Summary
Hier wird ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter kolorimetrischer Assay verwendet wird, der in den meisten Labors leicht implementiert werden kann.
Abstract
Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff. Sowohl Eisenüberladung als auch -mangel sind für den Menschen sehr schädlich, und der Eisenspiegel im Gewebe ist fein reguliert. Die Verwendung experimenteller Tiermodelle für Eisenüberladung oder -mangel war hilfreich, um das Wissen über die Mechanismen zu erweitern, die an der systemischen und zellulären Regulation der Eisenhomöostase beteiligt sind. Die Messung des Gesamteisengehalts in tierischen Geweben wird üblicherweise mit Atomabsorptionsspektroskopie oder mit einem kolorimetrischen Assay durchgeführt, der auf der Reaktion von Nicht-Häm-Eisen mit einem Bathophenanthrolin-Reagenz basiert. Seit vielen Jahren wird der kolorimetrische Assay zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in einer Vielzahl von tierischen Geweben eingesetzt. Im Gegensatz zur Atomabsorptionsspektroskopie schließt es den Beitrag von Häm-Eisen aus, das aus Hämoglobin gewonnen wird, das in roten Blutkörperchen enthalten ist. Darüber hinaus erfordert es keine ausgefeilten analytischen Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung und kann daher in den meisten Labors leicht implementiert werden. Schließlich kann der kolorimetrische Assay entweder küvettenbasiert oder an ein Mikroplattenformat angepasst sein, was einen höheren Probendurchsatz ermöglicht. Die vorliegende Arbeit liefert ein gut etabliertes Protokoll, das für den Nachweis von Veränderungen des Eisengehalts im Gewebe in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladung oder Eisenmangel geeignet ist.
Introduction
Eisen ist ein essentieller Mikronährstoff, der für die Funktion von Proteinen benötigt wird, die an entscheidenden biologischen Prozessen wie Sauerstofftransport, Energieproduktion oder DNA-Synthese beteiligt sind. Wichtig ist, dass sowohl Eisenüberschuss als auch Eisenmangel für die menschliche Gesundheit sehr schädlich sind und der Eisenspiegel im Gewebe fein reguliert ist. Abnorme Eisenaufnahme in der Nahrung, Eisenmangel, wiederholte Bluttransfusionen und chronische Entzündungen sind häufige Ursachen für Eisen-assoziierte Erkrankungen, von denen Milliarden von Menschen weltweit betroffen sind1,2,3.
Experimentelle Tiermodelle der Eisenüberladung oder -mangel waren maßgeblich daran beteiligt, unser Wissen über die Mechanismen der systemischen und zellulären Regulation der Eisenhomöostase zu erweitern4. Trotz der erheblichen Fortschritte, die in den letzten zwei Jahrzehnten erzielt wurden, sind viele wichtige Aspekte nach wie vor schwer fassbar. In den kommenden Jahren wird die genaue Messung des Gesamteisgehalts in tierischen Geweben ein entscheidender Schritt bleiben, um die Forschung auf dem Gebiet der Eisenbiologie voranzutreiben.
Die meisten Labore quantifizieren Gewebeeisen entweder mit Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) oder einem kolorimetrischen Assay, der auf der Reaktion von Nicht-Häm-Eisen mit einem Bathophenanthrolin-Reagenz basiert. Letzteres basiert auf der ursprünglichen Methode, die Torrance und Bothwell vor über 50 Jahren beschrieben haben5,6. Während später eine Variation dieser Methode entwickelt wurde, bei der Ferrozin als Alternative zu Bathophenanthrolin7 verwendet wurde, bleibt letzteres das am häufigsten zitierte chromogene Reagenz in der Literatur.
Die Methode der Wahl hängt oft vom verfügbaren Fachwissen und der Infrastruktur ab. Während AAS und ICP-MS empfindlicher sind, bleibt der kolorimetrische Assay weit verbreitet, da er die folgenden wichtigen Vorteile bietet: i) es schließt den Beitrag von Häm-Eisen aus, das aus Hämoglobin gewonnen wird, das in roten Blutkörperchen enthalten ist; ii) es erfordert keine ausgefeilten analytischen Fähigkeiten oder sehr teure Ausrüstung; und iii) der ursprüngliche Küvetten-basierte Assay kann an ein Mikroplattenformat angepasst werden, was einen höheren Probendurchsatz ermöglicht. Der kolorimetrische Ansatz, der in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird routinemäßig verwendet, um Veränderungen des Gewebe-Nicht-Häm-Eisenspiegels in einer Vielzahl von experimentellen Tiermodellen von Eisenüberladung oder Eisenmangel, von Nagetieren bis hin zu Fischen und Fruchtfliegen, zu quantifizieren. Hier wird ein Protokoll für die Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischem Gewebe bereitgestellt, wobei ein einfacher, gut etablierter, kolorimetrischer Assay verwendet wird, den die meisten Laboratorien leicht implementieren sollten.
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Protocol
C57BL/6 Mäuse wurden kommerziell gekauft und Hepcidin-Null (Hamp1−/−) Mäuse auf einem C57BL/6 Hintergrund8 waren ein freundliches Geschenk von Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankreich). Die Tiere wurden in der i3S-Tieranlage unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in einer temperatur- und lichtkontrollierten Umgebung untergebracht, mit freiem Zugang zu Standard-Nagetierfutter und Wasser. Der Europäische Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax) wurde von einer kommerziellen Fischfarm gekauft und in der ICBAS-Tieranlage in einer temperatur- und lichtkontrollierten Umgebung untergebracht und täglich ad libitum mit Standard-Wolfsbarschfutter gefüttert. Alle Verfahren mit Wirbeltieren wurden von der i3S-Tierethikkommission und der nationalen Behörde Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) genehmigt. Informationen über kommerzielle Reagenzien, Geräte und Tiere sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Lösungsvorbereitung
HINWEIS: Behandeln und bereiten Sie alle Reagenzien und Lösungen mit eisenfreien Glaswaren oder Einwegplastikwaren vor. Lassen Sie metallische Labormaterialien (z. B. Edelstahlspatel) aufgrund des Risikos einer Eisenkontamination nicht mit Reagenzien oder Lösungen in Berührung kommen. Stellen Sie sicher, dass alle wiederverwendbaren Glaswaren eisenfrei sind. Waschen Sie die Materialien mit geeignetem Laborwaschmittel für 30-60 min, spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab, tränken Sie sie über Nacht in einer 37% igen Salpetersäurelösung, die 1:3 mit deionisiertem Wasser verdünnt ist, spülen Sie sie erneut mit deionisiertem Wasser ab und lassen Sie sie trocknen.
- Säuremischung: Fügen Sie 10 g Trichloressigsäure zu 82,2 ml 37% Salzsäure in einer Glasflasche hinzu, lösen Sie es gründlich auf und stellen Sie das endgültige Volumen mit entionisiertem Wasser auf 100 ml ein. Vor Gebrauch schütteln. Alternativ können Sie nur 37% Salzsäure für die Gewebeverdauung verwenden.
HINWEIS: Die Lösung ist mindestens 2 Monate haltbar, wenn sie in dunkelbraunen Glasreagenzflaschen gelagert wird.
ACHTUNG: Salzsäure und Trichloressigsäure sind ätzend und konzentrierte Formen setzen giftige saure Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit Säuren jederzeit Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und Chemikalienspritzschutzbrillen. Vermeiden Sie es, sie einzuatmen und immer mit Säuren umzugehen, während Sie sich unter einem Abzug befinden. - Gesättigtes Natriumacetat: 228 g wasserfreies Natriumacetat in eine Glasflasche zu 400 ml entionisiertem Wasser geben und über Nacht bei Raumtemperatur rühren. Lassen Sie die Lösung ruhen und einen Tag lang ausfällen. Wenn kein Niederschlag auftritt, fügen Sie weiterhin kleine Mengen Natriumacetat hinzu. Lagern Sie die Lösung in einer Glasflasche.
- Chromogen-Reagenz: Zur Herstellung von 1 ml chromogenem Reagenz 1 mg 4,7-Diphenyl-1,10-phenanthrilines Disulfonsäure-Dinatriumsalz zu 500 μL deionisiertem Wasser und 10 μL konzentrierter (100%) Thioglykolsäure und gründlich auflösen. Machen Sie das endgültige Volumen auf 1 ml mit deionisiertem Wasser aus.
HINWEIS: Bereiten Sie so viel Chromogenreagenz wie nötig vor. Die Lösung ist 1 Monat lang stabil, wenn sie vor Licht geschützt ist. - Working Chromogen Reagent (WCR): Fügen Sie 1 Volumen des Chromogenreagenzes zu 5 Volumen gesättigtem Natriumacetat und 5 Volumen deionisiertem Wasser hinzu.
HINWEIS: Diese Lösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden. - Stamm-Eisen-Standardlösung: Um eine 20 mM Stammeisenlösung herzustellen, geben Sie 111,5 mg Carbonyleisenpulver in einen 250-ml-Messkolben, der 5.480 μL 37% Salzsäure enthält. Über Nacht bei Raumtemperatur auflösen lassen (oder in einem kochenden Wasserbad inkubieren). Dann machen Sie die Lösung zu einem endgültigen Volumen von 100 ml mit deionisiertem Wasser.
HINWEIS: Die Standardlösung kann auf unbestimmte Zeit aufbewahrt werden, wenn sie in einem dicht verschlossenen Behälter gelagert wird. - Working Iron Standard Solution (WISS): 13,5 μL 37% Salzsäure zu 500 μL deionisiertem Wasser hinzufügen. 10 μL der Stammeisen-Standardlösung zugeben und das Endvolumen mit deionisiertem Wasser auf 1 ml auffüllen (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; gemessen durch AAS).
HINWEIS: Die Arbeitslösung sollte am Tag der Anwendung frisch zubereitet werden.
2. Probentrocknung
- Schneiden Sie eine Gewebeprobe mit einem Gewicht von 10-100 mg mit einer Skalpellklinge. Wiegen Sie es genau in einer analytischen / Präzisionswaage über einem kleinen Stück Parafilm (Fresh Weight).
- Legen Sie das Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in eine 24-Well-Platte (unbedeckt, um eine Wasserverdunstung zu ermöglichen) und lassen Sie es auf einem Standard-Inkubator bei 65 ° C für 48 h trocknen.
- Alternativ können Sie einen Mikrowellen-Aufschlussofen im Labor zum Trocknen von Gewebeproben verwenden. Legen Sie das gewogene Stück Gewebe mit einer Plastikpinzette in einen eisenfreien Teflonbecher und trocknen Sie es in der Mikrowelle. Stellen Sie die Betriebsparameter gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts ein.
HINWEIS: Als Referenz sind die Betriebsparameter für die Trocknung von Leberproben mit dem spezifischen Faulofen (siehe Materialtabelle) in Tabelle 1 aufgeführt. - Legen Sie mit einer Kunststoffpinzette jedes getrocknete Stück Gewebe über ein kleines Stück Parafilm in einer Analyse- / Präzisionswaage und wiegen Sie es genau (Trockengewicht).
3. Probe saurer Aufschluss
- Übertragen Sie jedes getrocknete Gewebestück mit einer Kunststoffpinzette in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 1 ml der Säuremischung hinzu und schließen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie einen sauren Rohling auf die gleiche Weise vor, außer dass das Gewebe weggelassen wird.
VORSICHT: Das Säuregemisch ist ätzend und setzt giftige Dämpfe frei. Tragen Sie beim Umgang mit der Säuremischung Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und eine chemische Spritzschutzbrille. Vermeiden Sie es, es einzuatmen und behandeln Sie es immer unter einem Abzug. - Verdauen Sie das Gewebe, indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Inkubator bei 65 °C für 20 h inkubieren.
- Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 500 μL des klaren (gelben) Säureextrakts (Überstand) mit einer mit Kunststoffspitzen versehenen Mikropipette in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Wenn es nicht möglich ist, einen klaren Überstand zu erhalten, führen Sie einen kurzen Zentrifugationsspin durch.
ACHTUNG: Der Überstand ist stark sauer. Tragen Sie beim Umgang mit den Überständen Schutzkleidung, chemikalienbeständige Handschuhe und Chemikalienspritzschutzbrillen. Behandeln Sie sie immer unter einem Abzug.
HINWEIS: An dieser Stelle können die Säureextrakte sofort für den kolorimetrischen Assay verwendet oder bei -20 °C für die spätere Verwendung eingefroren werden. Tauen Sie gefrorene Proben vollständig auf Raumtemperatur auf und wirbeln Sie sie vor der Verwendung ein.
4. Farbentwicklung
- Chromogenreaktionen gemäß Tabelle 2 in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder, für höheren Durchsatz, direkt in den flachen Boden, 96-Well, klare, unbehandelte Polystyrol-Mikrotiterplatten vorbereiten. Bereiten Sie alle Reaktionen (Säurerohling, Standard und Probe) mindestens doppelt vor.
- Bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.
5. Absorptionsmessung
- Messen Sie die Probenabsorption in einem Spektralphotometer oder Plattenleser bei einer Wellenlänge von 535 nm gegen eine deionisierte Wasserreferenz. Platten können unbedeckt oder deckelfrei gelesen werden. Entfernen Sie im Deckelgehäuse jegliche Kondensation, die sich aufgrund der Freisetzung von Säuredämpfen aus dem Deckel kurz vor der Messung gebildet hat, um mögliche Interferenzen mit dem Absorptionswert zu vermeiden.
HINWEIS: Die optische Absorption des Säurerohlings gegen deionisiertes Wasser (Referenz) sollte kleiner als 0,015 sein; Die optische Absorption des Standards und der Proben sollte zwischen 0,100 und 1,000 liegen. Bei Proben mit sehr hohem oder sehr niedrigem Eisengehalt müssen die Volumina von Säureextrakt (Überstand) und diH2O möglicherweise angepasst werden (Tabelle 2): Wenn die Absorption größer als 1,0 ist, verwenden Sie ein kleineres Probenvolumen (Überstand); Wenn die Absorption niedriger als 0,1 ist, verwenden Sie ein höheres Volumen des Überstands. Das Probenvolumen (Vsmp) wird bei der Berechnung des Eisengehalts des Gewebes jeder Probe berücksichtigt (siehe Schritt 6).
6. Berechnung des Gewebeeisengehalts
- Berechnen Sie den Eisengehalt an Nicht-Häm-Gewebe mit der folgenden Gleichung:
Gewebeeisen (μg/g Trockengewebe) =
AT = Absorption der Probe
AB = Absorption von saurem Rohling
AS = Absorption des Standards
Fes = Eisenkonzentration von WISS (μg Fe/ml)
W = Gewicht des Trockengewebes (g)
Vsmp = Probenvolumen (variables Volumen des Überstands in Tabelle 2 umgerechnet in ml)
Vf = Endvolumen der Säuremischung nach Inkubation über Nacht bei 65 °C (entspricht dem Säurevolumen plus Trockengewebevolumen in ml; wenn sich die Probengewichte nicht wesentlich unterscheiden, nehmen Sie ein konstantes Volumen ≈ 1 ml an)
Vstd = Eisenstandardvolumen (WISS-Volumen in Tabelle 2 umgerechnet in ml)
Vrv = Endreaktionsvolumen (Gesamtvolumen in Tabelle 2 umgerechnet in ml)
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Representative Results
Vergleich von Küvette zu 96-Well-Mikrotiterplatten
Die Messung von Gewebe-Nicht-Häm-Eisen durch Reaktion mit einem ursprünglich von Torrance und Bothwell5,6 beschriebenen Bathophenanthrol-Reagenz beruht auf der Verwendung eines Spektralphotometers zur Absorptionsmessung. Daher sind die in der Chromogenreaktion verwendeten Volumina mit der Größe einer normalen Spektralphotometerküvette kompatibel. Die vorliegende Arbeit beschreibt eine Methodenanpassung, bei der die chromogenen Reaktionen direkt in einer 96-Well-Mikrotiterplatte zur Absorptionsmessung in einem Mikroplattenleser vorbereitet werden, was kleinere Reagenzvolumina erfordert und einen höheren Durchsatz ermöglicht.
Um die Empfindlichkeit beider Ansätze zu vergleichen, wurde zunächst eine serielle Verdünnung der Standardlösung für Arbeitseisen (WISS) vorbereitet, und die Chromogenreaktionen wurden entweder in 1,5-ml-Rohren oder in 96-Well-Platten montiert, wie in Tabelle 2 angegeben. Die Absorption wurde in einem Spektralphotometer (mit Küvette) bzw. in einem Mikroplattenleser gemessen. Repräsentative Standardkurven, die mit den beiden Ansätzen erzeugt wurden, sind in Abbildung 1A dargestellt. In beiden Fällen war die Linearität über die getesteten Eisenkonzentrationen sehr hoch (r2 = 0,9996 bzw. r2 = 0,9997 für Mikrotiterplatten bzw. Küvette).
Bemerkenswert ist, dass ein WISS mit 11,169 μg Fe/ml verwendet wurde. Die vorliegenden Daten zeigen, dass niedrigere Eisenkonzentrationen verwendet werden können, um den Standard vorzubereiten. Die Verwendung eines WISS mit höheren Eisenkonzentrationen wird jedoch nicht empfohlen, da dies zu Absorptionswerten führen könnte, die den linearen Dynamikbereich des Spektralphotometers überschreiten und zu einem Plateau der Standardkurven führen.
Um die auf Küvetten und Mikrotiterplatten basierenden Assays weiter zu vergleichen, wurde der Nicht-Häm-Eisengehalt in insgesamt 55 Mausgewebeproben (Leber, Milz, Herz, Lunge, Knochenmark) gemessen. Zwischen den beiden Methoden wurde ein sehr hohes Maß an Korrelation beobachtet (r = 0,999, p < 0,0001), was darauf hindeutet, dass die auf Mikrotiterplatten basierende Methode eine gültige Alternative zur ursprünglichen küvettenbasierten Methode darstellt (Abbildung 1B).
Schließlich wurden Nicht-Häm-Eisenspiegel in Mausgeweben mit der auf Mikrotiterplatten basierenden Methode nach saurem Aufschluss von Proben aus denselben Geweben mit entweder einer Mischung aus Salzsäure und Trichloressigsäure (gemäß der ursprünglichen Methodenbeschreibung) oder Salzsäure allein quantifiziert. Es wurde eine sehr hohe Korrelation beobachtet (r = 0,999, p < 0,0001, Abbildung 1C), die zeigt, dass Trichloressigsäure bei der Säureverdauung weggelassen werden kann.
Die unten aufgeführten repräsentativen Ergebnisse wurden durch Messung der Probenabsorption in 96-Well-Platten erzielt.
Messung des Gewebe-Nicht-Häm-Eisenspiegels in einem Mausmodell der genetischen Hämochromatose
Mit dem bathophenanthrolinbasierten kolorimetrischen Assay wurde der Nicht-Häm-Eisengehalt in verschiedenen Geweben (Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse) aus dem häufig verwendeten Mausstamm C57BL/6 und aus Hepcidin-Knockout-Mäusen (Hamp1-/-) (in einem genetischen C57BL/6-Hintergrund) bestimmt. Repräsentative Eisenwerte sind in Abbildung 2 dargestellt. Hepcidin ist ein wichtiger Regulator des Eisenstoffwechsels und seine Störung führt zu einem hämochromatoseähnlichen Eisenabscheidungsphänotyp mit schwerer hepatischer, pankreatischer und kardialer Eisenakkumulation und Milzeisenabbau8.
Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in Wolfsbarschleber nach experimenteller Eisenmodulation
Unter Verwendung des bathophenanthrolinbasierten kolorimetrischen Assays wurden Nicht-Häm-Eisenspiegel in der Leber von gesundem (Kontrolle), Eisenbehandlung (2 mg Eisendextran intraperitoneal verabreicht) und anämischem (2% v/w Blut aus den Schwanzgefäßen) europäischem Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax) bestimmt. Erwartungsgemäß stiegen die Lebereisenspiegel bei eisenbehandelten Tieren massiv an, während Anämie eine leichte Verringerung der hepatischen Eisenspeicher verursachte (Abbildung 3).
Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts im gesamten Drosophila melanogaster
Obwohl die derzeitige Methode aufgrund ihrer geringen Körpermasse (Durchschnittsgewicht 0,6 mg bzw. 0,8 mg für Männer und Frauen)9 nicht geeignet ist, den Nicht-Häm-Eisenspiegel bei einzelnen Drosophila-Fliegen zu messen, kann sie erfolgreich mit gepoolten Fliegen verwendet werden. Abbildung 4 zeigt repräsentative Nicht-Häm-Eisenwerte für Gruppen von 20 ganzen männlichen Fliegen, entweder Wildtyp-Oregon-R oder Malvolio (Mvl) Knockout. Mvl ist das Homolog des SLC11A2-Gens von Säugetieren, das für ein Protein namens divalenter Metalltransporter 1 (DMT1) kodiert, und seine genetische Störung führt zu Eisenmangel10. Wie erwartet, wiesen Mlv-Fliegen im Vergleich zum Wildtyp einen wesentlich niedrigeren Körpergehalt an Nicht-Häm-Eisen auf.
| Leistung 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Druck (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Zeit (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Zeit bei Druck (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| VENTILATOR: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabelle 1: Betriebsparameter für die Lebertrocknung in einem hier verwendeten Mikrowellen-Verdauungsofen.
| WCR (μL) | Säuregemisch (μL) | Überstand (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Gesamtvolumen (μL) | ||
| 1,5 ml Röhren | Säure Blank | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Norm | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Probe | 1000 | Variable | Variable | 1300 | |||
| 96-Well-Mikrotiterplatte | Säure Blank | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Norm | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Probe | 150 | Variable | Variable | 195 |
Tabelle 2: Vorbereitung von Chromogenreaktionen in 1,5-ml-Röhrchen oder 96-Well-Platten.
Abbildung 1: Bestimmung von Nicht-Häm-Eisen durch die küvetten- oder 96-Well-Mikrotiterplatten-basierten kolorimetrischen Assays. (A) Standardkurven für Mikroplatten- (offene Quadrate
) und küvettenbasierte (offene Dreiecke Δ) Assays. (B) Korrelation zwischen küvettenbasierten und mikroplattenbasierten Nicht-Häm-Eisenspiegeln in 55 Gewebeproben von 6 Monate alten männlichen C57BL/6-Mäusen, einschließlich Leber (feste Kreise), Milz (offene Kreise), Herz (feste Dreiecke
), Lunge 
(Sternchen
) und Knochenmark (Diamanten
). (C) Nicht-Häm-Eisenspiegel in einer Untergruppe von Geweben von 6 Monate alten männlichen Mäusen (Leber, feste Kreise; Milz, offene Kreise), gemessen mit dem 96-Well-Microplatten-basierten Assay nach saurem Aufschluss von Proben mit einer Mischung aus Salzsäure und Trichloressigsäure (HCl + C2HCl3O2) oder Salzsäure allein (HCl). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Nicht-Häm-Eisengehalt, bestimmt in verschiedenen Geweben durch bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay. Nicht-Häm-Eisenspiegel in Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse von männlichen C57BL/6-Wildtyp-Mäusen (offene Kreise) und männlichen Hepcidin-defizienten Hamp1-/- Mäusen auf dem genetischen Hintergrund von C57BL/6 (offene Quadrate) im Alter von 8 Wochen, gemessen mit dem bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Hepatischer Nicht-Häm-Eisengehalt im juvenilen weiblichen europäischen Wolfsbarsch nach experimenteller Eisenmodulation. Die Eisenüberladung wurde durch intraperitoneale Verabreichung von 2 mg Eisendextran erreicht, während die Anämie durch den Entzug von 2% v/w Blut aus den Schwanzgefäßen induziert wurde. Lebern wurden 4 Tage nach der Eisenbehandlung oder Blutentnahme gesammelt. Kontrolltiere waren gesunde, unbehandelte Wolfsbarsche. Nicht-Häm-Eisenspiegel wurden mit dem bathophenanthrolinbasierten kolorimetrischen Assay gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Nicht-Häm-Eisenspiegel bei 1 Monat alter Drosophila, gemessen mit dem bathophenanthrolin-basierten kolorimetrischen Assay. Die Ergebnisse zeigen (A) den Nicht-Häm-Eisengehalt in jedem Pool von 20 Fliegen oder (B) den geschätzten Eisengehalt jeder einzelnen Fliege unter Berücksichtigung eines Durchschnittsgewichts von 0,64 mg / Fliege. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Ein Protokoll zur Messung des Nicht-Häm-Eisengehalts in tierischen Geweben wird unter Verwendung einer Anpassung des ursprünglich von Torrance und Bothwell beschriebenen bathophenanthrolinbasierten kolorimetrischen Assays bereitgestellt5,6. Die kritischen Schritte der Methode sind die Trocknung von Gewebeproben; Proteindenaturierung und Freisetzung von anorganischem Eisen durch saure Hydrolyse; Reduktion von Eisen (Fe3+) Eisen in den Eisenzustand (Fe2+) in Gegenwart des Reduktionsmittels Thioglykolsäure und seine Reaktion mit einem bathophenanthrilinen Reagenz (Chromogenreaktion); Absorptionsmessung des resultierenden eisenhaltigen Ionen/Bathophenanthrolin-rosa Komplexes; und Berechnung des Eisengehalts im Gewebe.
Die vorliegende Arbeit zeigt, wie das ursprüngliche küvettenbasierte Protokoll für einen höheren Durchsatz an ein 96-basiertes Format angepasst werden kann, ohne die Assay-Empfindlichkeit zu beeinträchtigen. Insbesondere ermöglicht diese Anpassung eine erhebliche Zeitersparnis, da: 1) eine größere Anzahl von Chromogenreaktionen gleichzeitig in 96-Well-Platten unter Verwendung von Mehrkanalpipetten vorbereitet werden kann; und 2) Absorptionswerte sind in einem Plattenleser dramatisch schneller als bei Verwendung eines Spektralphotometers. Ein weiterer wichtiger Vorteil des mikrotiterplattenbasierten Assays ist die Anpassung der chromogenen Reaktionsvolumina, wodurch die Kosten mit Reagenzien (insbesondere mit dem Bathophenanthrol-Reagenz) erheblich gesenkt werden. Das gesamte Protokoll kann in 4 Tagen abgeschlossen werden. Die Probentrocknung (die bis zu 48 h dauern kann, wenn sie in einem Ofen bei 65 ° C durchgeführt wird) und die saure Verdauung (die bequem über Nacht für 20 h durchgeführt wird) sind die beiden zeitaufwendigsten Schritte. Die Probentrocknung kann mit einem Mikrowellen-Aufschlussofen beschleunigt werden, der für den Laboreinsatz beim Verdauen, Auflösen, Hydrolysieren oder Trocknen einer Vielzahl von Materialien entwickelt wurde. Da es möglich ist, die meisten Gewebeproben in weniger als 2,5 h zu trocknen, kann man das gesamte Protokoll in nur 2 Tagen durchführen. Da die Kapazität einer Mikrowelle jedoch auf die Anzahl der Teflonbecher beschränkt ist, in die sie passen kann, und weil die Becher nach jedem Gebrauch gewaschen und dekontaminiert werden müssen, kann es für Benutzer bequemer sein, Proben in 24-Well-Platten bei 65 ° C zu trocknen, wenn eine hohe Anzahl von Proben gehandhabt wird. Die zum Trocknen des Gewebes erforderliche Zeit kann durch die Verwendung von Temperaturen über 65 ° C noch verkürzt werden. Kunststoffmaterial muss jedoch aufgrund der Schmelzgefahr vermieden werden.
Zuvor hatten Grundy et al.11 eine Anpassung der Methode entwickelt, bei der der gesamte Assay in 96-Well-Platten durchgeführt wird, ohne einen Probentrocknungsschritt einzubeziehen. Die Messung von Metallen in Geweben unter Verwendung von Nassgewicht anstelle von Trockengewicht wird jedoch durch die variable Menge an Gewichtsverlust durch Lufttrocknung sowohl in frischen als auch in gefrorenen Gewebeproben erheblich beeinflusst12. Daher wird empfohlen, den Eisengehalt gegen das Trockengewicht des Gewebes zu normalisieren. Wenn die Gewebetrocknung keine praktikable Option ist (z. B. Fettgewebe), wird empfohlen, dass der Assay unverzüglich nach der Probenentnahme durchgeführt wird, damit die genaue Bestimmung des Frischgewichts nicht wesentlich durch Lagerartefakte beeinflusst wird.
Die Zusammensetzung der sauren Lösung wurde ebenfalls angesprochen. Nach dem ursprünglichen Protokoll5,6 werden Gewebe mit einem Säuregemisch aus Salzsäure und Trichloressigsäure verdaut. Die vorliegende Arbeit zeigt jedoch, dass 37% Salzsäure allein ebenso effizient ist, zumindest für die Verdauung von Leber- und Milzproben.
Die Standardlösung für Stammeisen wird unter Verwendung von Carbonyleisenpulver hergestellt, einem kostengünstigen und hochreinen Eisenpulver. Nach dem hierin beschriebenen Ansatz wurde eine Standardlösung aus Eisen hergestellt, die 1,1169 mg Fe/ml (20 mM) enthielt, wie später durch AAS bestimmt. Andere Eisenquellen (z. B. Eisensulfat, Eisennitrilotriacetat) oder kommerzielle Standardlösungen können verwendet werden, um die Standardlösung für Stammeisen zu erzeugen, vorausgesetzt, dass die tatsächliche Eisenkonzentration bestimmt wird und die Assay-Linearität durch die Durchführung einer Standardkurve bestätigt wird.
Mit der aktuellen Methode konnte der Nicht-Häm-Eisengehalt einer Vielzahl von tierischen Geweben erfolgreich gemessen werden. Repräsentative Ergebnisse, die mit Nagetiergewebe (Leber, Milz, Herz und Bauchspeicheldrüse), Wolfsbarschleber und ganzen Drosophila erhalten wurden, sind enthalten. Die Methode erfordert keine ausgefeilten Analysewerkzeuge oder teure Infrastruktur und kann daher in den meisten Labors leicht implementiert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hierin beschriebene Methode in Studien zur Eisenhomöostase und eisenbedingten Störungen unter Verwendung experimenteller Tiermodelle für Eisenüberladung oder -mangel weit verbreitet sein kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von nationalen Fonds durch FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., im Rahmen des Projekts UIDB/04293/2020 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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