Summary
Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi qui peut être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires.
Abstract
Le fer est un micronutriment essentiel. La surcharge et la carence en fer sont très préjudiciables aux humains, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’utilisation de modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer a été déterminante pour faire progresser les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer. La mesure des niveaux de fer total dans les tissus animaux est généralement effectuée par spectroscopie d’absorption atomique ou avec un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophénanthroline. Depuis de nombreuses années, le test colorimétrique est utilisé pour mesurer la teneur en fer non hémique dans un large éventail de tissus animaux. Contrairement à la spectroscopie d’absorption atomique, elle exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges. De plus, il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipements très coûteux, et peut donc être facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires. Enfin, le test colorimétrique peut être basé sur une cuvette ou adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. Le présent travail fournit un protocole bien établi qui convient à la détection d’altérations des niveaux de fer tissulaire dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer.
Introduction
Le fer est un micronutriment essentiel, nécessaire à la fonction des protéines impliquées dans des processus biologiques cruciaux tels que le transport de l’oxygène, la production d’énergie ou la synthèse de l’ADN. Il est important de noter que l’excès de fer et la carence en fer sont très préjudiciables à la santé humaine, et les niveaux de fer dans les tissus sont finement régulés. L’absorption anormale du fer alimentaire, les régimes alimentaires déficients en fer, les transfusions sanguines répétées et l’inflammation chronique sont des causes courantes de troubles associés au fer qui affectent des milliards de personnes dans le monde1,2,3.
Des modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer ont joué un rôle déterminant dans la progression de nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans la régulation systémique et cellulaire de l’homéostasie du fer4. Malgré les progrès substantiels réalisés au cours des deux dernières décennies, de nombreux aspects clés restent insaisissables. Dans les années à venir, la mesure précise des niveaux totaux de fer dans les tissus animaux restera une étape cruciale pour faire progresser la recherche dans le domaine de la biologie du fer.
La plupart des laboratoires quantifient le fer tissulaire avec la spectroscopie d’absorption atomique (SAA), la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif (ICP-MS) ou un test colorimétrique basé sur la réaction du fer non hémique avec un réactif bathophtrophrolique. Ce dernier est basé sur la méthode originale décrite par Torrance et Bothwell il y a plus de 50 ans5,6. Bien qu’une variante de cette méthode ait ensuite été développée en utilisant la ferrozine comme alternative à la bathophénanthroline7, cette dernière reste le réactif chromogène le plus largement cité dans la littérature.
La méthode de choix dépend souvent de l’expertise et de l’infrastructure disponibles. Bien que l’AAS et l’ICP-MS soient plus sensibles, le test colorimétrique reste largement utilisé car il présente les avantages importants suivants: i) il exclut la contribution du fer hémique dérivé de l’hémoglobine contenue dans les globules rouges; ii) il ne nécessite pas de compétences analytiques sophistiquées ou d’équipement très coûteux; et iii) le test original à base de cuvette peut être adapté à un format de microplaque, ce qui permet un débit d’échantillon plus élevé. L’approche colorimétrique présentée dans ce travail est couramment utilisée pour quantifier les altérations des niveaux de fer non hémique dans les tissus dans une variété de modèles animaux expérimentaux de surcharge en fer ou de carence en fer, des rongeurs aux poissons et à la mouche des fruits. Ici, un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant un test colorimétrique simple et bien établi que la plupart des laboratoires devraient trouver facile à mettre en œuvre.
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Protocol
Des souris C57BL/6 ont été achetées dans le commerce et des souris hepcidine-nulle (Hamp1−/−) sur fond C57BL/68 ont été un cadeau aimable de Sophie Vaulont (Institut Cochin, France). Les animaux ont été hébergés dans l’installation pour animaux i3S dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, dans un environnement à température et à lumière contrôlées, avec un accès libre au chow et à l’eau standard des rongeurs. Le bar européen (Dicentrarchus labrax) a été acheté dans une ferme piscicole commerciale et logé à l’installation pour animaux ICBAS, dans un environnement à température et à lumière contrôlées, et nourri quotidiennement ad libitum avec des aliments standard pour le bar. Toutes les procédures impliquant des animaux vertébrés ont été approuvées par le comité d’éthique animale i3S et l’autorité nationale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Les renseignements sur les réactifs commerciaux, l’équipement et les animaux sont énumérés dans le Tableau des matériaux.
1. Préparation de la solution
REMARQUE: Manipulez et préparez tous les réactifs et solutions avec de la verrerie sans fer ou de la plastique jetable. Ne laissez pas les matériaux de laboratoire métalliques (p. ex. spatules en acier inoxydable) entrer en contact avec un réactif ou une solution, en raison du risque de contamination par le fer. Assurez-vous que toute verrerie réutilisable est sans fer. Laver les matériaux avec un détergent de laboratoire approprié pendant 30 à 60 min, rincer à l’eau désionisée, faire tremper toute la nuit dans une solution d’acide nitrique à 37% diluée 1:3 avec de l’eau désionisée, rincer à nouveau à l’eau désionisée et laisser sécher.
- Mélange acide : Ajouter 10 g d’acide trichloroacétique à 82,2 mL d’acide chlorhydrique à 37 % dans une bouteille en verre, bien dissoudre et ajuster le volume final à 100 mL avec de l’eau désionisée. Agiter avant utilisation. Alternativement, utilisez seulement 37% d’acide chlorhydrique pour la digestion des tissus.
REMARQUE: La solution est stable pendant au moins 2 mois lorsqu’elle est stockée dans des bouteilles de réactif en verre brun foncé.
ATTENTION : L’acide chlorhydrique et l’acide trichloroacétique sont corrosifs et les formes concentrées libèrent des vapeurs acides toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques en tout temps lorsque vous manipulez des acides. Évitez de les respirer et manipulez toujours les acides sous une hotte aspirante. - Acétate de sodium saturé : Ajouter 228 g d’acétate de sodium anhydre à 400 mL d’eau désionisée dans une bouteille en verre et agiter pendant la nuit à température ambiante. Laissez la solution reposer et précipiter pendant une journée. Si aucune précipitation ne se produit, continuez d’ajouter de petites quantités d’acétate de sodium. Conservez la solution dans une bouteille en verre.
- Réactif chromogène: Pour préparer 1 mL de réactif chromogène, ajoutez 1 mg de sel disodique d’acide disulfonique de 4,7-diphényl-1,10-phénanthroline à 500 μL d’eau désionisée et 10 μL d’acide thioglycolique concentré (100%) et dissolvez-le complètement. Porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée.
REMARQUE: Préparez autant de réactif chromogène que nécessaire. La solution est stable pendant 1 mois lorsqu’elle est protégée de la lumière. - Réactif chromogène de travail (WCR): Ajouter 1 volume du réactif chromogène à 5 volumes d’acétate de sodium saturé et à 5 volumes d’eau désionisée.
REMARQUE: Cette solution doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation. - Solution étalon de fer mère : Pour préparer une solution de fer mère de 20 mM, placer 111,5 mg de poudre de fer carbonyle dans une fiole jaugée de 250 mL contenant 5 480 μL d’acide chlorhydrique à 37 %. Laisser dissoudre toute la nuit à température ambiante (ou incuber dans un bain-marie bouillant). Ensuite, composez la solution à un volume final de 100 mL avec de l’eau désionisée.
REMARQUE: La solution standard peut être conservée indéfiniment lorsqu’elle est stockée dans un récipient hermétiquement fermé. - Solution étalon de fer de travail (WISS) : Ajouter 13,5 μL d’acide chlorhydrique à 37 % à 500 μL d’eau désionisée. Ajouter 10 μL de la solution étalon de fer mère et porter le volume final à 1 mL avec de l’eau désionisée (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; mesuré par AAS).
REMARQUE: La solution de travail doit être préparée fraîchement le jour de l’utilisation.
2. Séchage de l’échantillon
- Couper un échantillon de tissu pesant 10-100 mg avec une lame de scalpel. Pesez-le avec précision dans une balance analytique / précision sur un petit morceau de parafilm (Fresh Weight).
- À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu dans une plaque de 24 puits (non glissée pour permettre l’évaporation de l’eau) et laissez-le sécher sur un incubateur standard à 65 °C pendant 48 h.
- Vous pouvez également utiliser un four de digestion par micro-ondes de laboratoire pour sécher des échantillons de tissus. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez le morceau de tissu pesé dans une tasse en téflon sans fer et séchez-le au micro-ondes. Réglez les paramètres de fonctionnement conformément au manuel d’instructions de l’instrument.
REMARQUE: À titre de référence, les paramètres de fonctionnement pour le séchage des échantillons de foie à l’aide du four de digestion spécifique (voir tableau des matériaux) sont indiqués dans le tableau 1. - À l’aide d’une pince à épiler en plastique, placez chaque morceau de tissu séché sur un petit morceau de parafilm à l’intérieur d’une balance analytique / de précision et pesez-le avec précision (poids sec).
3. Échantillon de digestion acide
- À l’aide d’une pince à épiler en plastique, transférer chaque morceau de tissu séché dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Ajouter 1 mL du mélange acide et fermer le tube de microcentrifugation. Préparez un blanc acide de la même manière, sauf que le tissu est omis.
ATTENTION : Le mélange acide est corrosif et libère des vapeurs toxiques. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques lorsque vous manipulez le mélange acide. Évitez de l’inhaler et manipulez-le toujours sous une hotte aspirante. - Digérer les tissus en incubant les tubes de microcentrifugation dans un incubateur à 65 °C pendant 20 h.
- Après refroidissement à température ambiante, transférer 500 μL de l’extrait acide clair (jaune) (surnageant) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’une micropipette équipée de pointes en plastique. S’il n’est pas possible d’obtenir un surnageant clair, effectuez un court spin de centrifugation.
ATTENTION : Le surnageant est très acide. Portez des vêtements de protection, des gants résistants aux produits chimiques et des lunettes anti-éclaboussures chimiques lorsque vous manipulez les surnageants. Manipulez-les toujours sous une hotte.
REMARQUE: À ce stade, les extraits acides peuvent être immédiatement utilisés pour le test colorimétrique ou congelés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure. Décongeler complètement les échantillons congelés à température ambiante et les vortexer avant utilisation.
4. Développement des couleurs
- Préparer les réactions chromogènes comme indiqué dans le tableau 2 dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL ou, pour un débit plus élevé, directement dans le fond plat, des microplaques de polystyrène transparentes et non traitées à fond plat. Préparer toutes les réactions (blanc acide, étalon et échantillon) au moins en double exemplaire.
- Incuber à température ambiante pendant 15 min.
5. Lecture de l’absorbance
- Mesurer l’absorbance de l’échantillon dans un spectrophotomètre ou un lecteur de plaques à une longueur d’onde de 535 nm par rapport à une référence d’eau désionisée. Les plaques peuvent être lues non glissées ou avec couvercle. Dans le boîtier à couvercle, éliminez toute condensation formée par la libération de vapeurs acides du couvercle juste avant la mesure afin d’éviter toute interférence possible avec la lecture de l’absorbance.
REMARQUE: L’absorbance optique de l’acide à blanc lu par rapport à l’eau désionisée (référence) doit être inférieure à 0,015; l’absorbance optique de l’étalon et des échantillons doit être comprise entre 0,100 et 1,000. Pour les échantillons à très ou très faible teneur en fer, les volumes d’extrait acide (surnageant) et de diH2O peuvent devoir être ajustés (tableau 2): si l’absorbance est supérieure à 1,0, utilisez un volume d’échantillon plus petit (surnageant); lorsque l’absorbance est inférieure à 0,1, utilisez un volume plus élevé du surnageant. Le volume de l’échantillon (Vsmp) est pris en compte lors du calcul de la teneur en fer tissulaire de chaque échantillon (voir étape 6).
6. Calcul de la teneur en fer tissulaire
- Calculez la teneur en fer des tissus non hémiques à l’aide de l’équation suivante :
Fer tissulaire (μg/g de tissu sec) =
AT = absorbance de l’échantillon d’essai
AB = absorbance de l’ébauche acide
AS = absorbance de l’étalon
Fes = concentration en fer du WISS (μg Fe/mL)
W = poids des tissus secs (g)
Vsmp = volume de l’échantillon (volume variable de surnageant dans le tableau 2 converti en mL)
Vf = volume final du mélange acide après incubation nocturne à 65 °C (correspondant au volume acide plus volume de tissu sec en mL; si les poids de l’échantillon ne diffèrent pas de manière significative, supposons un volume constant ≈ 1 mL)
Vstd = volume standard de fer (volume de WISS dans le tableau 2 converti en mL)
Vrv = volume de réaction final (volume total du tableau 2 converti en mL)
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Representative Results
Comparaison entre la cuvette et la microplaque à 96 puits
La mesure du fer non hémique tissulaire par réaction avec un réactif bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et Bothwell5,6 repose sur l’utilisation d’un spectrophotomètre pour la lecture de l’absorbance. Par conséquent, les volumes utilisés dans la réaction chromogène sont compatibles avec la taille d’une cuvette spectrophotomètre régulière. Le présent travail décrit une adaptation de la méthode dans laquelle les réactions chromogènes sont préparées directement dans une microplaque de 96 puits pour la mesure de l’absorbance dans un lecteur de microplaques, nécessitant des volumes de réactifs plus petits et permettant un débit plus élevé.
Pour comparer la sensibilité des deux approches, une dilution en série de la solution étalon de fer de travail (WISS) a été initialement préparée, et les réactions chromogènes ont été assemblées soit dans des tubes de 1,5 mL, soit dans des plaques de 96 puits, comme indiqué dans le tableau 2. L’absorbance a été mesurée dans un spectrophotomètre (avec cuvette) ou dans un lecteur de microplaques, respectivement. Les courbes standard représentatives générées avec les deux approches sont représentées à la figure 1A. Dans les deux cas, la linéarité était très élevée (r2 = 0,9996 et r2 = 0,9997 pour les microplaques et les cuvettes, respectivement) parmi les concentrations de fer testées.
Il convient de noter qu’un WISS contenant 11,169 μg de Fe/mL a été utilisé. Les données actuelles montrent que des concentrations de fer plus faibles peuvent être utilisées pour préparer la norme. Cependant, l’utilisation d’un WISS avec des concentrations de fer plus élevées n’est pas recommandée, car cela pourrait conduire à des valeurs d’absorbance qui dépassent la plage dynamique linéaire de détection du spectrophotomètre, provoquant un plateau des courbes standard.
Pour comparer davantage les essais à base de cuvette et de microplaques, la teneur en fer non hémique a été mesurée dans un total de 55 échantillons de tissus de souris (foie, rate, cœur, poumon, moelle osseuse). Un très haut degré de corrélation a été observé entre les deux méthodologies (r = 0,999, p < 0,0001), ce qui indique que la méthode à base de microplaques est une alternative valable à la méthode originale à base de cuvette (Figure 1B).
Enfin, les niveaux de fer non hémique dans les tissus de souris ont été quantifiés avec la méthode à base de microplaques après digestion acide d’échantillons dérivés des mêmes tissus avec un mélange d’acide chlorhydrique et d’acide trichloroacétique (selon la description originale de la méthode) ou d’acide chlorhydrique seul. Une corrélation très élevée a été observée (r = 0,999, p < 0,0001, figure 1C), montrant que l’acide trichloroacétique peut être omis de la digestion acide.
Les résultats représentatifs inclus ci-dessous ont été obtenus en mesurant l’absorbance de l’échantillon dans des plaques de 96 puits.
Mesure des niveaux de fer non hémique dans les tissus dans un modèle murin d’hémochromatose génétique
À l’aide du test colorimétrique à base de bathophénonthroline, la teneur en fer non hémique a été déterminée dans divers tissus (foie, rate, cœur et pancréas) de la souche de souris C57BL/6 couramment utilisée et de souris knock-out à l’hepcidine (Hamp1-/-) (dans un fond génétique C57BL/6). Les niveaux représentatifs de fer sont représentés à la figure 2. L’hepcidine est un régulateur clé du métabolisme du fer et sa perturbation conduit à un phénotype de dépôt de fer semblable à une hémochromatose, avec une accumulation sévère de fer hépatique, pancréatique et cardiaque, et une déplétion du fer splénique8.
Mesure des niveaux de fer non hémique dans le foie du bar après modulation expérimentale du fer
À l’aide du dosage colorimétrique à base de bathophénothroline, des taux de fer non hémique ont été déterminés dans le foie du bar européen sain (témoin), traité au fer (2 mg de dextran de fer administré par voie intrapéritonéale) et anémique (2 % v/p de sang prélevé dans les vaisseaux caudaux) du bar européen (Dicentrarchus labrax). Comme prévu, les niveaux de fer hépatique ont augmenté massivement chez les animaux traités au fer, tandis que l’anémie a entraîné une légère réduction des réserves de fer hépatique (Figure 3).
Mesure des niveaux de fer non hémique chez Drosophila melanogaster entier
Bien que la méthode actuelle ne soit pas appropriée pour mesurer les niveaux de fer non hémique chez les mouches drosophiles individuelles en raison de leur petite masse corporelle (le poids moyen étant de 0,6 mg et 0,8 mg pour les mâles et les femelles, respectivement)9, elle peut être utilisée avec succès avec des mouches groupées. La figure 4 illustre les niveaux représentatifs de fer non hémique pour des groupes de 20 mouches mâles entières, soit de type sauvage Oregon-R ou Malvolio (Mvl). Mvl est l’homologue du gène mammifère SLC11A2, qui code pour une protéine appelée transporteur de métal divalent 1 (DMT1), et sa perturbation génétique conduit à une carence en fer10. Comme prévu, les mouches Mlv présentaient une teneur en fer non hémique du corps nettement inférieure à celle du type sauvage.
| Puissance 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Pression (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Durée (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Temps sous pression (TAP) : | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ÉVENTAIL: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tableau 1 : Paramètres de fonctionnement du séchage du foie dans un four de digestion par micro-ondes utilisé ici.
| WCR (μL) | Mélange acide (μL) | Surnageant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volume total (μL) | ||
| Tubes de 1,5 mL | Ébauche acide | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Standard | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Échantillon | 1000 | Variable | Variable | 1300 | |||
| Microplaque de 96 puits | Ébauche acide | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Standard | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Échantillon | 150 | Variable | Variable | 195 |
Tableau 2 : Préparation des réactions chromogènes dans des tubes de 1,5 mL ou des plaques de 96 puits.
Figure 1 : Détermination du fer non hémique par les essais colorimétriques à base de cuvette ou de microplaques à 96 puits. (A) courbes standard pour les essais à base de microplaques (carrés ouverts
) et de cuvettes (triangles ouverts Δ). (B) Corrélation entre les niveaux de fer cuvette et de fer non hémique à base de microplaques dans 55 échantillons de tissus de souris mâles C57BL/6 âgées 
de 6 mois, y compris le foie (cercles 
solides), la rate (cercles ouverts
), le cœur (triangles 
solides), le poumon (astérisques) et la moelle osseuse (diamants
). (C) les niveaux de fer non hémique dans un sous-ensemble de tissus de souris mâles âgées de 6 mois (foie, cercles solides ; rate, cercles ouverts) mesurés avec le test à base de microplaques à 96 puits après digestion acide d’échantillons avec un mélange d’acide chlorhydrique et d’acide trichloroacétique (HCl + C2HCl3O2) ou d’acide chlorhydrique seul (HCl). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Teneur en fer non hémique déterminée dans divers tissus par dosage colorimétrique à base de bathophénonthroline. Taux de fer non hémique dans le foie, la rate, le cœur et le pancréas de souris mâles de type sauvage C57BL/6 (cercles ouverts) et de souris Hamp1-/- mâles déficientes en hepcidine sur fond génétique C57BL/6 (carrés ouverts) à l’âge de 8 semaines, mesurés avec le test colorimétrique à base de bathophénanthroline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Niveaux de fer non hémique hépatique chez les jeunes femelles du bar européen après modulation expérimentale du fer. La surcharge en fer a été obtenue par l’administration intrapéritonéale de 2 mg de dextran de fer, tandis que l’anémie a été induite par le retrait de 2% v / p de sang des vaisseaux caudales. Les foies ont été prélevés 4 jours après le traitement au fer ou la collecte de sang. Les animaux témoins étaient des bars en bonne santé et non traités. Les niveaux de fer non hémique ont été mesurés avec le test colorimétrique à base de bathophénanthroline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Taux de fer non hémique chez la drosophile âgée de 1 mois, mesurés à l’aide du test colorimétrique à base de bathophénonthroline. Les résultats montrent (A) la teneur en fer non hémique dans chaque groupe de 20 mouches ou (B) la teneur estimée en fer de chaque mouche individuelle, en tenant compte d’un poids moyen de 0,64 mg / mouche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un protocole pour la mesure de la teneur en fer non hémique dans les tissus animaux est fourni, en utilisant une adaptation du dosage colorimétrique à base de bathophénanthroline décrit à l’origine par Torrance et Bothwell5,6. Les étapes critiques de la méthode sont le séchage des échantillons de tissus; dénaturation des protéines et libération de fer inorganique par hydrolyse acide; réduction du fer ferrique (Fe3+) à l’état ferreux (Fe2+) en présence de l’agent réducteur acide thioglycolique, et sa réaction avec un réactif bathophénothroline (réaction chromogène); lecture d’absorbance du complexe rose ion ferreux / bathophphénanthroline résultant; et calcul de la teneur en fer des tissus.
Le présent travail montre comment le protocole original basé sur une cuvette peut être adapté à un format basé sur 96 puits pour un débit plus élevé, sans compromettre la sensibilité du test. Notamment, cette adaptation permet un gain de temps considérable puisque : 1) un plus grand nombre de réactions chromogènes peuvent être préparées simultanément dans des plaques de 96 puits à l’aide de pipettes multicanaux ; et 2) les lectures d’absorbance sont considérablement plus rapides dans un lecteur de plaques que lors de l’utilisation d’un spectrophotomètre. Un autre avantage important du test à base de microplaques est l’ajustement des volumes de réaction chromogène, ce qui réduit considérablement les coûts avec les réactifs (en particulier avec le réactif bathophénanthroline). L’ensemble du protocole peut être complété en 4 jours. Le séchage des échantillons (qui peut prendre jusqu’à 48 h lorsqu’il est effectué dans un four à 65 °C) et la digestion acide (qui est commodément effectuée pendant la nuit pendant 20 h) sont les deux étapes les plus chronophages. Le séchage des échantillons peut être accéléré à l’aide d’un four de digestion par micro-ondes conçu pour une utilisation en laboratoire dans la digestion, la dissolution, l’hydrolyse ou le séchage d’une large gamme de matériaux. Comme il est possible de sécher la plupart des échantillons de tissus en moins de 2,5 h, on peut effectuer l’ensemble du protocole en seulement 2 jours. Cependant, étant donné que la capacité d’un micro-ondes est limitée au nombre de gobelets en téflon qu’il peut contenir et que les gobelets doivent être lavés et décontaminés après chaque utilisation, les utilisateurs peuvent trouver plus pratique de sécher les échantillons dans des plaques à 24 puits à 65 ° C lorsqu’ils manipulent un grand nombre d’échantillons. Le temps nécessaire pour sécher les tissus peut encore être réduit en utilisant des températures supérieures à 65 °C; cependant, la matière plastique doit être évitée en raison du risque de fusion.
Auparavant, Grundy et al.11 avaient développé une adaptation de la méthode dans laquelle l’ensemble du test est effectué dans des plaques de 96 puits, sans inclure d’étape de séchage de l’échantillon. Cependant, la mesure des métaux dans les tissus en utilisant le poids humide au lieu du poids sec est significativement affectée par la quantité variable de perte de poids par séchage à l’air à la fois dans les échantillons de tissus frais et congelés12. Par conséquent, il est recommandé de normaliser la teneur en fer par rapport au poids sec des tissus. Si le séchage des tissus n’est pas une option viable (p. ex., le tissu adipeux), il est suggéré que le dosage soit effectué rapidement après le prélèvement de l’échantillon, de sorte que la détermination précise du poids frais ne soit pas affectée de manière significative par les artefacts d’entreposage.
La composition de la solution acide a également été abordée. Selon le protocole original5,6, les tissus sont digérés avec un mélange acide composé d’acide chlorhydrique et d’acide trichloroacétique. Cependant, les présents travaux démontrent que l’acide chlorhydrique à 37% seul est tout aussi efficace, au moins pour la digestion des échantillons de foie et de rate.
La solution standard de fer mère est préparée à l’aide de poudre de fer carbonyle, qui est une poudre de fer peu coûteuse et très pure. Selon l’approche décrite dans le présent document, une solution étalon de fer mère contenant 1,1169 mg de Fe/mL (20 mM) a été préparée, telle que déterminée ultérieurement par le SAA. D’autres sources de fer (p. ex. sulfate de fer, nitrilotriacétate de fer) ou des solutions étalons commerciales peuvent être utilisées pour générer la solution étalon de fer mère, à condition que la concentration réelle en fer soit déterminée et que la linéarité du dosage soit confirmée par l’exécution d’une courbe standard.
En utilisant la méthode actuelle, la teneur en fer non hémique d’une variété de tissus animaux a été mesurée avec succès. Les résultats représentatifs obtenus avec les tissus de rongeurs (foie, rate, cœur et pancréas), le foie de bar et la drosophile entière sont inclus. La méthode ne nécessite pas d’outils analytiques sophistiqués ou d’infrastructure coûteuse, et peut donc être facilement mise en œuvre dans la plupart des laboratoires. En résumé, la méthode décrite ici peut être largement appliquée dans les études sur l’homéostasie du fer et les troubles liés au fer en utilisant des modèles animaux expérimentaux de surcharge ou de carence en fer.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des fonds nationaux par l’intermédiaire de FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., dans le cadre du projet UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
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