Summary
Her tilvejebringes en protokol til måling af ikke-hæmjernindholdet i animalsk væv ved hjælp af et simpelt, veletableret kolorimetrisk assay, der let kan implementeres i de fleste laboratorier.
Abstract
Jern er et vigtigt mikronæringsstof. Både jernoverbelastning og mangel er yderst skadelige for mennesker, og vævsjernniveauerne er fint reguleret. Anvendelsen af eksperimentelle dyremodeller af jernoverbelastning eller -mangel har været medvirkende til at fremme kendskabet til de mekanismer, der er involveret i den systemiske og cellulære regulering af jernhomeostase. Målingen af de samlede jernniveauer i animalsk væv udføres almindeligvis med atomabsorptionsspektroskopi eller med et kolorimetrisk assay baseret på reaktionen af ikke-hæmjern med et bathophenanthrolinreagens. I mange år er det kolorimetriske assay blevet brugt til måling af indholdet af ikke-hæmjern i en lang række animalske væv. I modsætning til atomabsorptionsspektroskopi udelukker det bidraget fra hæmjern afledt af hæmoglobin indeholdt i røde blodlegemer. Desuden kræver det ikke sofistikerede analytiske færdigheder eller meget dyrt udstyr og kan derfor let implementeres i de fleste laboratorier. Endelig kan det kolorimetriske assay enten være kuvettebaseret eller tilpasset et mikropladeformat, hvilket muliggør højere prøvegennemstrømning. Det foreliggende arbejde giver en veletableret protokol, der er velegnet til påvisning af ændringer i vævsjernniveauer i en række eksperimentelle dyremodeller af jernoverbelastning eller jernmangel.
Introduction
Jern er et essentielt mikronæringsstof, der kræves til funktionen af proteiner involveret i afgørende biologiske processer såsom ilttransport, energiproduktion eller DNA-syntese. Det er vigtigt, at både jernoverskud og jernmangel er yderst skadelige for menneskers sundhed, og vævsjernniveauerne er fint reguleret. Unormal kost jernabsorption, jernmangel kostvaner, gentagne blodtransfusioner og kronisk inflammation er almindelige årsager til jernrelaterede lidelser, der påvirker milliarder af mennesker over hele verden1,2,3.
Eksperimentelle dyremodeller af jernoverbelastning eller -mangel har været medvirkende til at fremme vores viden om de mekanismer, der er involveret i den systemiske og cellulære regulering af jernhomeostase4. På trods af de betydelige fremskridt, der er gjort i løbet af de sidste to årtier, er mange centrale aspekter stadig undvigende. I de kommende år vil den nøjagtige måling af det samlede jernniveau i animalsk væv fortsat være et afgørende skridt for at fremme forskningen inden for jernbiologi.
De fleste laboratorier kvantificerer vævsjern med enten atomabsorptionsspektroskopi (AAS), induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS) eller et kolorimetrisk assay baseret på reaktionen af ikke-hæmjern med et bathophenanthrolinreagens. Sidstnævnte er baseret på den oprindelige metode beskrevet af Torrance og Bothwell for over 50 år siden5,6. Mens en variation af denne metode efterfølgende blev udviklet ved anvendelse af ferrozin som et alternativ til bathophenanthrolin7, er sidstnævnte fortsat det mest citerede kromogene reagens i litteraturen.
Den valgte metode afhænger ofte af den tilgængelige ekspertise og infrastruktur. Mens AAS og ICP-MS er mere følsomme, forbliver det kolorimetriske assay meget udbredt, fordi det giver følgende vigtige fordele: i) det udelukker bidraget fra hæmjern afledt af hæmoglobin indeholdt i røde blodlegemer; ii) det kræver ikke sofistikerede analytiske færdigheder eller meget dyrt udstyr og iii) det originale kuvettebaserede assay kan tilpasses til et mikropladeformat, hvilket muliggør højere prøvegennemstrømning. Den kolorimetriske tilgang, der præsenteres i dette arbejde, bruges rutinemæssigt til at kvantificere ændringer i vævs ikke-hæmjernniveauer i en række eksperimentelle dyremodeller af jernoverbelastning eller jernmangel, fra gnavere til fisk og frugtflue. Her tilvejebringes en protokol til måling af indholdet af ikke-hæmjern i animalsk væv ved hjælp af et simpelt, veletableret, kolorimetrisk assay, som de fleste laboratorier skal finde let at implementere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 mus blev købt kommercielt, og hepcidin-null (Hamp1−/−) mus på en C57BL/6 baggrund8 var en venlig gave fra Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrig). Dyrene blev opstaldet på i3S-dyreanlægget under specifikke patogenfrie forhold i et temperatur- og lyskontrolleret miljø med fri adgang til standard gnaverchow og vand. Europæisk havbars (Dicentrarchus labrax) blev købt fra et kommercielt dambrug og opkvarteret på ICBAS-dyreanlægget i et temperatur- og lyskontrolleret miljø og fodret dagligt ad libitum med standard havabborfoder. Alle forsøg med hvirveldyr blev godkendt af i3S Animal Ethics Committee og den nationale myndighed, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Oplysninger om kommercielle reagenser, udstyr og dyr er angivet i materialetabellen.
1. Forberedelse af opløsning
BEMÆRK: Håndter og forbered alle reagenser og opløsninger med jernfrit glas eller engangsplastik. Lad ikke metalliske laboratoriematerialer (f.eks. spatler i rustfrit stål) komme i kontakt med noget reagens eller opløsning på grund af risikoen for jernforurening. Sørg for, at alt genanvendeligt glas er jernfrit. Vask materialerne med passende laboratorievaskemiddel i 30-60 minutter, skyl med deioniseret vand, blød natten over i en 37% salpetersyreopløsning fortyndet 1:3 med deioniseret vand, skyl igen med deioniseret vand og lad det tørre.
- Syreblanding: Tilsæt 10 g trichloreddikesyre til 82,2 ml 37% saltsyre i en glasflaske, opløs grundigt, og juster det endelige volumen til 100 ml med deioniseret vand. Ryst før brug. Alternativt kan du kun bruge 37% saltsyre til vævsfordøjelse.
BEMÆRK: Opløsningen er stabil i mindst 2 måneder, når den opbevares i mørkebrune glasreagensflasker.
FORSIGTIG: Saltsyre og trichloreddikesyre er ætsende, og koncentrerede former frigiver giftige sure dampe. Brug beskyttelsesbeklædning, kemikaliebestandige handsker og kemiske stænkbriller til enhver tid, når du håndterer syrer. Undgå at indånde dem og håndter altid syrer, mens du er under en stinkhætte. - Mættet natriumacetat: Tilsæt 228 g vandfrit natriumacetat til 400 ml deioniseret vand i en glasflaske og omrør natten over ved stuetemperatur. Lad opløsningen hvile og bundfælde i en dag. Hvis der ikke sker nogen udfældning, skal du fortsætte med at tilføje små mængder natriumacetat. Opbevar opløsningen i en glasflaske.
- Chromogenreagens: For at fremstille 1 ml chromogenreagens tilsættes 1 mg 4,7-diphenyl-1,10-phenanthrolin-disulfonsyre dinatriumsalt til 500 μL deioniseret vand og 10 μL koncentreret (100%) thioglycolsyre og opløses grundigt. Der fyldes det endelige volumen til 1 ml med deioniseret vand.
BEMÆRK: Forbered så meget kromogens som nødvendigt. Opløsningen er stabil i 1 måned, når den er beskyttet mod lys. - Arbejdskromogenreagens (WCR): Tilsæt 1 volumen af kromogenreagenset til 5 volumener mættet natriumacetat og 5 volumener deioniseret vand.
BEMÆRK: Denne opløsning skal tilberedes frisk på brugsdagen. - Stock Iron Standard Solution: For at fremstille en 20 mM stamjernopløsning anbringes 111,5 mg carbonyljernpulver i en 250 ml målekolbe indeholdende 5,480 μL 37% saltsyre. Lad det opløse natten over ved stuetemperatur (eller inkubere i et kogende vandbad). Derefter fremstilles opløsningen til et endeligt volumen på 100 ml med deioniseret vand.
BEMÆRK: Standardopløsningen kan opbevares på ubestemt tid, når den opbevares i en tæt forseglet beholder. - Working Iron Standard Solution (WISS): Tilsæt 13,5 μL 37% saltsyre til 500 μL deioniseret vand. Der tilsættes 10 μL af Stock Iron Standard Solution, og det endelige volumen fyldes op til 1 ml med deioniseret vand (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; målt ved AAS).
BEMÆRK: Arbejdsløsningen skal tilberedes frisk på brugsdagen.
2. Prøvetørring
- Skær en prøve af væv, der vejer 10-100 mg med et skalpelblad. Vej det nøjagtigt i en analytisk/præcisionsvægt over et lille stykke parafilm (Fresh Weight).
- Brug en plastikpincet til at placere vævsstykket i en plade med 24 brønde (ikke-glidende for at muliggøre vandfordampning) og lade det tørre på en standardinkubator ved 65 °C i 48 timer.
- Alternativt kan du bruge en laboratoriemikrobølge fordøjelsesovn til tørring af vævsprøver. Brug plastikpincet til at placere det vejede stykke væv i en jernfri teflonkop og tørre det i mikrobølgeovnen. Indstil betjeningsparametrene i henhold til instrumentets instruktionsmanual.
BEMÆRK: Som reference er driftsparametre for tørring af leverprøver ved hjælp af den specifikke fordøjelsesovn (se materialetabel) vist i tabel 1. - Brug en plastikpincet til at placere hvert tørret stykke væv over et lille stykke parafilm inde i en analytisk/præcisionsvægt og veje det nøjagtigt (tørvægt).
3. Prøve sur fordøjelse
- Brug plastpincet til at overføre hvert tørret stykke væv til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Der tilsættes 1 ml af syreblandingen, og mikrocentrifugerøret lukkes. Forbered et syreemne på samme måde, bortset fra at vævet udelades.
FORSIGTIG: Syreblandingen er ætsende og frigiver giftige dampe. Brug beskyttelsesbeklædning, kemikaliebestandige handsker og kemiske stænkbriller, når du håndterer syreblandingen. Undgå at indånde det og håndter det altid, mens du er under en stinkhætte. - Vævene fordøjes ved at inkubere mikrocentrifugerørene i en inkubator ved 65 °C i 20 timer.
- Efter afkøling til stuetemperatur overføres 500 μL af det klare (gule) syreekstrakt (supernatant) til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af en mikropipette udstyret med plastspidser. Hvis det ikke er muligt at opnå en klar supernatant, skal du udføre et kort centrifugeringsspin.
FORSIGTIG: Supernatanten er meget sur. Brug beskyttelsesbeklædning, kemikaliebestandige handsker og kemiske stænkbriller, når du håndterer supernatanterne. Håndter dem altid, mens du er under en stinkhætte.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan syreekstrakterne straks anvendes til kolorimetrisk assay eller fryses ved -20 °C til senere brug. Optøes frosne prøver fuldstændigt til stuetemperatur og hvirvler dem inden brug.
4. Farveudvikling
- Chromogenreaktioner som angivet i tabel 2 forberedes i mikrocentrifugerør på 1,5 ml eller, for højere gennemstrømning, direkte ned i den flade bund, 96-brønds, klare, ubehandlede polystyrenmikroplader. Forbered alle reaktioner (syreemne, standard og prøve) mindst i to eksemplarer.
- Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
5. Absorbanslæsning
- Mål prøveabsorbering i et spektrofotometer eller pladelæser ved en bølgelængde på 535 nm mod en deioniseret vandreference. Plader kan læses ulidded eller låg. I lågkassen skal du fjerne kondens, der dannes på grund af frigivelse af sure dampe fra låget lige før målingen for at undgå mulig interferens med absorbansaflæsningen.
BEMÆRK: Den optiske absorbans af syreemnet, der læses mod deioniseret vand (reference), skal være mindre end 0,015; standardens og prøvernes optiske absorbans skal være mellem 0,100 og 1,000. For prøver med meget højt eller meget lavt jernindhold kan det være nødvendigt at justere mængderne af syreekstrakt (supernatant) og diH2O (tabel 2): Hvis absorbansen er større end 1,0, anvendes et mindre prøvevolumen (supernatant). når absorbansen er lavere end 0,1, skal du bruge et højere volumen af supernatanten. Prøvevolumen (Vsmp) tages i betragtning ved beregning af hver prøves vævsjernindhold (se trin 6).
6. Beregning af vævsjernindhold
- Beregn ikke-hæmvævsjernindhold med følgende ligning:
Vævsjern (μg/g tørt væv) =
AT = absorption af prøven
AB = absorbans af syreemne
AS = absorbans af standard
Fes = jernkoncentration af WISS (μg Fe/ml)
W = vægt af tørt væv (g)
Vsmp = prøvevolumen (variabelt volumen af Supernatant i tabel 2 omregnet til ml)
Vf = det endelige volumen syreblanding efter inkubation natten over ved 65 °C (svarende til syrevolumen plus tørvævsvolumen i ml; hvis prøvens vægt ikke afviger væsentligt, antages et konstant volumen ≈ 1 ml)
Vstd = jernstandardvolumen (volumen af WISS i tabel 2 konverteret til ml)
Vrv = endelig reaktionsvolumen (Samlet volumen i tabel 2 omregnet til ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuvette versus 96-brønd mikroplade sammenligning
Måling af vævsjern, der ikke er hæm, ved reaktion med et bathophenanthrolinreagens, der oprindeligt blev beskrevet af Torrance og Bothwell5,6, er afhængig af anvendelsen af et spektrofotometer til absorbansaflæsning. Derfor er de volumener, der anvendes i kromogenreaktionen, kompatible med størrelsen af en almindelig spektrofotometerkuvette. Det foreliggende arbejde beskriver en metodetilpasning, hvor kromogenreaktionerne fremstilles direkte i en 96-brønds mikroplade til absorbansmåling i en mikropladelæser, hvilket kræver mindre reagensvolumener og tillader højere gennemstrømning.
For at sammenligne følsomheden af begge tilgange blev der oprindeligt fremstillet en seriel fortynding af arbejdsjernsstandardopløsningen (WISS), og kromogenreaktionerne blev samlet enten i 1,5 ml rør eller i plader med 96 brønde som angivet i tabel 2. Absorbans blev målt i henholdsvis et spektrofotometer (med kuvette) eller i en mikropladelæser. Repræsentative standardkurver, der genereres med de to tilgange, er afbildet i figur 1A. I begge tilfælde var lineariteten meget høj (r2 = 0,9996 og r2 = 0,9997 for henholdsvis mikroplade og kuvette) på tværs af de testede jernkoncentrationer.
Det er bemærkelsesværdigt, at der blev anvendt en WISS indeholdende 11.169 μg Fe/ml. De foreliggende data viser, at lavere jernkoncentrationer kan anvendes til at udarbejde standarden. Imidlertid anbefales det ikke at anvende en WISS med højere jernkoncentrationer, da dette kan føre til absorbansværdier, der overstiger spektrofotometerets lineære dynamiske detektionsområde, hvilket får standardkurver til at plateau.
For yderligere at sammenligne de kuvette- og mikropladebaserede assays blev ikke-hæmjernindhold målt i i alt 55 musevævsprøver (lever, milt, hjerte, lunge, knoglemarv). Der blev observeret en meget høj grad af korrelation mellem de to metoder (r = 0,999, p < 0,0001), hvilket indikerer, at den mikropladebaserede metode er et gyldigt alternativ til den oprindelige kuvettebaserede metode (figur 1B).
Endelig blev ikke-hæmjernniveauer i musevæv kvantificeret med den mikropladebaserede metode efter sur fordøjelse af prøver afledt af det samme væv med enten en blanding af saltsyre og trichloreddikesyre (i henhold til den oprindelige metodebeskrivelse) eller saltsyre alene. Der blev observeret en meget høj korrelation (r = 0,999, p < 0,0001, figur 1C), hvilket viser, at trichloreddikesyre kan udelades fra syrefordøjelsen.
De repræsentative resultater, der er inkluderet nedenfor, blev opnået ved at måle prøveabsorbering i plader med 96 brønde.
Måling af vævs ikke-hæm jernniveauer i en musemodel af genetisk hæmokromatose
Ved hjælp af det bathophenanthrolinbaserede kolorimetriske assay blev ikke-hæmjernindhold bestemt i forskellige væv (lever, milt, hjerte og bugspytkirtel) fra den almindeligt anvendte musestamme C57BL/6 og fra hepcidin knockout (Hamp1-/-) mus (i en C57BL/6 genetisk baggrund). Repræsentative jernniveauer er afbildet i figur 2. Hepcidin er en vigtig regulator af jernmetabolisme, og dets forstyrrelse fører til en hæmokromatoselignende jernaflejringsfænotype med svær lever-, bugspytkirtel- og hjertejernakkumulering og miltjernudtømning8.
Måling af ikke-hæm jernniveauer i havabbor lever efter eksperimentel jernmodulering
Ved hjælp af det bathophenanthrolinbaserede kolorimetriske assay blev ikke-hæmjernniveauer bestemt i leveren af raske (kontrol), jernbehandlede (2 mg jerndextran administreret via intraperitonealvejen) og anæmisk (2% v / w blod trukket fra de kaudale kar) europæisk havabbor (Dicentrarchus labrax). Som forventet steg leverjernsniveauerne massivt hos jernbehandlede dyr, mens anæmi forårsagede en mild reduktion i leverjernlagrene (figur 3).
Måling af ikke-hæm jernniveauer i hele Drosophila melanogaster
Selv om den nuværende metode ikke er egnet til at måle ikke-hæmjernniveauer hos individuelle Drosophila fluer på grund af deres lille kropsmasse (gennemsnitsvægten er henholdsvis 0,6 mg og 0,8 mg for mænd og kvinder)9, kan den med succes anvendes med poolede fluer. Figur 4 viser repræsentative ikke-hæmjernniveauer for grupper på 20 hele hanfluer, enten vildtype Oregon-R eller Malvolio (Mvl) knockout. Mvl er homologen af pattedyrets SLC11A2-gen, som koder for et protein kaldet divalent metaltransportør 1 (DMT1), og dets genetiske forstyrrelse fører til jernmangel10. Som forventet præsenterede Mlv fluer et væsentligt lavere indhold af ikke-hæmjern sammenlignet med vildtype.
| Effekt 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Tryk (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tidspunkt (min):: | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tid ved tryk (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| VENTILATOR: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabel 1: Driftsparametre til levertørring i en mikrobølgeovn, der anvendes her.
| WCR (μL) | Syreblanding (μL) | Supernatant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Samlet volumen (μL) | ||
| 1,5 ml rør | Syre blank | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Norm | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Prøve | 1000 | Variabel | Variabel | 1300 | |||
| Mikroplade med 96 brønde | Syre blank | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Norm | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Prøve | 150 | Variabel | Variabel | 195 |
Tabel 2: Fremstilling af kromogenreaktioner i enten 1,5 ml rør eller 96-brøndsplader.
Figur 1: Bestemmelse af ikke-hæmjern ved hjælp af de kuvette- eller 96-brønds mikropladebaserede kolorimetriske assays. (A) standardkurver for mikroplade- (åbne firkanter
) og kuvettebaserede (åbne trekanter Δ) assays. (B) Korrelation mellem kuvettebaserede og mikropladebaserede ikke-hæmjernniveauer i 55 vævsprøver fra 6 måneder gamle mandlige C57BL/6-mus, herunder lever (faste cirkler
), milt (åbne cirkler
), hjerte (faste trekanter
), lunge (stjerner
) og knoglemarv (diamanter
). C) ikke-hæmjernniveauer i en delmængde af væv fra 6 måneder gamle hanmus (lever, faste cirkler, milt, åbne cirkler) målt med det 96-brønds mikropladebaserede assay efter sur fordøjelse af prøver med en blanding af saltsyre og trichloreddikesyre (HCL + C2HCl3O2) eller saltsyre alene (HCL). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Ikke-hæmjernindhold bestemt i forskellige væv ved bathophenanthrolinbaseret kolorimetrisk assay. Ikke-hæmjernniveauer i leveren, milten, hjertet og bugspytkirtlen hos mandlige C57BL/6 vildtypemus (åbne cirkler ) og han-hepcidin-mangelfulde Hamp1-/- mus på C57BL/6 genetisk baggrund (åbne firkanter ) i en alder af 8 uger, målt med bathophenanthrolin-baserede kolorimetriske assay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hepatiske ikke-hæmjernniveauer hos unge kvindelige europæiske havabbor efter eksperimentel jernmodulering. Jernoverbelastning blev opnået ved intraperitoneal administration af 2 mg jerndextran, mens anæmi blev induceret ved tilbagetrækning af 2% v/ w blod fra de kaudale kar. Lever blev indsamlet 4 dage efter jernbehandling eller blodopsamling. Kontroldyr var sunde, ubehandlede havabbor. Ikke-hæmjernniveauer blev målt med det bathophenanthrolinbaserede kolorimetriske assay. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Ikke-hæmjernniveauer i 1 måned gammel Drosophila, målt med det bathophenanthrolinbaserede kolorimetriske assay. Resultaterne viser (A) indholdet af ikke-hæmjern i hver pulje på 20 fluer eller (B) det estimerede jernindhold i hver enkelt flue under hensyntagen til en gennemsnitsvægt på 0,64 mg/flue. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der tilvejebringes en protokol til måling af indholdet af ikke-hæmjern i animalsk væv ved hjælp af en tilpasning af det bathophenanthrolinbaserede kolorimetriske assay, der oprindeligt blev beskrevet af Torrance og Bothwell5,6. De kritiske trin i metoden er vævsprøvetørring; proteindenaturering og frigivelse af uorganisk jern ved syrehydrolyse; reduktion af jern (Fe3+) jern til jernholdig tilstand (Fe2+) i nærvær af reduktionsmidlet thioglykolsyre og dets reaktion med et bathophenanthrolinreagens (chromogenreaktion); absorbansaflæsning af det resulterende jernholdige ion/bathophenanthrolin pink kompleks; og beregning af vævsjernindhold.
Det foreliggende arbejde viser, hvordan den originale kuvettebaserede protokol kan tilpasses til et 96-brøndbaseret format for højere gennemstrømning uden at gå på kompromis med assayfølsomheden. Især giver denne tilpasning mulighed for betydelig tidsbesparelse, da: 1) et større antal kromogenreaktioner kan fremstilles samtidigt i plader med 96 brønde ved hjælp af flerkanalspipetter; og 2) absorbansaflæsninger er dramatisk hurtigere i en pladelæser end ved brug af et spektrofotometer. En anden vigtig fordel ved det mikropladebaserede assay er justeringen af chromogenreaktionsvolumenerne, hvilket væsentligt reducerer omkostningerne med reagenser (især med bathophenanthrolinreagenset). Hele protokollen kan udfyldes på 4 dage. Prøvetørring (som kan tage op til 48 timer, når den udføres i en ovn ved 65 °C) og sur fordøjelse (som udføres bekvemt natten over i 20 timer) er de to mest tidskrævende trin. Prøvetørring kan fremskyndes ved hjælp af en mikrobølgeovnsfordøjelsesovn designet til laboratoriebrug til fordøjelse, opløsning, hydrolysering eller tørring af en lang række materialer. Da det er muligt at tørre de fleste vævsprøver på mindre end 2,5 timer, kan man udføre hele protokollen på bare 2 dage. Men fordi kapaciteten af en mikrobølgeovn er begrænset til antallet af teflonkopper, som den kan passe, og fordi kopperne skal vaskes og dekontamineres efter hver brug, kan brugerne finde det mere bekvemt at tørre prøver i 24-brønds plader ved 65 ° C, når de håndterer et stort antal prøver. Den tid, det tager at tørre vævene, kan stadig reduceres ved anvendelse af temperaturer over 65 °C. Plastmateriale skal dog undgås på grund af risikoen for smeltning.
Tidligere havde Grundy et al.11 udviklet en tilpasning af metoden, hvor hele analysen udføres i 96-brønds plader uden at inkludere et prøvetørringstrin. Måling af metaller i væv ved hjælp af vådvægt i stedet for tørvægt påvirkes imidlertid signifikant af den variable mængde vægttab gennem lufttørring både i friske og frosne vævsprøver12. Derfor anbefales det at normalisere jernindholdet mod vævstørvægt. Hvis vævstørring ikke er en levedygtig mulighed (f.eks. fedtvæv), foreslås det, at analysen udføres straks ved prøveudtagningen, således at nøjagtig bestemmelse af den friske vægt ikke påvirkes væsentligt af opbevaringsartefakter.
Sammensætningen af syreopløsningen blev også behandlet. I henhold til den oprindelige protokol5,6 fordøjes væv med en syreblanding bestående af saltsyre og trichloreddikesyre. Det foreliggende arbejde viser imidlertid, at 37% saltsyre alene er lige så effektiv, i det mindste til fordøjelse af lever- og miltprøver.
Stamjernstandardopløsningen fremstilles ved anvendelse af carbonyljernpulver, som er et billigt og meget rent jernpulver. Efter den fremgangsmåde, der er beskrevet heri, blev der fremstillet en stamjernsstandardopløsning indeholdende 1,1169 mg Fe/ml (20 mM), som efterfølgende bestemt af AAS. Andre kilder til jern (f.eks. jernsulfat, jernnitriacetat) eller kommercielle standardopløsninger kan anvendes til at generere stamjernsstandardopløsningen, forudsat at den faktiske jernkoncentration bestemmes, og assaylineariteten bekræftes ved at udføre en standardkurve.
Ved hjælp af den nuværende metode blev ikke-hæmjernindholdet i en række animalske væv målt med succes. Repræsentative resultater opnået med gnavervæv (lever, milt, hjerte og bugspytkirtel), havabborlever og hele drosophila er inkluderet. Metoden kræver ikke avancerede analyseværktøjer eller dyr infrastruktur og kan derfor let implementeres i de fleste laboratorier. Sammenfattende kan den metode, der er beskrevet heri, anvendes bredt i undersøgelser af jernhomeostase og jernrelaterede lidelser, der anvender eksperimentelle dyremodeller af jernoverbelastning eller mangel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af nationale fonde gennem FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projektet UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
