernatant. يؤخذ حجم العينة (Vsmp) في الاعتبار عند حساب محتوى الحديد في الأنسجة لكل عينة (انظر الخطوة 6).
6. حساب محتوى الحديد الأنسجة
- احسب محتوى الحديد من الأنسجة غير الهيمية بالمعادلة التالية:
حديد الأنسجة (ميكروغرام / غرام من الأنسجة الجافة) =
AT = امتصاص عينة الاختبار
AB = امتصاص حمض فارغ
AS = امتصاص قياسي
فاس = تركيز الحديد من WISS (ميكروغرام Fe/mL)
W = وزن الأنسجة الجافة (جم)
Vsmp = حجم العينة (حجم متغير من Supernatant في الجدول 2 المحول إلى مل)
Vf = الحجم النهائي لخليط الحمض بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند 65 درجة مئوية (المقابلة لحجم الحمض بالإضافة إلى حجم الأنسجة الجافة في مل ؛ إذا كانت أوزان العينة لا تختلف اختلافا كبيرا ، افترض أن الحجم الثابت ≈ 1 مل)
Vstd = الحجم القياسي للحديد (حجم WISS في الجدول 2 المحول إلى مل)
Vrv = حجم التفاعل النهائي (الحجم الإجمالي في الجدول 2 المحول إلى مل)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقارنة بين كوفيت و 96 بئرا
يعتمد قياس الحديد غير الهيمي عن طريق التفاعل مع كاشف باثوفينانثرولين الموصوف أصلا من قبل تورانس وبوثويل5،6 على استخدام مقياس الطيف الضوئي لقراءة الامتصاص. وبالتالي ، فإن الأحجام المستخدمة في تفاعل الكروموجين متوافقة مع حجم كوفيت مقياس الطيف الضوئي العادي. يصف هذا العمل طريقة التكيف التي يتم فيها تحضير تفاعلات الكروموجين مباشرة في صفيحة صغيرة من 96 بئرا لقياس الامتصاص في قارئ الصفائح الدقيقة ، مما يتطلب أحجام كاشفة أصغر ويسمح بإنتاجية أعلى.
ولمقارنة حساسية كلا النهجين، تم في البداية إعداد تخفيف تسلسلي للمحلول القياسي للحديد العامل (WISS)، وتم تجميع تفاعلات الكروموجين إما في أنابيب 1.5 مل أو في صفائح من 96 بئرا، كما هو مبين في الجدول 2. تم قياس الامتصاص في مقياس الطيف الضوئي (مع cuvette) أو في قارئ microplate ، على التوالي. ويبين الشكل 1 ألف المنحنيات القياسية التمثيلية المتولدة باستخدام النهجين. في كلتا الحالتين ، كانت الخطية عالية جدا (r2 = 0.9996 و r2 = 0.9997 للصفيحة الدقيقة و cuvette ، على التوالي) عبر تركيزات الحديد التي تم اختبارها.
ومن الجدير بالذكر أنه تم استخدام نظام WISS يحتوي على 11.169 ميكروغرام من Fe/mL. وتبين البيانات الحالية أنه يمكن استخدام تركيزات أقل من الحديد لإعداد المعيار. ومع ذلك ، لا ينصح باستخدام WISS بتركيزات حديد أعلى ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى قيم امتصاص تتجاوز النطاق الديناميكي الخطي للكشف عن مقياس الطيف الضوئي ، مما يتسبب في استقرار المنحنيات القياسية.
لمزيد من المقارنة بين الفحوصات القائمة على الكوفيت والصفائح الدقيقة ، تم قياس محتوى الحديد غير الهيم في ما مجموعه 55 عينة من أنسجة الفئران (الكبد والطحال والقلب والرئة ونخاع العظام). ولوحظت درجة عالية جدا من الارتباط بين المنهجيتين (r = 0.999 و p < 0.0001)، مما يشير إلى أن الطريقة القائمة على الصفائح الدقيقة هي بديل صالح للطريقة الأصلية القائمة على الكوفيت (الشكل 1B).
وأخيرا ، تم تحديد مستويات الحديد غير الهيم في أنسجة الفئران بالطريقة القائمة على الصفائح الدقيقة بعد الهضم الحمضي للعينات المشتقة من نفس الأنسجة إما بمزيج من حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (وفقا لوصف الطريقة الأصلية) أو حمض الهيدروكلوريك وحده. لوحظ وجود علاقة عالية جدا (r = 0.999 ، p < 0.0001 ، الشكل 1C) ، مما يدل على أنه يمكن حذف حمض ثلاثي كلورو أسيتيك من هضم الحمض.
تم الحصول على النتائج التمثيلية المدرجة أدناه عن طريق قياس امتصاص العينات في لوحات 96 بئرا.
قياس مستويات الحديد غير الهيم في الأنسجة في نموذج الفأر لداء ترسب الأصبغة الدموية الوراثي
باستخدام فحص قياس الألوان القائم على باثوفينانثرولين ، تم تحديد محتوى الحديد غير الهيم في أنسجة مختلفة (الكبد والطحال والقلب والبنكرياس) من سلالة الفئران الشائعة الاستخدام C57BL/6 ومن الفئران بالضربة القاضية للهيبسيدين (Hamp1-/-) (في خلفية وراثية C57BL / 6). يتم تصوير مستويات الحديد التمثيلية في الشكل 2. الهيبسيدين هو منظم رئيسي لعملية التمثيل الغذائي للحديد ويؤدي تعطيله إلى النمط الظاهري لترسيب الحديد الشبيه بترسب الدم ، مع تراكم الحديد الكبدي والبنكرياس والقلب الشديد ، واستنفاد الحديد الطحالي8.
قياس مستويات الحديد غير الهيم في كبد قاروص البحر بعد التعديل التجريبي للحديد
باستخدام فحص قياس الألوان القائم على باثوفينانثرولين ، تم تحديد مستويات الحديد غير الهيم في الكبد السليم (السيطرة) ، المعالج بالحديد (2 ملغ من ديكستران الحديد الذي يتم إعطاؤه عبر الطريق داخل الصفاق) وفقر الدم (2٪ مقابل / ث من الدم المسحوب من الأوعية الذيلية) قاروص البحر الأوروبي (Dicentrarchus labrax). كما هو متوقع ، زادت مستويات الحديد الكبدي بشكل كبير في الحيوانات المعالجة بالحديد ، في حين تسبب فقر الدم في انخفاض طفيف في مخازن الحديد الكبدي (الشكل 3).
قياس مستويات الحديد غير الهيم في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر الكاملة
على الرغم من أن الطريقة الحالية ليست مناسبة لقياس مستويات الحديد غير الهيم في ذباب ذبابة الفاكهة الفردية بسبب كتلة جسمها الصغيرة (متوسط الوزن هو 0.6 ملغ و 0.8 ملغ للذكور والإناث ، على التوالي)9 ، يمكن استخدامه بنجاح مع الذباب المجمع. ويصور الشكل 4 مستويات الحديد التمثيلية غير الهيم لمجموعات من 20 ذكورا كاملا، إما من النوع البري أوريغون-آر أو مالفوليو (Mvl) بالضربة القاضية. Mvl هو تجانس جين SLC11A2 للثدييات ، والذي يشفر لبروتين يسمى ناقل المعادن الثنائي 1 (DMT1) ، ويؤدي تعطيله الجيني إلى نقص الحديد10. كما هو متوقع ، قدم ذباب Mlv محتوى أقل بكثير من الحديد غير الهيم مقارنة بالنوع البري.
| قوة 650W (٪): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| الضغط (رطل لكل بوصة مربعة): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| الوقت (دقيقة): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| الوقت عند الضغط (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| مروحة: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
الجدول 1: معلمات التشغيل لتجفيف الكبد في فرن الهضم بالميكروويف المستخدم هنا.
| WCR (ميكرولتر) | خليط حمضي (ميكرولتر) | سوبرناتانت (ميكرولتر) | WISS (ميكرولتر) | diH2O (ميكرولتر) | الحجم الكلي (ميكرولتر) | ||
| أنابيب 1.5 مل | حمض فارغ | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| معيار | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| عينة | 1000 | متغير | متغير | 1300 | |||
| 96 بئر ميكروبليت | حمض فارغ | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| معيار | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| عينة | 150 | متغير | متغير | 195 |
الجدول 2: تحضير تفاعلات الكروموجين إما في أنابيب 1.5 مل أو صفائح 96 بئرا.
الشكل 1: تحديد الحديد غير الهيم بواسطة المقايسات اللونية القائمة على الصفائح الدقيقة أو 96 بئرا. (أ) المنحنيات القياسية للصفائح الدقيقة (المربعات المفتوحة) والمقايسات القائمة على الكوفيت (المثلثات 
المفتوحة Δ). (ب) العلاقة بين مستويات الحديد غير الهيم القائمة على الكوفيت والصفائح الدقيقة في 55 عينة أنسجة من ذكور C57BL / 6 البالغة من العمر 6 أشهر ، بما في ذلك الكبد (الدوائر الصلبة) والطحال (الدوائر 
المفتوحة) والقلب (المثلثات 
الصلبة) والرئة (العلامات النجمية) ونخاع العظم 
(الماس
). (ج) مستويات الحديد غير الهيم في مجموعة فرعية من الأنسجة من الفئران الذكور البالغة من العمر 6 أشهر (الكبد ، الدوائر الصلبة ؛ الطحال ، الدوائر المفتوحة) تقاس بالفحص القائم على الصفائح الدقيقة 96 جيدا بعد الهضم الحمضي للعينات بمزيج من حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (HCl + C2HCl3O2) أو حمض الهيدروكلوريك وحده (HCl). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: محتوى الحديد غير الهيم المحدد في الأنسجة المختلفة بواسطة فحص قياس الألوان القائم على باثوفينانثرولين. مستويات الحديد غير الهيم في الكبد والطحال والقلب والبنكرياس من الذكور C57BL / 6 الفئران البرية (الدوائر المفتوحة) والذكور التي تعاني من نقص الهيبسيدين Hamp1-/- الفئران على الخلفية الوراثية C57BL / 6 (المربعات المفتوحة) في سن 8 أسابيع ، تقاس باستخدام فحص قياس الألوان القائم على bathophenanthroline. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مستويات الحديد الكبدي غير الهيم في أنثى اليافعين في قاروص البحر الأوروبي بعد تعديل الحديد التجريبي. تم تحقيق الحمل الزائد للحديد عن طريق إعطاء داخل الصفاق 2 ملغ من ديكستران الحديد ، في حين تم تحفيز فقر الدم عن طريق سحب 2٪ مقابل / ث من الدم من الأوعية الذيلية. تم جمع الكبد في 4 أيام بعد علاج الحديد أو جمع الدم. كانت المكافحة قاروص البحر صحية وغير معالجة. تم قياس مستويات الحديد غير الهيم باستخدام فحص قياس الألوان القائم على باثوفينانثرولين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مستويات الحديد غير الهيم في ذبابة الفاكهة البالغة من العمر 1 شهر ، والتي تم قياسها باستخدام فحص الألوان القائم على bathophenanthroline. أظهرت النتائج (أ) محتوى الحديد غير الهيم في كل تجمع من 20 ذبابة أو (ب) محتوى الحديد المقدر لكل ذبابة فردية ، مع الأخذ في الاعتبار متوسط وزن 0.64 ملغ / ذبابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم توفير بروتوكول لقياس محتوى الحديد غير الهيم في الأنسجة الحيوانية ، وذلك باستخدام تكييف لفحص الألوان القائم على bathophenanthroline الذي وصفه تورانس و Bothwell5,6 في الأصل. الخطوات الحاسمة لهذه الطريقة هي تجفيف عينات الأنسجة. تمسخ البروتين وإطلاق الحديد غير العضوي عن طريق التحلل المائي الحمضي ؛ الحد من الحديد الحديديك (Fe3 +) إلى الحالة الحديدية (Fe2 +) في وجود العامل المختزل حمض الثيوغليكوليك ، وتفاعله مع كاشف باثوفينانثرولين (تفاعل الكروموجين) ؛ قراءة الامتصاص للمجمع الوردي الأيون الحديدي / باثوفينانثرولين الناتج ؛ وحساب محتوى الحديد في الأنسجة.
يوضح هذا العمل كيف يمكن تكييف البروتوكول الأصلي القائم على كوفيت مع تنسيق قائم على 96 بشكل جيد للحصول على إنتاجية أعلى ، دون المساس بحساسية المقايسة. ومن الجدير بالذكر أن هذا التكيف يسمح بتوفير وقت كبير حيث: 1) يمكن تحضير عدد أكبر من تفاعلات الكروموجين في وقت واحد في لوحات 96 بئرا باستخدام ماصات متعددة القنوات. و 2) قراءات الامتصاص أسرع بشكل كبير في قارئ الألواح مما كانت عليه عند استخدام مقياس الطيف الضوئي. ميزة أخرى مهمة للفحص القائم على الصفائح الدقيقة هي تعديل أحجام تفاعل الكروموجين ، مما يقلل بشكل كبير من التكاليف باستخدام الكواشف (خاصة مع كاشف bathophenanthroline). يمكن إكمال البروتوكول بأكمله في غضون 4 أيام. تجفيف العينات (الذي قد يستغرق ما يصل إلى 48 ساعة عند إجرائه في فرن عند 65 درجة مئوية) والهضم الحمضي (الذي يتم إجراؤه بسهولة بين عشية وضحاها لمدة 20 ساعة) هما الخطوتان الأكثر استهلاكا للوقت. يمكن تسريع تجفيف العينات باستخدام فرن هضم الميكروويف المصمم للاستخدام المختبري في هضم مجموعة واسعة من المواد أو إذابتها أو تحللها أو تجفيفها. نظرا لأنه من الممكن تجفيف معظم عينات الأنسجة في أقل من 2.5 ساعة ، يمكن للمرء إجراء البروتوكول بأكمله في يومين فقط. ومع ذلك ، نظرا لأن سعة الميكروويف تقتصر على عدد أكواب التفلون التي يمكن أن تناسبها ، ولأن الأكواب تحتاج إلى الغسيل وإزالة التلوث بعد كل استخدام ، فقد يجد المستخدمون أنه من الأنسب تجفيف العينات في ألواح 24 بئرا عند 65 درجة مئوية عند التعامل مع عدد كبير من العينات. لا يزال من الممكن تقليل الوقت اللازم لتجفيف الأنسجة باستخدام درجات حرارة أعلى من 65 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، يجب تجنب المواد البلاستيكية بسبب خطر الذوبان.
في السابق ، طور Grundy et al.11 تكييفا للطريقة التي يتم بها إجراء الفحص بأكمله في لوحات 96 بئرا ، دون تضمين خطوة تجفيف العينة. ومع ذلك، فإن قياس المعادن في الأنسجة باستخدام الوزن الرطب بدلا من الوزن الجاف يتأثر بشكل كبير بالكمية المتغيرة لفقدان الوزن من خلال التجفيف الهوائي في عينات الأنسجة الطازجة والمجمدة12. لذلك ، يوصى بتطبيع محتوى الحديد ضد الوزن الجاف للأنسجة. إذا لم يكن تجفيف الأنسجة خيارا قابلا للتطبيق (على سبيل المثال ، الأنسجة الدهنية) ، يقترح إجراء الفحص على الفور عند جمع العينات ، بحيث لا يتأثر التحديد الدقيق للوزن الطازج بشكل كبير بالتحف التخزينية.
كما تم تناول تكوين المحلول الحمضي. وفقا للبروتوكول الأصلي5,6 ، يتم هضم الأنسجة بخليط حمضي يتكون من حمض الهيدروكلوريك وحمض ثلاثي كلورو أسيتيك. ومع ذلك ، يوضح العمل الحالي أن 37٪ من حمض الهيدروكلوريك وحده فعال بنفس القدر ، على الأقل لهضم عينات الكبد والطحال.
يتم تحضير محلول الحديد القياسي باستخدام مسحوق حديد الكربونيل ، وهو مسحوق حديد غير مكلف ونقي للغاية. باتباع النهج الموصوف هنا ، تم إعداد محلول قياسي لحديد المخزون يحتوي على 1.1169 ملغ من Fe / mL (20 mM) ، على النحو الذي حددته AAS لاحقا. يمكن استخدام مصادر أخرى للحديد (مثل كبريتات الحديد ، نتريلوترياتسيتات الحديد) أو المحاليل القياسية التجارية لتوليد محلول قياسي للحديد ، شريطة تحديد تركيز الحديد الفعلي ، ويتم تأكيد خطية الفحص من خلال إجراء منحنى قياسي.
باستخدام الطريقة الحالية ، تم قياس محتوى الحديد غير الهيم لمجموعة متنوعة من الأنسجة الحيوانية بنجاح. يتم تضمين النتائج التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام أنسجة القوارض (الكبد والطحال والقلب والبنكرياس) وكبد قاروص البحر وذبابة الفاكهة الكاملة. ولا تتطلب هذه الطريقة أدوات تحليلية متطورة أو بنية تحتية باهظة الثمن، وبالتالي يمكن تنفيذها بسهولة في معظم المختبرات. باختصار ، يمكن تطبيق الطريقة الموضحة هنا على نطاق واسع في دراسات توازن الحديد والاضطرابات المرتبطة بالحديد باستخدام نماذج حيوانية تجريبية للحمل الزائد أو نقص الحديد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل الصناديق الوطنية من خلال FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.، في إطار المشروع UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
