Summary
כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה צבעונית פשוטה ומבוססת היטב שניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות.
Abstract
ברזל הוא מיקרו-תזונה חיונית. הן עומס יתר בברזל והן מחסור מזיקים מאוד לבני אדם, ורמות הברזל של הרקמות מוסדרות היטב. השימוש במודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר או מחסור בברזל היה אינסטרומנטלי לקידום הידע של המנגנונים המעורבים בוויסות המערכתי והתאי של הומאוסטזיס ברזל. המדידה של רמות הברזל הכוללות ברקמות בעלי חיים מבוצעת בדרך כלל עם ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית או עם בדיקה צבעונית המבוססת על התגובה של ברזל שאינו heme עם ריאגנט bathophenanthroline. במשך שנים רבות, הבדיקה הצבעונית שימשה למדידת תכולת הברזל שאינה heme במגוון רחב של רקמות בעלי חיים. שלא כמו ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית, זה לא כולל את התרומה של ברזל heme נגזר המוגלובין הכלול בתאי דם אדומים. יתר על כן, זה לא דורש מיומנויות אנליטיות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד, ולכן ניתן ליישם בקלות ברוב המעבדות. לבסוף, הבדיקה הצבעונית יכולה להיות מבוססת קוביט או מותאמת לתבנית מיקרו-לוחית, המאפשרת תפוקת דגימה גבוהה יותר. העבודה הנוכחית מספקת פרוטוקול מבוסס היטב המתאים לגילוי שינויים ברמות הברזל ברקמות במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר בברזל או מחסור בברזל.
Introduction
ברזל הוא מיקרונוטריאנט חיוני, הנדרש לתפקוד חלבונים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חיוניים כגון הובלת חמצן, ייצור אנרגיה או סינתזת DNA. חשוב לציין, הן עודף ברזל והן מחסור בברזל מזיקים מאוד לבריאות האדם, ורמות הברזל של הרקמות מוסדרות היטב. ספיגת ברזל תזונתית חריגה, דיאטות לקויות ברזל, עירויי דם חוזרים ונשנים ודלקת כרונית הם גורמים נפוצים להפרעות הקשורות לברזל המשפיעות על מיליארדי אנשים ברחבי העולם1,2,3.
מודלים בעלי חיים ניסיוניים של עומס יתר בברזל או מחסור היו אינסטרומנטליים כדי לקדם את הידע שלנו על המנגנונים המעורבים ברגולציה המערכתית והתאית של הומאוסטזיס ברזל4. למרות ההתקדמות המשמעותית שחלה בשני העשורים האחרונים, היבטים מרכזיים רבים נותרו חמקמקים. בשנים הקרובות, המדידה המדויקת של רמות הברזל הכוללות ברקמות בעלי חיים תישאר צעד קריטי לקידום המחקר בתחום הביולוגיה של הברזל.
רוב המעבדות מכמתות ברזל רקמה עם ספקטרוסקופיית ספיגה אטומית (AAS), ספקטרומטר מסה פלזמה מצמידה אינדוקטיבית (ICP-MS), או בדיקה צבעונית המבוססת על התגובה של ברזל שאינו heme עם ריאגנט רחצה-אנתרופתרולין. זה האחרון מבוסס על השיטה המקורית שתוארה על ידי טורנס ובותוול לפני יותר מ -50 שנה. בעוד וריאציה של שיטה זו פותחה לאחר מכן באמצעות פרוזין כחלופה bathophenanthroline7, האחרון נשאר ריאגנט הכרומוגני הנפוץ ביותר בספרות.
שיטת הבחירה תלויה לעתים קרובות במומחיות ובתשתית הזמינה. בעוד AAS ו- ICP-MS רגישים יותר, הבדיקה הצבעונית נשארת בשימוש נרחב מכיוון שהיא מציגה את היתרונות החשובים הבאים: i) היא אינה כוללת את תרומתו של ברזל heme הנגזר מהמוגלובין הכלול בתאי דם אדומים; ii) זה לא דורש מיומנויות אנליטיות מתוחכמות או ציוד יקר מאוד; ו-iii) ניתן להתאים את הבדיקה המקורית המבוססת על קוביט לפורמט מיקרו-לוחית, המאפשר תפוקת מדגם גבוהה יותר. הגישה הצבעונית המוצגת בעבודה זו משמשת באופן שגרתי לכימות שינויים ברמות הברזל של הרקמה שאינה heme במגוון מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של עומס יתר בברזל או מחסור בברזל, מכרסמים לדגים ולעוף פירות. כאן, פרוטוקול למדידת התוכן ברזל שאינו heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות בדיקה פשוטה, מבוססת היטב, צבעונית כי רוב המעבדות צריך למצוא קל ליישם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברי C57BL/6 נרכשו מסחרית ועכברי hepcidin-null (Hamp1−/−) על רקע C57BL/68 היו מתנה חביבה מסופי ולונט (מכון קוצ'ין, צרפת). בעלי חיים שוכנו במתקן לבעלי חיים i3S בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים, בסביבה מבוקרת טמפרטורה ואור, עם גישה חופשית לצ'או ומים מכרסמים סטנדרטיים. בס ים אירופאי (Dicentrarchus labrax) נרכש מחוות דגים מסחרית ושוכנים במתקן החיות של ICBAS, בסביבה מבוקרת טמפרטורה ואור, והאכילו מדי יום ליביטום ad עם הזנת בס ים סטנדרטית. כל ההליכים הנוגעים לבעלי חוליות אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים i3S והרשות הלאומית, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). מידע על ריאגנטים מסחריים, ציוד ובעלי חיים מפורט בטבלת החומרים.
1. הכנת פתרון
הערה: יש לטפל ולהכין את כל הריאגנטים והפתרונות באמצעות כלי זכוכית ללא ברזל או כלי פלסטיק חד פעמיים. אין לאפשר לחומרי מעבדה מתכתיים (למשל, מריות נירוסטה) לבוא במגע עם כל ריאגנט או פתרון, בשל הסיכון לזיהום ברזל. ודא שכל כלי זכוכית לשימוש חוזר הם ללא ברזל. לשטוף את החומרים עם חומר ניקוי מעבדה מתאים במשך 30-60 דקות, לשטוף עם מים deionized, להשרות לילה בתמיסה 37% חומצה חנקתית מדולל 1:3 עם מים deionized, לשטוף שוב עם מים deionized, ולאפשר להתייבש.
- תערובת חומצה: הוסיפו 10 גרם חומצה טריכלורואצטית ל-82.2 מ"ל של 37% חומצה הידרוכלורית בבקבוק זכוכית, התמוססו ביסודיות והתאמו את הנפח הסופי ל-100 מ"ל עם מים שעברו דה-יוניזציה. יש לנער לפני השימוש. לחלופין, יש להשתמש רק ב-37% חומצה הידרוכלורית לעיכול רקמות.
הערה: הפתרון יציב למשך חודשיים לפחות כאשר הוא מאוחסן בבקבוקי ריאגנט מזכוכית חומה כהה.
אזהרה: חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית הן מאכלות, וצורות מרוכזות משחררות אדים חומציים רעילים. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בכל עת בעת טיפול בחומצות. הימנע לנשום אותם ותמיד לטפל בחומצות בזמן מתחת למכסה המנוע אדים. - נתרן אצטט רווי: להוסיף 228 גרם של אצטט נתרן נטול מים ל 400 מ"ל של מים deionized בבקבוק זכוכית להתסיס לילה בטמפרטורת החדר. תן לפתרון לנוח ולזרז ליום אחד. אם לא מתרחשת משקעים, המשך להוסיף כמויות קטנות של נתרן אצטט. אחסנו את התמיסה בבקבוק זכוכית.
- כרומוגן ריאגנט: כדי להכין 1 מ"ל של ריאגנט כרומוגן, להוסיף 1 מ"ג של 4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline חומצה דיסולונית דיסודיום מלח ל 500 μL של מים deionized ו 10 μL של מרוכז (100%) חומצה תיוגליקולית, ולהתמוסס ביסודיות. הפוך את הנפח הסופי ל 1 מ"ל עם מים deionized.
הערה: הכינו כמה ריאגנטים של כרומוגן לפי הצורך. הפתרון יציב למשך חודש אחד כאשר הוא מוגן מפני אור. - ריאגנט כרומוגן עובד (WCR): הוסף נפח אחד של ריאגנט הכרומוגן ל -5 כרכים של נתרן אצטט רווי ו -5 כרכים של מים deionized.
הערה: פתרון זה צריך להיות מוכן טרי ביום השימוש. - פתרון סטנדרטי ברזל מלאי: כדי להכין פתרון ברזל 20m מלאי, למקם 111.5 מ"ג של אבקת ברזל קרבוניל בבקבוק נפח 250 מ"ל המכיל 5,480 μL של 37% חומצה הידרוכלורית. להשאיר להתמוסס לילה בטמפרטורת החדר (או לדגור באמבט מים רותחים). לאחר מכן, לפצות את הפתרון נפח סופי של 100 מ"ל עם מים deionized.
הערה: הפתרון הסטנדרטי יכול להישמר ללא הגבלת זמן כאשר הוא מאוחסן בכלי אטום היטב. - פתרון תקן ברזל עובד (WISS): להוסיף 13.5 μL של 37% חומצה הידרוכלורית ל 500 μL של מים deionized. הוסף 10 μL של פתרון תקן ברזל מלאי ולהרכיב את הנפח הסופי ל 1 מ"ל עם מים deionized (11.169 מיקרוגרם של Fe / mL, 200 μM; נמדד על ידי AAS).
הערה: פתרון העבודה צריך להיות מוכן טרי ביום השימוש.
2. ייבוש מדגם
- חותכים דגימה של רקמה במשקל 10-100 מ"ג עם להב אזמל. שקול אותו במדויק באיזון אנליטי/מדויק על פיסת parafilm קטנה (משקל טרי).
- באמצעות פינצטה מפלסטיק, מניחים את חתיכת הרקמה בצלחת של 24 באר (ללא החלקה כדי לאפשר אידוי מים) ומניחים לה להתייבש על אינקובטור סטנדרטי ב 65 °C (65 °F) עבור 48 שעות.
- לחלופין, יש להשתמש בתנור עיכול מיקרוגל מעבדה לייבוש דגימות רקמות. בעזרת פינצטה מפלסטיק, מניחים את פיסת הרקמה השקולה בכוס טפלון נטולת ברזל ומייבשים אותה במיקרוגל. הגדר את פרמטרי ההפעלה בהתאם למדריך ההוראות של המכשיר.
הערה: כהפניה, פרמטרי הפעלה לייבוש דגימות כבד באמצעות תנור העיכול הספציפי (ראה טבלת חומרים) מוצגים בטבלה 1. - באמצעות פינצטה מפלסטיק, מניחים כל פיסת רקמה מיובשת על פיסת פרפילם קטנה בתוך איזון אנליטי/מדויק ושוקלים אותה במדויק (משקל יבש).
3. דגימת עיכול חומצי
- באמצעות פינצטה מפלסטיק, מעבירים כל פיסת רקמה מיובשת לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
- מוסיפים 1 מ"ל מתערובת החומצה וסוגרים את צינור המיקרוצנטריפוגה. הכן חומצה ריקה באותו אופן, אלא שהרקמה מושמטת.
אזהרה: תערובת החומצה מאכלת ומשחררת אדים רעילים. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בעת טיפול בתערובת החומצה. הימנע לנשום אותו ותמיד להתמודד עם זה בזמן מתחת למכסה המנוע אדים. - לעכל את הרקמות על ידי הדגירה של צינורות microcentrifuge באינקובטור ב 65 °C (65 °F) עבור 20 שעות.
- לאחר קירור לטמפרטורת החדר, להעביר 500 μL של תמצית חומצה ברורה (צהובה) (supernatant) לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל באמצעות micropipette מצויד טיפים מפלסטיק. אם לא ניתן להשיג supernatant ברור, לבצע ספין צנטריפוגה קצרה.
זהירות: הסופר-ננט הוא חומצי מאוד. יש ללבוש בגדי מגן, כפפות עמידות בפני כימיקלים ומשקפי התזה כימיים בעת טיפול בסופר-נתחים. תמיד להתמודד איתם תחת מכסה המנוע אדים.
הערה: בשלב זה, תמציות חומצה ניתן להשתמש באופן מיידי עבור בדיקת צבע או קפוא ב -20 °C (50 °F) לשימוש מאוחר יותר. להפשיר לחלוטין דגימות קפואות לטמפרטורת החדר מערבולת אותם לפני השימוש.
4. פיתוח צבע
- הכן תגובות כרומוגניות כפי שצוין בטבלה 2 בצינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל או, עבור תפוקה גבוהה יותר, ישירות לתוך החלק התחתון השטוח, 96-well, ברור, ברור, מיקרופלסטין פוליסטירן מטופל. הכן את כל התגובות (חומצה ריקה, סטנדרטית ודגימה) לפחות בכפילות.
- יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
5. קריאת ספיגה
- מדוד ספיגת מדגם בספקטרופוטומטר או קורא לוחות באורך גל של 535 ננומטר כנגד הפניה למים שעברו דה-יוניזציה. ניתן לקרוא צלחות ללא החלקה או מכסה. במקרה המכסה, להסיר כל עיבוי שנוצר עקב שחרורו של אדי חומצה מהמכסה רק לפני המדידה, כדי למנוע הפרעה אפשרית עם קריאת הספיגה.
הערה: הספיגה האופטית של חומצה ריקה לקרוא נגד מים deionized (הפניה) צריך להיות פחות מ 0.015; הספיגה האופטית של התקן והדגימות צריכה להיות בין 0.100 ל -1.000. עבור דגימות עם תכולת ברזל גבוהה מאוד או נמוכה מאוד, הנפחים של תמצית חומצה (supernatant) ו diH2O ייתכן שיהיה צורך להתאים (טבלה 2): אם הספיגה גדולה מ 1.0, להשתמש מדגם קטן יותר (supernatant) נפח; כאשר הספיגה נמוכה מ- 0.1, השתמש בנפח גבוה יותר של supernatant. נפח מדגם (VSmp) נלקח בחשבון בעת חישוב תוכן ברזל הרקמה של כל דגימה (ראה שלב 6).
6. חישוב תכולת ברזל רקמות
- חשב תוכן ברזל רקמות שאינו heme עם המשוואה הבאה:
ברזל רקמות (מיקרוגרם / גרם רקמה יבשה) =
AT = ספיגה של מדגם בדיקה
AB = ספיגה של חומצה ריקה
AS = ספיגה של תקן
Fes = ריכוז ברזל של WISS (מיקרוגרם Fe /mL)
W = משקל של רקמה יבשה (g)
Vsmp = נפח מדגם (נפח משתנה של Supernatant בטבלה 2 מומר ל- mL)
Vf = נפח סופי של תערובת חומצה לאחר דגירה לילית ב 65 °C (המקביל נפח חומצה בתוספת נפח רקמות יבשות ב- mL; אם משקלים מדגם אינם שונים באופן משמעותי, להניח נפח קבוע ≈ 1 מ"ל)
Vstd = נפח סטנדרטי מברזל (נפח WISS בטבלה 2 מומר ל- mL)
Vrv = נפח תגובה סופי (נפח כולל בטבלה 2 מומר ל- mL)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קובט לעומת השוואת מיקרו-לוחית של 96 well
המדידה של רקמה שאינה ברזל heme על ידי תגובה עם ריאגנט bathophenanthroline שתואר במקור על ידי טורנס ו Bothwell5,6 מסתמך על השימוש ספקטרופוטומטר לקריאת ספיגה. לפיכך, הנפחים המועסקים בתגובת הכרומוגן תואמים לגודל של קובט ספקטרופוטומטר רגיל. העבודה הנוכחית מתארת הסתגלות לשיטה שבה תגובות הכרומוגן מוכנות ישירות במיקרו-לוחית של 96 באר למדידת ספיגה בקורא מיקרופלט, הדורשת נפחי ריאגנט קטנים יותר ומאפשרת תפוקה גבוהה יותר.
כדי להשוות את הרגישות של שתי הגישות, דילול סדרתי של הפתרון הסטנדרטי ברזל עובד (WISS) הוכן בתחילה, ואת תגובות הכרומוגן הורכבו או צינורות 1.5 מ"ל או בלוחות 96-well, כפי שצוין בטבלה 2. הספיגה נמדדה בספקטרופוטומטר (עם קוביט) או בקורא מיקרופלט, בהתאמה. עקומות סטנדרטיות מייצגות הנוצרות עם שתי הגישות מתוארות באיור 1A. בשני המקרים, הליניאריות הייתה גבוהה מאוד (r2 = 0.9996 ו- r2 = 0.9997 עבור מיקרופלט וקובט, בהתאמה) על פני ריכוזי הברזל שנבדקו.
ראוי לציין, WISS המכיל 11.169 מיקרוגרם של Fe / mL שימש. הנתונים הנוכחיים מראים כי ריכוזי ברזל נמוכים יותר עשויים לשמש להכנת התקן. עם זאת, השימוש ב- WISS עם ריכוזי ברזל גבוהים יותר אינו מומלץ, שכן הדבר עלול להוביל לערכי ספיגה העולים על טווח הזיהוי הדינמי הליניארי של הספקטרופוטומטר, מה שגורם לקימורים סטנדרטיים לרמה.
כדי להשוות עוד יותר את הבדיקות המבוססות על קובט ומיקרופלט, תכולת ברזל שאינה heme נמדדה בסך הכל 55 דגימות רקמת עכבר (כבד, טחול, לב, ריאה, מח עצם). בין שתי המתודולוגיות נצפתה רמה גבוהה מאוד של קורלציה (r = 0.999, p < 0.0001), המציינת שהשיטה מבוססת המיקרו-פלטה היא חלופה חוקית לשיטה המקורית המבוססת על קובט (איור 1B).
לבסוף, רמות ברזל שאינן heme ברקמות העכבר היו כימות עם השיטה המבוססת על microplate לאחר עיכול חומצי של דגימות נגזר מאותן רקמות עם או תערובת של חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית (לפי תיאור השיטה המקורית) או חומצה הידרוכלורית בלבד. נצפתה קורלציה גבוהה מאוד (r = 0.999, p < 0.0001, איור 1C), המראה כי חומצה טריכלורואצטית ניתן להשמיט מעיכול החומצה.
התוצאות הייצוגיות הכלולות להלן התקבלו על ידי מדידת ספיגת מדגם בלוחות של 96 בארות.
מדידת רמות ברזל רקמות שאינן heme במודל עכבר של hemochromatosis גנטי
באמצעות בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline, תוכן ברזל שאינו heme נקבע ברקמות שונות (כבד, טחול, לב, לב, ולבלב) מן זן העכבר הנפוץ C57BL /6 ומן נוקאאוט hepcidin (Hamp1-/-) עכברים (ברקע גנטי C57BL/6). רמות הברזל הייצוגיות מתוארות באיור 2. Hepcidin הוא ויסות מפתח של חילוף החומרים ברזל, ההפרעה שלה מוביל פנוטיפ תצהיר ברזל דמוי hemochromatosis, עם כבד חמור, הצטברות ברזל הלבלב, הלב, דלדול ברזל טחול8.
מדידה של רמות ברזל שאינן heme בכבד בס ים לאחר אפנון ברזל ניסיוני
באמצעות בדיקת צבע המבוססת על bathophenanthroline, רמות ברזל שאינן heme נקבעו בכבד של בריא (שליטה), ברזל מטופלים (2 מ"ג של דקסטרן ברזל מנוהל דרך המסלול התוך-אפריטוני) ו אנמי (2% v / w של דם שנלקח מכלי caudal) בס ים אירופי (Dicentrarchus labrax). כצפוי, רמות הברזל בכבד עלו באופן מאסיבי בבעלי חיים שטופלו בברזל, ואילו אנמיה גרמה לירידה קלה בחנויות הברזל הכבד (איור 3).
מדידה של רמות ברזל שאינן heme ב Melanogaster Drosophila כולו
למרות שהשיטה הנוכחית אינה מתאימה למדוד את רמות הברזל שאינן heme זבובי Drosophila בודדים בשל מסת הגוף הקטנה שלהם (המשקל הממוצע הוא 0.6 מ"ג ו 0.8 מ"ג עבור זכרים ונקבות, בהתאמה)9, זה יכול לשמש בהצלחה עם זבובים משולבים. איור 4 מתאר רמות ברזל מייצגות שאינן חממות עבור קבוצות של 20 זבובים זכרים שלמים, או בנוקאאוט מסוג אורגון-R או מאלבוליו (Mvl). Mvl הוא ההומומולוגיה של הגן SLC11A2 היונקים, המקודד לחלבון הנקרא טרנספורטר מתכת divalent 1 (DMT1), וההפרעה הגנטית שלו מובילה למחסור בברזל10. כצפוי, זבובי Mlv הציגו תכולת ברזל בפלג הגוף התחתון באופן משמעותי בהשוואה לסוג הבר.
| הספק 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| לחץ (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| זמן (דקה): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| זמן בלחץ (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| מאוורר: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
טבלה 1: פרמטרי הפעלה לייבוש כבד בתנור עיכול במיקרוגל המשמש כאן.
| WCR (μL) | תערובת חומצה (μL) | סופר-טבעי (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | נפח כולל (μL) | ||
| 1.5 מ"ל צינורות | חומצה ריקה | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| תקן | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| לדוגמה | 1000 | משתנה | משתנה | 1300 | |||
| 96-well microplate | חומצה ריקה | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| תקן | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| לדוגמה | 150 | משתנה | משתנה | 195 |
טבלה 2: הכנת תגובות כרומוגניות בצינורות 1.5 מ"ל או בלוחות 96-well.
איור 1: קביעת ברזל שאינו heme על-ידי בדיקות צבע מבוססות 96 מיקרו-פלטה. (A) עקומות סטנדרטיות עבור מיקרופלט- (ריבועים 
פתוחים) ובדיקות מבוססות קוביט (משולשים פתוחים Δ). (B) מתאם בין רמות ברזל מבוססות קובט למיקרו-פלטה ב-55 דגימות רקמה מעכברי C57BL/6 זכרים בני 6 חודשים, כולל כבד (עיגולים מוצקים
), טחול (עיגולים 
פתוחים), לב (משולשים מוצקים), ריאה (כוכביות
) ומח עצם (יהלומים
). (C) רמות ברזל שאינן heme בקבוצת משנה של רקמות מעכברים זכרים בני 6 חודשים (כבד, עיגולים מוצקים ; טחול, עיגולים פתוחים ) נמדדות עם בדיקה המבוססת על מיקרופלסטיק 96 היטב לאחר עיכול חומצי חומצי של דגימות עם תערובת של חומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית (HCl + C2HCl3O2) או חומצה הידרוכלורית בלבד (HCl). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תכולת ברזל שאינה heme נקבעת ברקמות שונות על-ידי בדיקת צבע מבוססת רחצה-אנתרופתרין. רמות ברזל ללא heme בכבד, בטחול, בלב ובלבלב של עכברים מסוג C57BL/6 זכרים מסוג C57BL/6 (עיגולים פתוחים) ועכברים זכרים חסרים hepcidin-hamp1-/- עכברים על רקע גנטי C57BL/6 (ריבועים פתוחים) בגיל 8 שבועות, נמדד עם בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: רמות ברזל כבדיות ללא heme בס ים אירופאי נקבה לנוער בעקבות אפנון ברזל ניסיוני. עומס יתר ברזל הושג על ידי ניהול תוך-אפריטוני של 2 מ"ג של דקסטרן ברזל, ואילו אנמיה הושרתה על ידי נסיגה של 2% v / w של דם מכלי caudal. הכבדים נאספו ב 4 ימים לאחר טיפול בברזל או איסוף דם. חיות בקרה היו בס ים בריא ולא מטופל. רמות ברזל שאינן heme נמדדו עם בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: רמות ברזל שאינן heme בדרוסופילה בת חודש, הנמדדות באמצעות בדיקת צבע המבוססת על אמבטיה- אנתרופתולין. התוצאות מראות (A) את תכולת הברזל שאינה heme בכל בריכה של 20 זבובים או (B) את תכולת הברזל המשוערת של כל זבוב בודד, בהתחשב במשקל ממוצע של 0.64 מ"ג / זבוב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול למדידת תכולת הברזל שאינה heme ברקמות בעלי חיים מסופק, באמצעות התאמה של בדיקת צבע מבוססת bathophenanthroline שתואר במקור על ידי טורנס ו Bothwell5,6. השלבים הקריטיים של השיטה הם ייבוש דגימת רקמות; denaturation חלבון ושחרור של ברזל אנאורגני על ידי הידרוליזה חומצה; הפחתה של ברזל ברזל (Fe3 +) למצב ברזלי (Fe2 +) בנוכחות חומצה תיוגליקולית סוכן הפחתת, ואת התגובה שלה עם ריאגנט bathophenanthroline (תגובת כרומוגן); קריאת ספיגה של יון ברזלי וכתוצאה מכך / bathophenanthroline ורוד קומפלקס; וחישוב של תכולת ברזל רקמות.
העבודה הנוכחית מראה כיצד ניתן להתאים את הפרוטוקול המקורי המבוסס על קוביט לפורמט מבוסס 96 היטב לתפוקה גבוהה יותר, מבלי להתפשר על רגישות הבדיקה. ראוי לציין, הסתגלות זו מאפשרת חיסכון ניכר בזמן מאז: 1) מספר גדול יותר של תגובות כרומוגן ניתן להכין בו זמנית בצלחות 96-well עם השימוש פיפטות רב ערוציות; ו-2) קריאות ספיגה מהירות יותר באופן דרמטי בקורא לוחות מאשר בעת שימוש בספקטרופוטומטר. יתרון חשוב נוסף של הבדיקה המבוססת על מיקרופלט הוא התאמת נפחי התגובה הכרומוגנית, אשר מפחיתה באופן משמעותי את העלויות עם ריאגנטים (במיוחד עם ריאגנט bathophenanthroline). הפרוטוקול כולו עשוי להסתיים תוך 4 ימים. ייבוש מדגם (אשר עשוי להימשך עד 48 שעות כאשר מבוצע בתנור ב 65 °C (65 °C (אשר מבוצע בנוחות לילה במשך 20 שעות) הם שני השלבים הגוזלים ביותר זמן רב. ניתן להאיץ את ייבוש הדגם באמצעות תנור עיכול במיקרוגל המיועד לשימוש במעבדה בעיכול, המסה, הידרוליזה או ייבוש של מגוון רחב של חומרים. מכיוון שניתן לייבש את רוב דגימות הרקמות בפחות מ 2.5 שעות, ניתן לבצע את הפרוטוקול כולו תוך יומיים בלבד. עם זאת, מכיוון שהקיבולת של מיקרוגל מוגבלת למספר כוסות הטפלון שהוא יכול להתאים, ומכיוון שכוסות זקוקות לשטיפה וטיהור לאחר כל שימוש, המשתמשים עשויים למצוא את זה נוח יותר לייבוש דגימות בצלחות 24-well ב 65 °C (65 °F) בעת טיפול במספר גבוה של דגימות. הזמן הנדרש כדי לייבש את הרקמות עדיין עשוי להיות מופחת באמצעות טמפרטורות מעל 65 °C (65 °F); עם זאת, יש להימנע מחומר פלסטי בשל הסיכון להמסה.
בעבר, Grundy et al.11 פיתחה התאמה של השיטה שבה הבדיקה כולה מתבצעת בצלחות 96-well, מבלי לכלול שלב ייבוש מדגם. עם זאת, המדידה של מתכות ברקמות באמצעות משקל רטוב במקום משקל יבש מושפע באופן משמעותי על ידי כמות משתנה של ירידה במשקל באמצעות ייבוש אוויר הן בדגימות רקמות טריות קפואות12. לכן, מומלץ לנרמל את תכולת הברזל כנגד משקל יבש רקמה. אם ייבוש רקמות אינו אפשרות מעשית (למשל, רקמת שומן), מומלץ כי הבדיקה מתבצעת מיד על איסוף מדגם, כך שקביעה מדויקת של המשקל הטרי אינה מושפעת באופן משמעותי על ידי חפצי אחסון.
הרכב תמיסת החומצה טופל גם הוא. על פי הפרוטוקול המקורי5,6, רקמות מתעכלות עם תערובת חומצה המורכבת מחומצה הידרוכלורית וחומצה טריכלורואצטית. עם זאת, העבודה הנוכחית מדגימה כי 37% חומצה הידרוכלורית לבדה יעילה באותה מידה, לפחות לעיכול דגימות כבד וטחול.
הפתרון הסטנדרטי ברזל במלאי מוכן באמצעות אבקת ברזל קרבוניל, שהיא אבקת ברזל זולה וטהורה מאוד. בעקבות הגישה המתוארת במסמך זה, פתרון סטנדרטי ברזל מלאי המכיל 1.1169 מ"ג של Fe / mL (20 מ"ל) הוכן, כפי שנקבע לאחר מכן על ידי AAS. מקורות אחרים של ברזל (למשל, ברזל גופרתי, ברזל nitrilotriacetate) או פתרונות סטנדרטיים מסחריים ניתן להשתמש כדי ליצור את הפתרון הסטנדרטי ברזל מלאי, בתנאי ריכוז הברזל בפועל נקבע, ואת ליניאריות הבדיקה מאושרת על ידי ביצוע עקומה סטנדרטית.
בשיטה הנוכחית, תכולת הברזל הלא-heme של מגוון רקמות בעלי חיים נמדדה בהצלחה. תוצאות מייצגות שהושגו עם רקמות מכרסמים (כבד, טחול, לב ולבלב), כבד בס ים, ו drosophila שלם כלולים. השיטה אינה דורשת כלים אנליטיים מתוחכמים או תשתיות יקרות, ולכן ניתן ליישם אותה בקלות ברוב המעבדות. לסיכום, השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת באופן נרחב במחקרים של הומאוסטזיס ברזל והפרעות הקשורות לברזל תוך שימוש במודלים חייתיים ניסיוניים של עומס יתר או מחסור בברזל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי קרנות לאומיות באמצעות FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., תחת הפרויקט UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
