Summary
Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples e bem estabelecido ensaio colorimétrico que pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios.
Abstract
O ferro é um micronutriente essencial. Tanto a sobrecarga de ferro quanto a deficiência são altamente prejudiciais para os seres humanos, e os níveis de ferro tecidual são finamente regulados. O uso de modelos animais experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro tem sido fundamental para o avanço do conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação sistêmica e celular da homeostase de ferro. A medição dos níveis totais de ferro em tecidos animais é comumente realizada com espectroscopia de absorção atômica ou com um ensaio colorimétrico baseado na reação de ferro não heme com um reagente de banho-phenanthrolina. Por muitos anos, o ensaio colorimétrico tem sido usado para a medição do teor de ferro não-heme em uma ampla gama de tecidos animais. Ao contrário da espectroscopia de absorção atômica, exclui a contribuição do ferro heme derivado da hemoglobina contida em glóbulos vermelhos. Além disso, não requer habilidades analíticas sofisticadas ou equipamentos altamente caros, podendo, assim, ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios. Finalmente, o ensaio colorimétrico pode ser baseado em cuvette ou adaptado a um formato de microplape, permitindo maior rendimento amostral. O presente trabalho fornece um protocolo bem estabelecido que é adequado para a detecção de alterações nos níveis de ferro tecidual em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro.
Introduction
O ferro é um micronutriente essencial, necessário para a função de proteínas envolvidas em processos biológicos cruciais, como transporte de oxigênio, produção de energia ou síntese de DNA. É importante ressaltar que tanto o excesso de ferro quanto a deficiência de ferro são altamente prejudiciais à saúde humana, e os níveis de ferro tecidual são finamente regulados. Absorção anormal de ferro dietético, dietas deficientes de ferro, transfusões de sangue repetidas e inflamação crônica são causas comuns de distúrbios associados ao ferro que afetam bilhões de pessoas em todo o mundo1,2,3.
Modelos experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro têm sido fundamentais para avançar nosso conhecimento dos mecanismos envolvidos na regulação sistêmica e celular da homeostase de ferro4. Apesar dos progressos substanciais feitos nas últimas duas décadas, muitos aspectos-chave permanecem evasivos. Nos próximos anos, a medição precisa dos níveis totais de ferro nos tecidos animais continuará sendo um passo crítico para avançar nas pesquisas no campo da biologia do ferro.
A maioria dos laboratórios quantifica o ferro tecidual com espectroscopia de absorção atômica (AAS), espectrometria de massa plasmática indutivamente acoplada (ICP-MS), ou um ensaio colorimétrico baseado na reação de ferro não heme com um reagente de banho-phenanthrolina. Este último é baseado no método original descrito por Torrance e Bothwell há mais de 50 anos, 5,6. Embora uma variação deste método tenha sido posteriormente desenvolvida empregando ferrozina como alternativa à batiphenanthrolina7, este último continua sendo o reagente cromogênico mais citado na literatura.
O método de escolha muitas vezes depende da expertise e infraestrutura disponíveis. Embora a AAS e a ICP-MS sejam mais sensíveis, o ensaio colorimétrico permanece amplamente utilizado porque apresenta as seguintes vantagens importantes: i) exclui a contribuição do ferro heme derivado da hemoglobina contida em glóbulos vermelhos; ii) não requer habilidades analíticas sofisticadas ou equipamentos altamente caros; e iii) o ensaio original baseado em cuvette pode ser adaptado a um formato de microplape, permitindo maior rendimento amostral. A abordagem colorimétrica apresentada neste trabalho é rotineiramente utilizada para quantificar alterações nos níveis de ferro não heme de tecido em uma variedade de modelos animais experimentais de sobrecarga de ferro ou deficiência de ferro, de roedores a peixes e moscas frutíferas. Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples, bem estabelecido, ensaio colorimétrico que a maioria dos laboratórios deve encontrar fácil de implementar.
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Protocol
Os camundongos C57BL/6 foram comprados comercialmente e os ratos hepcidin-nulos (Hamp1−/−) em um fundo C57BL/68 foram um presente gentil de Sophie Vaulont (Institut Cochin, França). Os animais foram alojados na instalação de animais i3S em condições específicas sem patógenos, em um ambiente controlado pela temperatura e pela luz, com livre acesso à comida padrão de roedores e água. O robalo europeu (Dicentrarchus labrax) foi comprado em uma fazenda comercial de peixes e alojado na instalação de animais icbas, em um ambiente controlado pela temperatura e luz, e alimentado diariamente com alimentação padrão de robalo. Todos os procedimentos envolvendo animais vertebrados foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do I3S e pela autoridade nacional, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informações sobre reagentes comerciais, equipamentos e animais estão listadas na Tabela de Materiais.
1. Preparação da solução
NOTA: Manuseie e prepare todos os reagentes e soluções com vidros sem ferro ou plásticos descartáveis. Não permita que materiais de laboratório metálicos (por exemplo, espátulas de aço inoxidável) entrem em contato com qualquer reagente ou solução, devido ao risco de contaminação do ferro. Certifique-se de que qualquer vidro reutilizável esteja livre de ferro. Lave os materiais com detergente laboratorial adequado por 30-60 min, enxágue com água deionizada, mergulhe durante a noite em uma solução de ácido nítrico de 37% diluída 1:3 com água deionizada, enxágue novamente com água deionizada e deixe secar.
- Mistura de ácido: Adicione 10 g de ácido tricloroacético a 82,2 mL de ácido clorídrico de 37% em uma garrafa de vidro, dissolva completamente e ajuste o volume final para 100 mL com água desionizada. Agite antes de usar. Alternativamente, use apenas 37% de ácido clorídrico para digestão tecidual.
NOTA: A solução é estável por pelo menos 2 meses quando armazenada em garrafas de reagente de vidro marrom escuro.
ATENÇÃO: O ácido clorídrico e o ácido tricloroacético são corrosivos, e as formas concentradas liberam vapores ácidos tóxicos. Use roupas protetoras, luvas resistentes a químicos e óculos químicos ao todo momento ao manusear ácidos. Evite respirá-los e sempre manuseie ácidos sob um capô de fumaça. - Acetato de sódio saturado: Adicione 228 g de acetato de sódio anidro a 400 mL de água desionizada em uma garrafa de vidro e agitar durante a noite à temperatura ambiente. Deixe a solução descansar e precipitar por um dia. Se não ocorrer precipitação, continue adicionando pequenas quantidades de acetato de sódio. Guarde a solução em uma garrafa de vidro.
- Reagente de cromogen: Para preparar 1 mL de reagente de cromogen, adicione 1 mg de 4,7-difenil-1,10-fenrodline disulfonic ácido dissofeno sal de dissodium a 500 μL de água desionizada e 10 μL de ácido tioglicólico concentrado (100%) e completamente dissolvido. Coma o volume final de 1 mL com água deionizada.
NOTA: Prepare o máximo de reagente cromógeno necessário. A solução é estável por 1 mês quando protegida contra a luz. - Reagente de Cromogen de Trabalho (WCR): Adicione 1 volume do Reagente de Cromogen a 5 volumes de acetato de sódio saturado e 5 volumes de água desionizada.
NOTA: Esta solução deve ser preparada recentemente no dia do uso. - Solução padrão de ferro de estoque: Para preparar uma solução de ferro de estoque de 20 mM, coloque 111,5 mg de pó de ferro carbonil em um frasco volumoso de 250 mL contendo 5.480 μL de ácido clorídrico de 37%. Deixe dissolver-se durante a noite à temperatura ambiente (ou incubar em um banho de água fervente). Em seguida, compõem a solução para um volume final de 100 mL com água deionizada.
NOTA: A solução padrão pode ser mantida indefinidamente quando armazenada em um vaso bem selado. - Solução padrão de ferro de trabalho (WISS): Adicione 13,5 μL de ácido clorídrico de 37% a 500 μL de água deionizada. Adicione 10 μL da Solução Padrão de Ferro de Estoque e coma o volume final de 1 mL com água deionizada (11,169 μg de Fe/mL, 200 μM; medido por AAS).
NOTA: A solução de trabalho deve ser preparada recentemente no dia do uso.
2. Secagem de amostras
- Corte uma amostra de tecido pesando 10-100 mgs com uma lâmina de bisturi. Pese-o com precisão em uma balança analítica/de precisão sobre um pequeno pedaço de parafilme (Peso Fresco).
- Usando pinças plásticas, coloque o pedaço de tecido em uma placa de 24 poços (deslacaçada para permitir a evaporação da água) e deixe secar em uma incubadora padrão a 65 °C por 48 h.
- Alternativamente, use um forno de digestão de micro-ondas de laboratório para secagem de amostras de tecido. Usando pinças plásticas, coloque o pedaço de tecido pesado em um copo de Teflon sem ferro e seque-o no micro-ondas. Defina os parâmetros de operação de acordo com o manual de instruções do instrumento.
NOTA: Como referência, os parâmetros operacionais para a secagem de amostras hepáticas utilizando o forno de digestão específico (ver Tabela de Materiais) são mostrados na Tabela 1. - Usando pinças plásticas, coloque cada pedaço seco de tecido sobre um pequeno pedaço de parafilm dentro de uma balança analítica/de precisão e pese-o com precisão (Peso Seco).
3. Digestão ácida da amostra
- Usando pinças plásticas, transfira cada pedaço seco de tecido para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL.
- Adicione 1 mL da mistura de ácido e feche o tubo de microcentrífuga. Prepare um ácido em branco da mesma forma, exceto que o tecido é omitido.
ATENÇÃO: A mistura de ácido é corrosiva e libera vapores tóxicos. Use roupas protetoras, luvas resistentes a químicos e óculos químicos ao manusear a mistura de ácido. Evite respirar e sempre manuseie-o sob um capô de fumaça. - Digerir os tecidos incubando os tubos de microcentrifusagem em uma incubadora a 65 °C por 20 h.
- Após o resfriamento para a temperatura ambiente, transfira 500 μL do extrato de ácido claro (amarelo) (supernante) em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL usando uma micropipette equipada com pontas plásticas. Se não for possível obter um supernatante claro, realize um giro de centrifugação curta.
ATENÇÃO: O supernatante é altamente ácido. Use roupas protetoras, luvas resistentes a químicos e óculos químicos ao manusear os supernantes. Sempre manuseie-os sob um capô de fumaça.
NOTA: Neste ponto, os extratos de ácido podem ser imediatamente utilizados para o ensaio colorimétrico ou congelados a -20 °C para uso posterior. Descongele completamente amostras congeladas à temperatura ambiente e vórtice antes de usá-las.
4. Desenvolvimento de cores
- Prepare reações de cromógenos conforme indicado na Tabela 2 em tubos de microcentrífugo de 1,5 mL ou, para maior rendimento, diretamente na parte inferior plana, 96-bem, claras, microplaais de poliestireno não tratadas. Prepare todas as reações (ácido em branco, padrão e amostra) pelo menos em duplicata.
- Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos.
5. Leitura de absorvência
- Meça a absorvância da amostra em um espectrofotômetro ou leitor de placas em um comprimento de onda de 535 nm contra uma referência de água deionizada. As placas podem ser lidas sem desabis ou tampadas. No caso do tampado, remova qualquer condensação formada devido à liberação de vapores ácidos da tampa pouco antes da medição para evitar possíveis interferências na leitura de absorvância.
NOTA: A absorvância óptica da leitura em branco ácido contra água deionizada (referência) deve ser inferior a 0,015; a absorção óptica do padrão e as amostras devem estar entre 0,100 e 1.000. Para amostras com teor de ferro muito alto ou muito baixo, os volumes de extrato ácido (supernante) e diH2O podem precisar ser ajustados (Tabela 2): se a absorção for maior que 1,0, utilize um volume menor de amostra (sobrenante); quando a absorção for inferior a 0,1, use um volume maior do supernaspe. O volume amostral (Vsmp) é levado em conta ao calcular o teor de ferro de tecido de cada amostra (ver passo 6).
6. Cálculo do teor de ferro de tecido
- Calcule o teor de ferro de tecido não heme com a seguinte equação:
Ferro de tecido (tecido seco μg/g) =
AT = absorvância da amostra de ensaio
AB = absorvância de ácido em branco
AS = absorção de padrão
Fes = concentração de ferro de WISS (μg Fe/mL)
W = peso do tecido seco (g)
Vsmp = volume amostral (volume variável de Supernatant na Tabela 2 convertido em mL)
Vf = volume final de mistura ácida após a incubação durante a noite a 65 °C (correspondente ao volume ácido mais volume de tecido seco em mL; se os pesos amostrais não diferem significativamente, assuma um volume constante ≈ 1 mL)
Vstd = volume padrão de ferro (volume de WISS na Tabela 2 convertido em mL)
Vrv = volume de reação final (Volume total na Tabela 2 convertido em mL)
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Representative Results
Cuvette versus comparação de microplacões de 96 poços
A medição do tecido não-heme ferro por reação com um reagente de banho-phenanthrolina originalmente descrito por Torrance e Bothwell5,6 conta com o uso de um espectrofotômetro para leitura de absorvência. Assim, os volumes empregados na reação cromogênica são compatíveis com o tamanho de um cuvette espectrofotômetro regular. O presente trabalho descreve uma adaptação do método em que as reações cromógenas são preparadas diretamente em uma microplacão de 96 poços para medição de absorvência em um leitor de microplatos, exigindo volumes menores de reagente e permitindo maior rendimento.
Para comparar a sensibilidade de ambas as abordagens, foi inicialmente preparada uma diluição serial da solução padrão de ferro de trabalho (WISS), e as reações cromógenas foram montadas em tubos de 1,5 mL ou em placas de 96 poços, conforme indicado na Tabela 2. A absorvência foi medida em um espectrofotômetro (com cuvette) ou em um leitor de microplape, respectivamente. As curvas padrão representativas geradas com as duas abordagens são retratadas na Figura 1A. Em ambos os casos, a linearidade foi muito alta (r2 = 0,9996 e r2 = 0,9997 para microplaque e cuvette, respectivamente) nas concentrações de ferro testadas.
Destaca-se que foi utilizado um WISS contendo 11.169 μg de Fe/mL. Os dados atuais mostram que concentrações de ferro mais baixas podem ser usadas para preparar o padrão. No entanto, o uso de um WISS com maiores concentrações de ferro não é recomendado, pois isso poderia levar a valores de absorção que excedem o alcance dinâmico linear de detecção do espectrofotômetro, fazendo com que as curvas padrão se nivelassem.
Para comparar ainda mais os ensaios à base de cuvette e microplacos, o teor de ferro não heme foi medido em um total de 55 amostras de tecido de camundongos (fígado, baço, coração, pulmão, medula óssea). Observou-se um grau muito elevado de correlação entre as duas metodologias (r = 0,999, p < 0,0001), indicando que o método baseado em microplatos é uma alternativa válida ao método original baseado em cuvette (Figura 1B).
Finalmente, os níveis de ferro não heme nos tecidos do rato foram quantificados com o método à base de microplaca após a digestão ácida de amostras derivadas dos mesmos tecidos com uma mistura de ácido clorídrico e ácido tricloroacético (conforme a descrição original do método) ou ácido clorídrico sozinho. Observou-se correlação muito alta (r = 0,999, p < 0,0001, Figura 1C), mostrando que o ácido tricloroacético pode ser omitido da digestão ácida.
Os resultados representativos incluídos abaixo foram obtidos por meio da medição da absorção de amostras em placas de 96 poços.
Medição dos níveis de ferro não heme de tecido em um modelo de rato de hemocromatose genética
Usando o ensaio colorimétrico à base de batiphenantrolina, o teor de ferro não heme foi determinado em vários tecidos (fígado, baço, coração e pâncreas) da cepa de camundongos comumente usado C57BL/6 e de camundongos de hepcidina (Hamp1-/-) (em um fundo genético C57BL/6). Os níveis representativos de ferro são retratados na Figura 2. A hepcidina é um regulador chave do metabolismo do ferro e sua interrupção leva a um fenótipo de deposição de ferro semelhante à hemocromatose, com acúmulo severo de hepático, pancreático e de ferro cardíaco, e esgotamento do ferro esplendonico8.
Medição dos níveis de ferro não-heme no fígado de robalo após modulação experimental de ferro
Utilizando o ensaio colorimétrico à base de batitalantelina, os níveis de ferro não heme foram determinados no fígado de saudável (controle), tratados com ferro (2 mg de dextran de ferro administrados através da rota intraperitoneal) e anêmicos (2% v/w de sangue extraído dos vasos caudais) robalo europeu (Dicentrarchus labrax). Como esperado, os níveis de ferro hepático aumentaram maciçamente em animais tratados com ferro, enquanto a anemia causou uma leve redução nas lojas de ferro hepático (Figura 3).
Medição de níveis de ferro não heme em toda drosophila melanogaster
Embora o método atual não seja apropriado para medir os níveis de ferro não heme em moscas drosophila individuais devido à sua pequena massa corporal (peso médio de 0,6 mgs e 0,8 mg para machos e fêmeas, respectivamente)9, pode ser usado com sucesso com moscas agrupadas. A Figura 4 retrata níveis representativos de ferro não-heme para grupos de 20 moscas machos inteiras, ou oregon-r ou malvolio (Mvl). Mvl é o homólogo do gene mamífero SLC11A2, que codifica uma proteína chamada transporte metálico divalent 1 (DMT1), e sua interrupção genética leva à deficiência de ferro10. Como esperado, as moscas Mlv apresentaram um teor substancialmente inferior de ferro não-heme do corpo em comparação com o tipo selvagem.
| Potência 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Pressão (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tempo (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tempo de pressão (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| VENTILADOR: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabela 1: Parâmetros operacionais para secagem hepática em um forno de digestão de micro-ondas utilizado aqui.
| WCR (μL) | Mistura de ácido (μL) | Supernatante (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volume total (μL) | ||
| Tubos de 1,5 mL | Ácido em branco | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Padrão | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Amostra | 1000 | Variável | Variável | 1300 | |||
| Microplato de 96 poços | Ácido em branco | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Padrão | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Amostra | 150 | Variável | Variável | 195 |
Tabela 2: Preparação de reações cromosgenas em tubos de 1,5 mL ou placas de 96 poços.
Figura 1: Determinação de ferro não-heme pelos ensaios colorimétricos à base de cuvette ou 96 poços de microplaca. (A) curvas padrão para ensaios padrão microplaca-(quadrados abertos
) e à base de cuvette (triângulos abertos Δ). (B) Correlação entre os níveis de ferro não-heme à base de cuvette e microplaca em 55 amostras de tecido de camundongos C57BL/6 machos de 6 meses de idade, incluindo fígado (círculos sólidos
), baço (círculos abertos
), coração (triângulos sólidos
), pulmão (asteriscos
) e medula óssea (diamantes
). (C) níveis de ferro não heme em um subconjunto de tecidos de camundongos machos de 6 meses de idade (fígado, círculos sólidos ; baço, círculos abertos ) medidos com o ensaio à base de microplaca de 96 poços após digestão ácida de amostras com uma mistura de ácido clorídrico e ácido tricloroacético (HCl + C2HCl3O2) ou ácido clorídrico sozinho (HCl). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Teor de ferro não heme determinado em vários tecidos por assitométrico à base de banho-phenanthrolina. Níveis de ferro não heme no fígado, baço, coração e pâncreas de camundongos machos C57BL/6 do tipo selvagem (círculos abertos ) e camundongos machos com deficiência de hepcidina Hamp1/- camundongos em fundo genético C57BL/6 (quadrados abertos ) com a idade de 8 semanas, medido com o ensaio colorimétrico à base de banho-de-linha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Níveis de ferro não heme hepáticos em robalo europeu feminino juvenil após modulação experimental de ferro. A sobrecarga de ferro foi obtida pela administração intraperitoneal de 2 mg de dextran de ferro, enquanto a anemia foi induzida pela retirada de 2% v/w de sangue dos vasos caudais. Os fígados foram coletados 4 dias após tratamento de ferro ou coleta de sangue. Os animais de controle eram saudáveis, baixos marinhos não tratados. Os níveis de ferro não heme foram medidos com o ensaio colorimétrico à base de batiofeno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Níveis de ferro não heme em Drosophila de 1 mês de idade, medido com o ensaio colorimétrico à base de batiphenanthrolina. Os resultados mostram (A) o teor de ferro não heme em cada pool de 20 moscas ou (B) o teor de ferro estimado de cada mosca individual, considerando um peso médio de 0,64 mg/mosca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um protocolo para a medição do teor de ferro não-heme em tecidos animais é fornecido, utilizando uma adaptação do ensaio colorimétrico à base de banho-phenrodina originalmente descrito por Torrance e Bothwell5,6. As etapas críticas do método são a secagem da amostra de tecido; desnaturação proteica e liberação de ferro inorgânico por hidrólise ácida; redução do ferro férrico (Fe3+) ao estado ferroso (Fe2+) na presença do agente redutor do ácido tioglicólico, e sua reação com um reagente de batiofenoanthrolina (reação cromogênica); leitura de absorvância do complexo rosa ferroso/batifenanthrolina resultante; e cálculo do teor de ferro de tecido.
O presente trabalho mostra como o protocolo original baseado em cuvette pode ser adaptado a um formato baseado em 96 bem baseado para maior rendimento, sem comprometer a sensibilidade do ensaio. Notavelmente, esta adaptação permite uma economia considerável de tempo, uma vez que: 1) um maior número de reações cromógenas pode ser preparado simultaneamente em placas de 96 poços com o uso de pipetas multicanais; e 2) as leituras de absorvência são dramaticamente mais rápidas em um leitor de placas do que quando se usa um espectrômetro. Outra vantagem importante do ensaio à base de microplacos é o ajuste dos volumes de reação cromogen, o que reduz substancialmente os custos com reagentes (em particular com o reagente de batifetaminina). Todo o protocolo pode ser concluído em 4 dias. A secagem da amostra (que pode levar até 48 h quando realizada em um forno a 65 °C) e a digestão ácida (que é convenientemente realizada durante a noite por 20 h) são as duas etapas mais demoradas. A secagem da amostra pode ser acelerada usando um forno de digestão de micro-ondas projetado para uso laboratorial na digestão, dissolução, hidrolise ou secagem de uma ampla gama de materiais. Como é possível secar a maioria das amostras de tecido em menos de 2,5 h, pode-se realizar todo o protocolo em apenas 2 dias. No entanto, como a capacidade de um micro-ondas é limitada ao número de copos de teflon que ele pode caber, e como os copos precisam de lavagem e descontaminação após cada uso, os usuários podem achar mais conveniente secar amostras em placas de 24 poços a 65 °C ao manusear um alto número de amostras. O tempo necessário para secar os tecidos ainda pode ser reduzido usando temperaturas acima de 65 °C; no entanto, o material plástico deve ser evitado devido ao risco de derretimento.
Anteriormente, Grundy et al.11 haviam desenvolvido uma adaptação do método no qual todo o ensaio é realizado em placas de 96 poços, sem incluir uma etapa de secagem amostral. No entanto, a medição de metais em tecidos usando peso úmido em vez de peso seco é significativamente afetada pela quantidade variável de perda de peso através da secagem do ar tanto em amostras de tecido fresco quanto em congelados12. Por isso, recomenda-se normalizar o teor de ferro contra o peso seco do tecido. Se a secagem tecidual não for uma opção viável (por exemplo, tecido adiposo), sugere-se que o ensaio seja realizado prontamente após a coleta de amostras, de modo que a determinação precisa do peso fresco não seja significativamente afetada por artefatos de armazenamento.
A composição da solução ácida também foi abordada. De acordo com o protocolo original5,6, os tecidos são digeridos com uma mistura de ácido consistindo de ácido clorídrico e ácido tricloroacético. No entanto, o presente trabalho demonstra que 37% do ácido clorídrico sozinho é igualmente eficiente, pelo menos para digerir amostras de fígado e baço.
A solução padrão de ferro de estoque é preparada usando pó de ferro carbonyl, que é um pó de ferro barato e altamente puro. Após a abordagem aqui descrita, foi preparada uma solução padrão de ferro de estoque contendo 1,1169 mg de Fe/mL (20 mM), conforme posteriormente determinado pela AAS. Outras fontes de ferro (por exemplo, sulfato de ferro, nitrilotriacetato de ferro) ou soluções padrão comerciais podem ser usadas para gerar a solução padrão de ferro de estoque, desde que a concentração real de ferro seja determinada, e a linearidade do ensaio seja confirmada pela realização de uma curva padrão.
Usando o método atual, o teor de ferro não heme de uma variedade de tecidos animais foi medido com sucesso. Resultados representativos obtidos com tecidos de roedores (fígado, baço, coração e pâncreas), fígado de robalo e drosophila inteiro estão incluídos. O método não requer ferramentas analíticas sofisticadas ou infraestrutura cara, podendo, assim, ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios. Em resumo, o método aqui descrito pode ser amplamente aplicado em estudos de homeostase de ferro e distúrbios relacionados ao ferro que empregam modelos animais experimentais de sobrecarga ou deficiência de ferro.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Fundos Nacionais por meio da FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., no âmbito do projeto UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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