Summary
Här tillhandahålls ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader, med hjälp av en enkel, väletablerad kolorimetrisk analys som enkelt kan implementeras i de flesta laboratorier.
Abstract
Järn är ett viktigt mikronäringsmannat. Både järnöverbelastning och brist är mycket skadliga för människor, och vävnadsjärnnivåerna är fint reglerade. Användningen av experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist har varit avgörande för att öka kunskapen om de mekanismer som är involverade i systemisk och cellulär reglering av järnhomeostas. Mätningen av totala järnnivåer i djurvävnader utförs vanligen med atomabsorptionsspektroskopi eller med en kolorimetrisk analys baserad på reaktionen av icke-heme järn med ett bathophenanthroline reagens. Under många år har kolorimetrisk analys använts för mätning av icke-heme järnhalten i ett brett spektrum av djurvävnader. Till skillnad från atomabsorptionsspektroskopi utesluter det bidraget från heme järn som härrör från hemoglobin som finns i röda blodkroppar. Dessutom kräver det inte sofistikerade analytiska färdigheter eller mycket dyr utrustning, och kan därför enkelt implementeras i de flesta laboratorier. Slutligen kan den kolorimetriska analysen antingen vara cuvette-baserad eller anpassad till ett mikroplate-format, vilket möjliggör högre provgenomströmning. Det nuvarande arbetet ger ett väletablerat protokoll som lämpar sig för detektion av förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller järnbrist.
Introduction
Järn är ett viktigt mikronäringsmannat som krävs för funktionen hos proteiner som är involverade i viktiga biologiska processer som syretransport, energiproduktion eller DNA-syntes. Viktigt är att både järnöverskott och järnbrist är mycket skadliga för människors hälsa, och vävnadsjärnnivåerna är fint reglerade. Onormal järnabsorption via kosten, järnbrist, upprepade blodtransfusioner och kronisk inflammation är vanliga orsaker till järnrelaterade sjukdomar som påverkar miljarder människor över hela världen1,2,3.
Experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist har varit avgörande för att öka vår kunskap om de mekanismer som är involverade i systemisk och cellulär reglering av järnhomeostas4. Trots de betydande framsteg som gjorts under de senaste två decennierna är många viktiga aspekter fortfarande svårfångade. Under de kommande åren kommer den exakta mätningen av totala järnnivåer i djurvävnader att förbli ett kritiskt steg för att främja forskningen inom järnbiologiområdet.
De flesta laboratorier kvantifierar vävnadsjärn med antingen atomabsorptionsspektroskopi (AAS), induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS) eller en kolorimetrisk analys baserad på reaktionen av icke-heme järn med en bathophenanthroline reagens. Den senare är baserad på den ursprungliga metoden som beskrevs av Torrance och Bothwell för över 50 år sedan5,6. Medan en variation av denna metod senare utvecklades med ferrozin som ett alternativ till bathophenanthroline7, den senare är fortfarande den mest citerade chromogenic reagens i litteraturen.
Valmetoden beror ofta på tillgänglig expertis och infrastruktur. Medan AAS och ICP-MS är känsligare, är den kolorimetriska analysen fortfarande allmänt använd eftersom den ger följande viktiga fördelar: i) det utesluter bidraget från heme järn som härrör från hemoglobin som finns i röda blodkroppar; ii) Det kräver inte sofistikerade analytiska färdigheter eller mycket dyr utrustning. iii) Den ursprungliga cuvettebaserade analysen kan anpassas till ett mikroplattaformat, vilket möjliggör högre provgenomströmning. Det kolorimetriska tillvägagångssätt som presenteras i detta arbete används rutinmässigt för att kvantifiera förändringar i vävnadsjärnnivåer i en mängd olika experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller järnbrist, från gnagare till fisk och fruktfluga. Här tillhandahålls ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader, med hjälp av en enkel, väletablerad, kolorimetrisk analys som de flesta laboratorier bör hitta lätt att genomföra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 möss köptes kommersiellt och hepcidin-null (Hamp1−/−) möss på en C57BL/6 bakgrund8 var en snäll gåva från Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrike). Djur hölls på i3S djuranläggning under specifika patogenfria förhållanden, i en temperatur- och ljuskontrollerad miljö, med fri tillgång till standard gnagare chow och vatten. Europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax) köptes från en kommersiell fiskodling och inhystes på ICBAS djuranläggning, i en temperatur- och ljusstyrd miljö, och matades dagligen ad libitum med standardfoder av havsabborre. Alla försök som omfattade ryggradsdjur godkändes av i3S djuriska kommitté och den nationella myndigheten Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Information om kommersiella reagenser, utrustning och djur finns i tabellen över material.
1. Lösningsberedning
OBS: Hantera och förbered alla reagenser och lösningar med järnfritt glas eller engångsartiklar av plast. Låt inte metalliska laboratoriematerial (t.ex. spatlar av rostfritt stål) komma i kontakt med reagens eller lösning på grund av risken för järnförorening. Se till att alla återanvändbara glas är järnfria. Tvätta materialen med lämpligt laboratorierengöringsmedel i 30-60 min, skölj med avjoniserat vatten, blötlägg över natten i en 37% salpetersyralösning utspädd 1:3 med avjoniserat vatten, skölj igen med avjoniserat vatten och låt torka.
- Syrablandning: Tillsätt 10 g trikloreättiksyra till 82,2 ml 37 % saltsyra i en glasflaska, lös noggrant upp den slutliga volymen till 100 ml med avjoniserat vatten. Skaka före användning. Alternativt, använd endast 37% saltsyra för vävnadsrötning.
OBS: Lösningen är stabil i minst 2 månader när den förvaras i mörkbruna reagensflaskor i glas.
VARNING: Saltsyra och trikloreättiksyra är frätande och koncentrerade former frigör giftiga sura ångor. Använd skyddskläder, kemikaliebeständiga handskar och kemiska stänkglasögon hela tiden vid hantering av syror. Undvik att andas in dem och hantera alltid syror under en rökhuv. - Mättat natriumacetat: Tillsätt 228 g vattenfri natriumacetat till 400 ml avjoniserat vatten i en glasflaska och agitera över natten vid rumstemperatur. Låt lösningen vila och fälla ut för en dag. Om ingen nederbörd uppstår, fortsätt att tillsätta små mängder natriumacetat. Förvara lösningen i en glasflaska.
- Kromogenreagens: Tillsätt 1 mg 4,7-difenyl-1,10-fenantrolindisulfonsyradisodiumsalt till 500 μL avjoniserat vatten och 10 μL koncentrerad (100%) tiooglykolsyra och lös noggrant upp den. Gör upp den slutliga volymen till 1 ml med avjoniserat vatten.
OBS: Förbered så mycket kromogenreagens som behövs. Lösningen är stabil i 1 månad när den är skyddad mot ljus. - Fungerande kromogenreagens (WCR): Tillsätt 1 volym kromogenreagens till 5 volymer mättat natriumacetat och 5 volymer avjoniserat vatten.
OBS: Denna lösning bör beredas på nytt på användningsdagen. - Stamjärn standardlösning: För att förbereda en 20 mM stamjärnlösning, placera 111,5 mg kolyljärnpulver i en 250 ml mätkolv som innehåller 5 480 μL 37% saltsyra. Låt lösa upp över natten vid rumstemperatur (eller inkubera i ett kokande vattenbad). Gör sedan lösningen till en slutlig volym på 100 ml med avjoniserat vatten.
OBS: Standardlösningen kan förvaras på obestämd tid när den förvaras i ett tätt förseglat kärl. - Fungerande järnstandardlösning (WISS): Tillsätt 13,5 μL 37% saltsyra till 500 μL avjoniserat vatten. Tillsätt 10 μL av stockjärnstandardlösningen och fyll den slutliga volymen till 1 ml med avjoniserat vatten (11.169 μg Fe/mL, 200 μM; mätt med AAS).
OBS: Arbetslösningen bör beredas på nytt på användningsdagen.
2. Provtorkning
- Skär ett prov av vävnad som väger 10-100 mg med ett skalpellblad. Väg den noggrant i en analytisk/precisionsbalans över en liten bit parafilm (Fresh Weight).
- Använd plast pincett, placera vävnaden i en 24-välplatta (olidlig för att möjliggöra vattenavdunstning) och låt den torka på en standardinkubator vid 65 °C i 48 timmar.
- Alternativt kan du använda en laboratorie mikrovågsugn matsmältningsugn för torkning av vävnadsprover. Använd plast pincett, placera den vägda vävnaden i en järnfri Teflon kopp och torka den i mikrovågsugnen. Ställ in driftsparametrarna enligt instrumentets bruksanvisning.
OBS: Som referens visas driftsparametrar för torkning av leverprover med hjälp av den specifika rötningsugnen (se Tabell över material) i tabell 1. - Använd plasttwecett, placera varje torkad bit vävnad över en liten bit parafilm inuti en analytisk / precisionsbalans och väg den noggrant (Torrvikt).
3. Prova sur matsmältning
- Använd pincett av plast och överför varje torkad bit vävnad till ett 1,5 mL mikrocentrifugerör.
- Tillsätt 1 ml syrablandningen och stäng mikrocentrifugeröret. Förbered en syra tom på samma sätt, förutom att vävnaden utelämnas.
VARNING: Syrablandningen är frätande och släpper ut giftiga ångor. Använd skyddskläder, kemikaliebeständiga handskar och kemiska stänkglasögon vid hantering av syrablandningen. Undvik att andas in den och hantera den alltid under en rökhuv. - Smält vävnaderna genom att inkubera mikrocentrifugerören i en inkubator vid 65 °C i 20 timmar.
- Efter kylning till rumstemperatur överför du 500 μL av det klara (gula) syraextraktet (supernatant) till ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör med en mikropipette utrustad med plastspetsar. Om det inte är möjligt att få en klar supernatant, utför en kort centrifugeringsspinn.
VARNING: Supernatanten är mycket sur. Använd skyddskläder, kemikaliebeständiga handskar och kemiska stänkglasögon vid hantering av supernatanter. Hantera dem alltid under en rökhuv.
OBS: Vid denna tidpunkt kan syraextrakten omedelbart användas för den kolorimetriska analysen eller frysas vid -20 °C för senare användning. Tina helt frysta prover till rumstemperatur och virvla dem före användning.
4. Färgutveckling
- Förbered kromogenreaktioner enligt tabell 2 i 1,5 ml mikrocentrifugerör eller, för högre genomströmning, direkt i den plana botten, 96-väl, klara, obehandlade polystyrenmikroplattor. Förbered alla reaktioner (syrat blind, standard och prov) åtminstone i duplikat.
- Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
5. Absorbansavläsning
- Mät provabsorbenten i en spektrofotometer eller plattläsare vid en våglängd på 535 nm mot en avjoniserad vattenreferens. Plattor kan avläsas utan glid eller lock. I det lockade höljet, ta bort eventuell kondens som bildas på grund av utsläpp av sura ångor från locket strax före mätningen för att undvika eventuella störningar i absorbansavläsningen.
OBS: Den optiska absorbansen av den sura tomma avläsningen mot avjoniserat vatten (referens) bör vara mindre än 0,015. Standardens optiska absorbans och proverna skall vara mellan 0,100 och 1 000. För prover med mycket hög eller mycket låg järnhalt kan volymerna surextrakt (supernatant) och diH2O behöva justeras (tabell 2): Om absorbansen är större än 1,0, använd en mindre provvolym (supernatant). När absorbansen är lägre än 0,1, använd en högre volym av supernatanten. Provvolym (Vsmp) beaktas vid beräkning av varje provs vävnadsjärnhalt (se steg 6).
6. Beräkning av innehållet i vävnadsjärn
- Beräkna icke-heme vävnad järn innehåll med följande ekvation:
Vävnadsjärn (μg/g torrvävnad) =
AT = provprovets absorbans
AB = absorbans av surt blankt
AS = absorbans av standard
Fes = järnkoncentration av WISS (μg Fe/mL)
W = torrvävnadens vikt (g)
Vsmp = provvolym (variabel volym av supernatant i tabell 2 konverterad till ml)
Vf = slutlig volym syrablandning efter inkubation över natten vid 65 °C (motsvarande syravolym plus torrvävnadsvolym i ml; om provvikterna inte skiljer sig avsevärt, anta en konstant volym ≈ 1 ml)
Vstd = standardvolym för järn (volym wiss i tabell 2 konverterad till ml)
Vrv = slutlig reaktionsvolym (Total volym i tabell 2 konverterad till ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuvette kontra 96-brunns mikroplatta jämförelse
Mätningen av vävnads icke-heme järn genom reaktion med en bathophenanthroline reagens ursprungligen beskrivs av Torrance och Bothwell5,6 bygger på användning av en spektrofotometer för absorbansavläsning. Därför är de volymer som används i kromogenreaktionen kompatibla med storleken på en vanlig spektrofotometer cuvette. Detta arbete beskriver en metod anpassning där kromogen reaktionerna framställs direkt i en 96-brunn mikroplatta för absorbans mätning i en microplate läsare, kräver mindre reagens volymer och tillåter högre genomströmning.
För att jämföra känsligheten hos båda metoderna förbereddes ursprungligen en seriell utspädning av arbetsjärnstandardlösningen (WISS) och kromogenreaktionerna monterades antingen i 1,5 ml-rör eller i 96-brunnsplattor, som anges i tabell 2. Absorbansen mättes i en spektrofotometer (med cuvette) respektive i en mikroplatta läsare. Representativa standardkurvor som genereras med de två tillvägagångssätten visas i figur 1A. I båda fallen var linjäriteten mycket hög (r2 = 0, 9996 och r2 = 0, 9997 för mikroplatta respektive cuvette) över de testade järnkoncentrationerna.
Anmärkningsvärt, en WISS som innehåller 11.169 μg Fe/mL användes. Dessa data visar att lägre järnkoncentrationer kan användas för att förbereda standarden. Användning av en WISS med högre järnkoncentrationer rekommenderas dock inte, eftersom detta kan leda till absorbansvärden som överskrider spektrofotometerns linjära dynamiska detekteringsområde, vilket gör att standardkurvorna platå.
För att ytterligare jämföra cuvette- och mikroplatebaserade analyser mättes icke-heme järnhalten i totalt 55 musvävnadsprover (lever, mjälte, hjärta, lunga, benmärg). En mycket hög grad av korrelation observerades mellan de två metoderna (r = 0, 999, s < 0,0001), vilket tyder på att den mikroplatebaserade metoden är ett giltigt alternativ till den ursprungliga cuvettebaserade metoden (figur 1B).
Slutligen kvantifierades icke-heme järnnivåer i musvävnader med den mikroplatebaserade metoden efter sur rötning av prover som härrör från samma vävnader med antingen en blandning av saltsyra och trikloritetiksyra (enligt den ursprungliga metodbeskrivningen) eller saltsyra ensam. En mycket hög korrelation observerades (r = 0,999, p < 0,0001, figur 1C), vilket visar att trikloreättisk syra kan utelämnas från syrarötet.
De representativa resultaten nedan erhölls genom mätning av provabsorbering i 96-brunnsplattor.
Mätning av vävnadsjärnnivåer utan hem i en musmodell av genetisk hemokromatos
Med hjälp av bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys fastställdes icke-heme järn innehåll i olika vävnader (lever, mjälte, hjärta och bukspottkörtel) från den vanliga musstammen C57BL/6 och från hepcidin knockout (Hamp1-/-) möss (i en C57BL/6 genetisk bakgrund). Representativa järnnivåer visas i figur 2. Hepcidin är en viktig regulator av järnmetabolism och dess störningar leder till en hemochromatosis-liknande järn deposition fenotyp, med allvarliga lever, bukspottskörteln och hjärt järn ackumulering och splenic järn utarmning8.
Mätning av icke-heme järnnivåer i havsabborre efter experimentell järnmodulering
Med hjälp av bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys fastställdes icke-heme järnnivåer i levern av friska (kontroll), järnbehandlade (2 mg järn dextran administreras via intraperitoneal väg) och anemiska (2% v/w blod som dras från de kaudala fartygen) europeisk havsabborre (Dicentrarchus labrax). Som förväntat ökade leverjärnnivåerna kraftigt hos järnbehandlade djur, medan anemi orsakade en mild minskning av leverjärnlagren (figur 3).
Mätning av icke-heme järnnivåer i hela Drosophila melanogaster
Även om den nuvarande metoden inte är lämplig för att mäta icke-heme järnnivåer i enskilda Drosophila flugor på grund av deras lilla kroppsmassa (genomsnittlig vikt är 0,6 mg respektive 0,8 mg för män och kvinnor,9, det kan framgångsrikt användas med poolade flugor. Figur 4 visar representativa icke-heme järnnivåer för grupper av 20 hela hanflugor, antingen vilda Oregon-R eller Malvolio (Mvl) knockout. Mvl är homologen av däggdjursSLC11A2-genen, som kodar för ett protein som kallas divalent metalltransportör 1 (DMT1), och dess genetiska störning leder till järnbrist10. Som förväntat presenterade Mlv flies en väsentligt lägre kropp icke-heme järnhalt jämfört med vild typ.
| Effekt 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Tryck (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tid (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tid vid tryck (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| FLÄKT: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabell 1: Driftsparametrar för levertorkning i en mikrovågsugn som används här.
| WCR (μL) | Syrablandning (μL) | Supernatant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Total volym (μL) | ||
| 1,5 ml rör | Syra Tom | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Standard | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Prov | 1000 | Variabel | Variabel | 1300 | |||
| 96-brunns mikroplatta | Syra Tom | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Standard | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Prov | 150 | Variabel | Variabel | 195 |
Tabell 2: Beredning av kromogenreaktioner i antingen 1,5 ml-rör eller 96-brunnsplattor.
Figur 1: Bestämning av icke-hemejärn med hjälp av cuvette- eller 96-brunns mikroplatebaserade kolorimetriska analyser.
B) Korrelation mellan cuvettebaserade och mikroplattabaserade icke-heme järnnivåer i 55 vävnadsprover från 6 månader gamla hane C57BL/6 möss, inklusive lever (fasta cirklar
), mjälte (öppna cirklar
), hjärta (fasta trianglar
), lunga (asterisker
) och benmärg (diamanter
). C) Icke-heme järnnivåer i en delmängd av vävnader från 6 månader gamla hanmöss (lever, fasta cirklar, mjälte, öppna cirklar) mätt med 96-brunns mikroplattabaserad analys efter sur nedbrytning av prover med en blandning av saltsyra och trikloreättiksyra (HCl + C2HCl3O2) eller saltsyra ensam (HCl). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Icke-heme järnhalt bestäms i olika vävnader genom bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys. Icke-heme järnnivåer i lever, mjälte, hjärta och bukspottkörtel hos manliga C57BL/6 vilda möss (öppna cirklar ) och hane hepcidin-bristfällig Hamp1-/- möss på C57BL/6 genetisk bakgrund (öppna rutor) vid 8 veckors ålder, mätt med bathophenanthroline-baserade colorimetric assay. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Leverjärnnivåer i ung kvinnlig europeisk havsabborre efter experimentell järnmodulering. Järn överbelastning uppnåddes genom intraperitoneal administrering av 2 mg järn dextran, medan anemi inducerades genom tillbakadragande av 2% v/w blod från de kaudala kärlen. Lever samlades in 4 dagar efter järnbehandling eller bloduppsamling. Kontrolldjur var friska, obehandlad havsabborre. Icke-heme järn nivåer mättes med bathophenanthroline-baserade kolorimetriska analysen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Icke-heme järnnivåer i 1 månad gamla Drosophila, mätt med bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys. Resultaten visar a) icke-heme järnhalten i varje pool med 20 flugor eller (B) den uppskattade järnhalten i varje enskild fluga, med hänsyn till en genomsnittlig vikt på 0,64 mg/fluga. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett protokoll för mätning av icke-heme järnhalten i djurvävnader tillhandahålls, med hjälp av en anpassning av bathophenanthroline-baserade kolorimetrisk analys som ursprungligen beskrevs av Torrance och Bothwell5,6. De kritiska stegen i metoden är vävnadstorkning; Protein denaturering och frisättning av oorganiskt järn genom syrahydrolys; Reduktion av järn (Fe3+) till järntillståndet (Fe2+) i närvaro av reduktionsmedlet tiooglykolsyra och dess reaktion med ett badofenanthrolinereagens (kromogen reaktion); Absorbansavläsning av det resulterande järnjon/bathophenanthroline rosa komplexet; och beräkning av innehållet i vävnadsjärn.
Det nuvarande arbetet visar hur det ursprungliga cuvette-baserade protokollet kan anpassas till ett 96-välbaserat format för högre genomströmning, utan att kompromissa med analyskänsligheten. Denna anpassning möjliggör betydande tidsbesparing eftersom: 1) ett större antal kromogenreaktioner kan beredas samtidigt i 96-brunnsplattor med användning av flerkanalspipetter; och 2) absorbansavläsningar är dramatiskt snabbare i en plattläsare än vid användning av en spektrofotometer. En annan viktig fördel med den mikroplatebaserade analysen är justeringen av kromogenreaktionsvolymerna, vilket avsevärt minskar kostnaderna med reagenser (särskilt med badophenanthrolinereagens). Hela protokollet kan slutföras om 4 dagar. Provtorkning (som kan ta upp till 48 timmar när den utförs i en ugn vid 65 °C) och sur matsmältning (som bekvämt utförs över natten i 20 timmar) är de två mest tidskrävande stegen. Provtorkning kan påskyndas med hjälp av en mikrovågsugn som är utformad för laboratorieanvändning vid smältning, upplösning, hydrolysering eller torkning av ett brett spektrum av material. Eftersom det är möjligt att torka de flesta vävnadsprover på mindre än 2,5 timmar, kan man utföra hela protokollet på bara 2 dagar. Men eftersom en mikrovågsugns kapacitet är begränsad till antalet teflonkoppar som den kan passa, och eftersom kopparna behöver tvättas och dekontaminering efter varje användning, kan användarna finna det bekvämare att torka prover i 24-brunnsplattor vid 65 °C vid hantering av ett stort antal prover. Den tid som krävs för att torka vävnaderna kan fortfarande minskas genom att använda temperaturer över 65 °C. Plastmaterial måste dock undvikas på grund av risken för smältning.
Tidigare hade Grundy et al.11 utvecklat en anpassning av metoden där hela analysen utförs i 96 brunnsplattor, utan att inkludera ett provtorkningssteg. Mätningen av metaller i vävnader med våtvikt i stället för torrvikt påverkas dock avsevärt av den varierande mängden viktminskning genom lufttorkning både i färska och i frysta vävnadsprover12. Därför rekommenderas att normalisera järnhalten mot vävnadens torrvikt. Om vävnadstorkning inte är ett genomförbart alternativ (t.ex. fettvävnad) föreslås att analysen utförs omedelbart vid provtagningsinsamling, så att korrekt bestämning av den färska vikten inte påverkas väsentligt av lagringsartefakter.
Sammansättningen av syralösningen togs också upp. Enligt det ursprungliga protokollet5,6 smälts vävnader med en syrablandning bestående av saltsyra och trikloritetiksyra. Det aktuella arbetet visar dock att enbart 37% saltsyra är lika effektiv, åtminstone för att smälta lever- och mjälteprover.
Stamjärnstandardlösningen bereds med kolyljärnpulver, som är ett billigt och mycket rent järnpulver. Enligt det tillvägagångssätt som beskrivs häri utarbetades en stamjärnstandardlösning som innehåller 1,1169 mg Fe/mL (20 mM), vilket senare bestämdes av AAS. Andra järnkällor (t.ex. järnsulfat, järnnittrilotakiat) eller kommersiella standardlösningar kan användas för att generera stamjärnstandardlösningen, förutsatt att den faktiska järnkoncentrationen bestäms och analyslinolysalitet bekräftas genom att en standardkurva utförs.
Med den nuvarande metoden mättes icke-heme järnhalten i en mängd olika djurvävnader framgångsrikt. Representativa resultat som erhållits med gnagare vävnader (lever, mjälte, hjärta och bukspottkörtel), havsabborre lever och hela drosophila ingår. Metoden kräver inga sofistikerade analysverktyg eller dyr infrastruktur och kan därför enkelt implementeras i de flesta laboratorier. Sammanfattningsvis kan den metod som beskrivs häri tillämpas i stor utsträckning i studier av järnhomeostas och järnrelaterade störningar som använder experimentella djurmodeller av järnöverbelastning eller brist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av nationella fonder genom FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under projektet UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
