Summary
Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e consolidato che può essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori.
Abstract
Il ferro è un micronutriente essenziale. Sia il sovraccarico di ferro che la carenza sono altamente dannosi per l'uomo e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L'uso di modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro è stato determinante per far progredire la conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell'omeostasi del ferro. La misurazione dei livelli totali di ferro nei tessuti animali viene comunemente eseguita con la spettroscopia di assorbimento atomico o con un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Per molti anni, il saggio colorimetrico è stato utilizzato per la misurazione del contenuto di ferro non eme in una vasta gamma di tessuti animali. A differenza della spettroscopia di assorbimento atomico, esclude il contributo dell'eme ferro derivato dall'emoglobina contenuta nei globuli rossi. Inoltre, non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature molto costose e può quindi essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori. Infine, il test colorimetrico può essere basato su cuvette o adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. Il presente lavoro fornisce un protocollo ben consolidato che è adatto per la rilevazione di alterazioni nei livelli di ferro nei tessuti in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro.
Introduction
Il ferro è un micronutriente essenziale, necessario per la funzione delle proteine coinvolte in processi biologici cruciali come il trasporto di ossigeno, la produzione di energia o la sintesi del DNA. È importante sottolineare che sia l'eccesso di ferro che la carenza di ferro sono altamente dannosi per la salute umana e i livelli di ferro nei tessuti sono finemente regolati. L'assorbimento anormale del ferro nella dieta, le diete carenti di ferro, le ripetute trasfusioni di sangue e l'infiammazione cronica sono cause comuni di disturbi associati al ferro che colpiscono miliardi di persone in tutto il mondo1,2,3.
Modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro sono stati strumentali per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi coinvolti nella regolazione sistemica e cellulare dell'omeostasi del ferro4. Nonostante i sostanziali progressi compiuti negli ultimi due decenni, molti aspetti chiave rimangono sfuggenti. Nei prossimi anni, la misurazione accurata dei livelli totali di ferro nei tessuti animali rimarrà un passo fondamentale per far progredire la ricerca nel campo della biologia del ferro.
La maggior parte dei laboratori quantifica il ferro tissutale con la spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS) o un saggio colorimetrico basato sulla reazione del ferro non eme con un reagente batofenantrolina. Quest'ultimo si basa sul metodo originale descritto da Torrance e Bothwell oltre 50 anni fa5,6. Mentre una variante di questo metodo è stata successivamente sviluppata utilizzando la ferrozina come alternativa alla bathofenantrolina7, quest'ultimo rimane il reagente cromogenico più ampiamente citato in letteratura.
Il metodo di scelta dipende spesso dalle competenze e dall'infrastruttura disponibili. Mentre AAS e ICP-MS sono più sensibili, il saggio colorimetrico rimane ampiamente utilizzato perché presenta i seguenti importanti vantaggi: i) esclude il contributo di ferro eme derivato dall'emoglobina contenuta nei globuli rossi; ii) non richiede sofisticate capacità analitiche o attrezzature altamente costose; e iii) il saggio originale basato su cuvette può essere adattato a un formato a micropiastre, consentendo una maggiore produttività del campione. L'approccio colorimetrico presentato in questo lavoro viene abitualmente utilizzato per quantificare le alterazioni nei livelli di ferro non eme tissutale in una varietà di modelli animali sperimentali di sovraccarico di ferro o carenza di ferro, dai roditori ai pesci e alla mosca della frutta. Qui viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un test colorimetrico semplice e ben consolidato che la maggior parte dei laboratori dovrebbe trovare facile da implementare.
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Protocol
I topi C57BL/6 sono stati acquistati commercialmente e i topi epcidina-null (Hamp1−/−) su uno sfondo C57BL/68 sono stati un gentile regalo di Sophie Vaulont (Institut Cochin, Francia). Gli animali sono stati ospitati presso la struttura per animali i3S in specifiche condizioni prive di agenti patogeni, in un ambiente a temperatura e luce controllata, con libero accesso al chow e all'acqua dei roditori standard. La spigola europea (Dicentrarchus labrax) è stata acquistata da un allevamento ittico commerciale e ospitata presso l'impianto per animali ICBAS, in un ambiente a temperatura e luce controllata, e alimentata quotidianamente ad libitum con mangimi standard per spigole. Tutte le procedure che coinvolgono animali vertebrati sono state approvate dal Comitato etico per gli animali i3S e dall'autorità nazionale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Le informazioni sui reagenti, le attrezzature e gli animali commerciali sono elencate nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione della soluzione
NOTA: Maneggiare e preparare tutti i reagenti e le soluzioni con bicchieri senza ferro o stoviglie usa e getta. Non lasciare che materiali metallici di laboratorio (ad esempio, spatole in acciaio inossidabile) entrino in contatto con qualsiasi reagente o soluzione, a causa del rischio di contaminazione da ferro. Assicurati che qualsiasi bicchiere riutilizzabile sia privo di ferro. Lavare i materiali con apposito detergente di laboratorio per 30-60 min, risciacquare con acqua deionizzata, immergere durante la notte in una soluzione di acido nitrico al 37% diluita 1:3 con acqua deionizzata, risciacquare nuovamente con acqua deionizzata e lasciare asciugare.
- Miscela acida: aggiungere 10 g di acido tricloroacetico a 82,2 ml di acido cloridrico al 37% in una bottiglia di vetro, sciogliere accuratamente e regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Agitare prima dell'uso. In alternativa, utilizzare solo il 37% di acido cloridrico per la digestione dei tessuti.
NOTA: La soluzione è stabile per almeno 2 mesi se conservata in flaconi di reagente di vetro marrone scuro.
ATTENZIONE: l'acido cloridrico e l'acido tricloroacetico sono corrosivi e le forme concentrate rilasciano vapori acidi tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti alle sostanze chimiche e occhiali antispruzzo chimico in ogni momento quando si maneggiano gli acidi. Evitare di respirarli e maneggiare sempre gli acidi sotto una cappa aspirante. - Acetato di sodio saturo: aggiungere 228 g di acetato di sodio anidro a 400 ml di acqua deionizzata in una bottiglia di vetro e agitare durante la notte a temperatura ambiente. Lasciare riposare la soluzione e precipitare per un giorno. Se non si verifica alcuna precipitazione, continuare ad aggiungere piccole quantità di acetato di sodio. Conservare la soluzione in una bottiglia di vetro.
- Reagente cromogeno: Per preparare 1 mL di reagente cromogeno, aggiungere 1 mg di sale disodico acido disolfonico 4,7-difenil-1,10-fenantrolina a 500 μL di acqua deionizzata e 10 μL di acido tioglicolico concentrato (100%) e sciogliere completamente. Portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata.
NOTA: Preparare tutto il reagente cromogeno necessario. La soluzione è stabile per 1 mese se protetta dalla luce. - Reagente cromogeno di lavoro (WCR): aggiungere 1 volume del reagente cromogeno a 5 volumi di acetato di sodio saturo e 5 volumi di acqua deionizzata.
NOTA: Questa soluzione deve essere preparata al momento del consumo. - Soluzione standard di ferro madre: per preparare una soluzione di ferro da 20 mM, posizionare 111,5 mg di polvere di ferro carbonilico in un matraccio tarato da 250 ml contenente 5.480 μL di acido cloridrico al 37%. Lasciare sciogliere durante la notte a temperatura ambiente (o incubare a bagnomaria bollente). Quindi, portare la soluzione a un volume finale di 100 ml con acqua deionizzata.
NOTA: La soluzione standard può essere conservata a tempo indeterminato se conservata in un recipiente ben sigillato. - Working Iron Standard Solution (WISS): aggiungere 13,5 μL di acido cloridrico al 37% a 500 μL di acqua deionizzata. Aggiungere 10 μL della soluzione standard di ferro stock e portare il volume finale a 1 mL con acqua deionizzata (11.169 μg di Fe/mL, 200 μM; misurato da AAS).
NOTA: La soluzione di lavoro deve essere preparata al momento del consumo.
2. Essiccazione del campione
- Tagliare un campione di tessuto del peso di 10-100 mg con una lama di bisturi. Pesarlo accuratamente in una bilancia analitica/di precisione su un piccolo pezzo di parafilm (Fresh Weight).
- Utilizzando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto in una piastra a 24 pozzetti (non scivolata per consentire l'evaporazione dell'acqua) e lasciarlo asciugare su un incubatore standard a 65 °C per 48 ore.
- In alternativa, utilizzare un forno di digestione a microonde da laboratorio per asciugare campioni di tessuto. Usando una pinzetta di plastica, posizionare il pezzo di tessuto pesato in una tazza di Teflon senza ferro e asciugarlo nel microonde. Impostare i parametri operativi in base al manuale di istruzioni dello strumento.
NOTA: Come riferimento, i parametri operativi per l'essiccazione dei campioni di fegato utilizzando il forno di digestione specifico (vedere Tabella dei materiali) sono mostrati nella Tabella 1. - Utilizzando pinzette di plastica, posizionare ogni pezzo di tessuto essiccato su un piccolo pezzo di parafilm all'interno di una bilancia analitica/ di precisione e pesarlo accuratamente (Peso secco).
3. Digestione acida del campione
- Utilizzando pinzette di plastica, trasferire ogni pezzo di tessuto essiccato in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 1 mL della miscela acida e chiudere il tubo del microcentrifuga. Preparare un bianco acido allo stesso modo, tranne per il fatto che il tessuto viene omesso.
ATTENZIONE: La miscela acida è corrosiva e rilascia vapori tossici. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo chimico quando si maneggia la miscela acida. Evita di respirarlo e maneggialo sempre sotto una cappa aspirante. - Digerire i tessuti incubando i tubi microcentrifuga in un incubatore a 65 °C per 20 ore.
- Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, trasferire 500 μL dell'estratto di acido chiaro (giallo) (surnatante) in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando una micropipetta dotata di punte di plastica. Se non è possibile ottenere un surnatante chiaro, eseguire una breve centrifugazione.
ATTENZIONE: Il surnatante è altamente acido. Indossare indumenti protettivi, guanti resistenti agli agenti chimici e occhiali antispruzzo chimico quando si maneggiano i supernatanti. Maneggiateli sempre sotto una cappa aspirante.
NOTA: A questo punto, gli estratti acidi possono essere immediatamente utilizzati per il saggio colorimetrico o congelati a -20 °C per un uso successivo. Scongelare completamente i campioni congelati a temperatura ambiente e vorticarli prima dell'uso.
4. Sviluppo del colore
- Preparare le reazioni cromogene come indicato nella Tabella 2 in tubi microcentrifuga da 1,5 mL o, per una maggiore produttività, direttamente nelle micropiastre di polistirene a fondo piatto, trasparenti e non trattate. Preparare tutte le reazioni (acido bianco, standard e campione) almeno in duplice copia.
- Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
5. Lettura dell'assorbanza
- Misurare l'assorbanza del campione in uno spettrofotometro o in un lettore di piastre a una lunghezza d'onda di 535 nm rispetto a un riferimento d'acqua deionizzato. Le piastre possono essere lette senza fili o con coperchio. Nella custodia con coperchio, rimuovere l'eventuale condensa formatasi a causa del rilascio di vapori acidi dal coperchio poco prima della misurazione per evitare possibili interferenze con la lettura dell'assorbanza.
NOTA: l'assorbanza ottica del bianco acido letto contro l'acqua deionizzata (riferimento) deve essere inferiore a 0,015; l'assorbanza ottica dello standard e dei campioni deve essere compresa tra 0,100 e 1,000. Per i campioni con contenuto di ferro molto elevato o molto basso, potrebbe essere necessario regolare i volumi di estratto acido (surnatante) e diH2O (Tabella 2): se l'assorbanza è superiore a 1,0, utilizzare un volume di campione (surnatante) più piccolo; quando l'assorbanza è inferiore a 0,1, utilizzare un volume maggiore del surnatante. Il volume del campione (Vsmp) viene preso in considerazione quando si calcola il contenuto di ferro tissutale di ciascun campione (vedere il passaggio 6).
6. Calcolo del contenuto di ferro tissutale
- Calcola il contenuto di ferro del tessuto non eme con la seguente equazione:
Ferro tissutale (μg/g di tessuto secco) =
AT = assorbanza del campione di prova
AB = assorbanza del bianco acido
AS = assorbanza dello standard
Fes = concentrazione di ferro di WISS (μg Fe/mL)
W = peso del tessuto secco (g)
Vsmp = volume del campione (volume variabile del surnatante nella Tabella 2 convertito in mL)
Vf = volume finale della miscela acida dopo incubazione notturna a 65 °C (corrispondente al volume acido più il volume del tessuto secco in ml; se il peso del campione non differisce in modo significativo, assumere un volume costante ≈ 1 mL)
Vstd = volume standard di ferro (volume di WISS nella tabella 2 convertito in mL)
Vrv = volume di reazione finale (volume totale nella tabella 2 convertito in mL)
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Representative Results
Confronto tra cuvette e micropiastre a 96 pozzetti
La misurazione del ferro non eme tissutale per reazione con un reagente batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6 si basa sull'uso di uno spettrofotometro per la lettura dell'assorbanza. Quindi, i volumi impiegati nella reazione cromogena sono compatibili con le dimensioni di una normale cuvetta spettrofotometrica. Il presente lavoro descrive un adattamento del metodo in cui le reazioni cromogene sono preparate direttamente in una micropiastra a 96 pozzetti per la misurazione dell'assorbanza in un lettore di micropiastre, richiedendo volumi di reagenti più piccoli e consentendo una maggiore produttività.
Per confrontare la sensibilità di entrambi gli approcci, è stata inizialmente preparata una diluizione seriale della soluzione standard di ferro funzionante (WISS) e le reazioni cromogene sono state assemblate in tubi da 1,5 ml o in piastre a 96 pozzetti, come indicato nella Tabella 2. L'assorbanza è stata misurata in uno spettrofotometro (con cuvetta) o in un lettore di micropiastre, rispettivamente. Le curve standard rappresentative generate con i due approcci sono illustrate nella Figura 1A. In entrambi i casi, la linearità era molto elevata (r2 = 0,9996 e r2 = 0,9997 per micropiastra e cuvetta, rispettivamente) attraverso le concentrazioni di ferro testate.
Degno di nota, è stato utilizzato un WISS contenente 11.169 μg di Fe/mL. I dati attuali mostrano che concentrazioni di ferro più basse possono essere utilizzate per preparare lo standard. Tuttavia, l'uso di un WISS con concentrazioni di ferro più elevate non è raccomandato, in quanto ciò potrebbe portare a valori di assorbanza che superano la gamma dinamica lineare di rilevamento dello spettrofotometro, causando il plateau delle curve standard.
Per confrontare ulteriormente i saggi basati su cuvette e micropiastre, il contenuto di ferro non eme è stato misurato in un totale di 55 campioni di tessuto di topo (fegato, milza, cuore, polmone, midollo osseo). È stato osservato un grado molto elevato di correlazione tra le due metodologie (r = 0,999, p < 0,0001), indicando che il metodo basato su micropiastre è una valida alternativa al metodo originale basato su cuvette (Figura 1B).
Infine, i livelli di ferro non eme nei tessuti di topo sono stati quantificati con il metodo a base di micropiastre dopo digestione acida di campioni derivati dagli stessi tessuti con una miscela di acido cloridrico e acido tricloroacetico (come da descrizione del metodo originale) o acido cloridrico da solo. È stata osservata una correlazione molto elevata (r = 0,999, p < 0,0001, Figura 1C), dimostrando che l'acido tricloroacetico può essere omesso dalla digestione acida.
I risultati rappresentativi inclusi di seguito sono stati ottenuti misurando l'assorbanza del campione in piastre a 96 pozzetti.
Misurazione dei livelli di ferro non eme tissutale in un modello murino di emocromatosi genetica
Utilizzando il test colorimetrico basato sulla bafenantrolina, il contenuto di ferro non eme è stato determinato in vari tessuti (fegato, milza, cuore e pancreas) dal ceppo di topo comunemente usato C57BL / 6 e da topi knockout di epcidina (Hamp1-/-) (in un background genetico C57BL / 6). I livelli rappresentativi di ferro sono rappresentati nella Figura 2. L'epcidina è un regolatore chiave del metabolismo del ferro e la sua interruzione porta a un fenotipo di deposizione di ferro simile all'emocromatosi, con grave accumulo di ferro epatico, pancreatico e cardiaco e deplezione di ferro splenico8.
Misurazione dei livelli di ferro non eme nel fegato di branzino dopo modulazione sperimentale del ferro
Utilizzando il test colorimetrico basato sulla bafenantrolina, sono stati determinati livelli di ferro non eme nel fegato di branzino europeo sano (controllo), trattato con ferro (2 mg di ferro destrano somministrato per via intraperitoneale) e anemico (2% v/p di sangue prelevato dai vasi caudali) (Dicentrarchus labrax). Come previsto, i livelli di ferro epatico sono aumentati in modo massiccio negli animali trattati con ferro, mentre l'anemia ha causato una lieve riduzione delle riserve epatiche di ferro (Figura 3).
Misurazione dei livelli di ferro non eme in Drosophila melanogaster intero
Sebbene il metodo attuale non sia appropriato per misurare i livelli di ferro non eme nelle singole mosche Drosophila a causa della loro piccola massa corporea (il peso medio è di 0,6 mg e 0,8 mg rispettivamente per maschi e femmine)9, può essere utilizzato con successo con mosche in pool. La Figura 4 mostra livelli rappresentativi di ferro non eme per gruppi di 20 mosche maschi intere, sia wild-R che Malvolio (Mvl). Mvl è l'omologo del gene SLC11A2 dei mammiferi, che codifica per una proteina chiamata trasportatore di metalli bivalenti 1 (DMT1), e la sua distruzione genetica porta alla carenza di ferro10. Come previsto, le mosche Mlv presentavano un contenuto di ferro non eme sostanzialmente inferiore rispetto al wild-type.
| Potenza 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Pressione (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tempo (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tempo di pressione (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| VENTILATORE: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabella 1: Parametri operativi per l'essiccazione del fegato in un forno di digestione a microonde utilizzato qui.
| WCR (μL) | Miscela acida (μL) | Surnatante (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Volume totale (μL) | ||
| Tubi da 1,5 mL | Acido blank | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Standard | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Campione | 1000 | Variabile | Variabile | 1300 | |||
| Micropiastra a 96 pozzetti | Acido blank | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Standard | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Campione | 150 | Variabile | Variabile | 195 |
Tabella 2: Preparazione di reazioni cromogene in tubi da 1,5 mL o piastre a 96 pozzetti.
Figura 1: Determinazione del ferro non eme mediante saggi colorimetrici basati su micropiastre a cuvetta o a 96 pozzetti. (A) curve standard per saggi a base di micropiastre 
(quadrati aperti) e a base di cuvette (triangoli aperti Δ). (B) Correlazione tra i livelli di ferro non eme a base di cuvette e micropiastre in 55 campioni di tessuto di topi C57BL/6 maschi di 6 mesi, tra cui fegato (cerchi 
solidi), milza (cerchi 
aperti), cuore (triangoli 
solidi), polmone (asterischi
) e midollo osseo (diamanti
). C) livelli di ferro non eme in un sottogruppo di tessuti di topi maschi di 6 mesi (fegato, cerchi solidi, milza, cerchi aperti) misurati con il saggio a base di micropiastre a 96 pozzetti dopo digestione acida di campioni con una miscela di acido cloridrico e acido tricloroacetico (HCl + C2HCl3O2) o acido cloridrico da solo (HCl). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Contenuto di ferro non eme determinato in vari tessuti mediante saggio colorimetrico basato sulla batofenantrolina. Livelli di ferro non eme nel fegato, nella milza, nel cuore e nel pancreas di topi maschi C57BL/6 wild-type (cerchi aperti) e topi Maschi Conpcidin-carenti di Epcidina su background genetico C57BL/6 (quadrati aperti) all'età di 8 settimane, misurati con il test colorimetrico basato sulla batofenantrolina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Livelli epatici di ferro non eme nella spigola europea femminile giovanile a seguito di modulazione sperimentale del ferro. Il sovraccarico di ferro è stato ottenuto dalla somministrazione intraperitoneale di 2 mg di ferro destrano, mentre l'anemia è stata indotta dal ritiro del 2% v/p di sangue dai vasi caudali. I fegati sono stati raccolti a 4 giorni dopo il trattamento con ferro o la raccolta del sangue. Gli animali di controllo erano spigole sane e non trattate. I livelli di ferro non eme sono stati misurati con il test colorimetrico basato sulla bafenantrolina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Livelli di ferro non eme nella Drosophila di 1 mese, misurati con il test colorimetrico basato sulla batofenantrolina. I risultati mostrano (A) il contenuto di ferro non eme in ogni pool di 20 mosche o (B) il contenuto di ferro stimato di ogni singola mosca, considerando un peso medio di 0,64 mg / mosca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Viene fornito un protocollo per la misurazione del contenuto di ferro non eme nei tessuti animali, utilizzando un adattamento del saggio colorimetrico basato sulla batofenantrolina originariamente descritto da Torrance e Bothwell5,6. Le fasi critiche del metodo sono l'essiccazione del campione di tessuto; denaturazione proteica e rilascio di ferro inorganico per idrolisi acida; riduzione del ferro ferrico (Fe3+) allo stato ferroso (Fe2+) in presenza dell'agente riducente acido tioglicolico e sua reazione con un reagente batofenantrolina (reazione cromogena); lettura dell'assorbanza del risultante complesso rosa ione ferroso/bafenantrolina; e calcolo del contenuto di ferro tissutale.
Il presente lavoro mostra come il protocollo originale basato su cuvette possa essere adattato a un formato basato su 96 pozzi per una maggiore produttività, senza compromettere la sensibilità del test. In particolare, questo adattamento consente un notevole risparmio di tempo poiché: 1) un numero maggiore di reazioni cromogene può essere preparato contemporaneamente in piastre a 96 pozzetti con l'uso di pipette multicanale; e 2) le letture di assorbanza sono notevolmente più veloci in un lettore di piastre rispetto a quando si utilizza uno spettrofotometro. Un altro importante vantaggio del saggio basato su micropiastre è la regolazione dei volumi di reazione al cromogeno, che riduce sostanzialmente i costi con i reagenti (in particolare con il reagente batofenantrolina). L'intero protocollo può essere completato in 4 giorni. L'essiccazione del campione (che può richiedere fino a 48 ore se eseguita in forno a 65 °C) e la digestione acida (che viene eseguita comodamente durante la notte per 20 ore) sono le due fasi più dispendiose in termini di tempo. L'essiccazione dei campioni può essere accelerata utilizzando un forno di digestione a microonde progettato per l'uso in laboratorio nella digestione, dissoluzione, idrolisi o essiccazione di una vasta gamma di materiali. Poiché è possibile asciugare la maggior parte dei campioni di tessuto in meno di 2,5 ore, è possibile eseguire l'intero protocollo in soli 2 giorni. Tuttavia, poiché la capacità di un forno a microonde è limitata al numero di tazze di teflon che può contenere e poiché le tazze necessitano di lavaggio e decontaminazione dopo ogni utilizzo, gli utenti potrebbero trovare più conveniente asciugare i campioni in piastre a 24 pozzetti a 65 ° C quando si maneggia un numero elevato di campioni. Il tempo necessario per asciugare i tessuti può comunque essere ridotto utilizzando temperature superiori a 65 °C; tuttavia, il materiale plastico deve essere evitato a causa del rischio di fusione.
In precedenza, Grundy et al.11 avevano sviluppato un adattamento del metodo in cui l'intero test viene eseguito in piastre a 96 pozzetti, senza includere una fase di essiccazione del campione. Tuttavia, la misurazione dei metalli nei tessuti utilizzando il peso umido anziché il peso secco è significativamente influenzata dalla quantità variabile di perdita di peso attraverso l'essiccazione all'aria sia in campioni di tessuto fresco che congelato12. Pertanto, si raccomanda di normalizzare il contenuto di ferro rispetto al peso secco dei tessuti. Se l'essiccazione dei tessuti non è un'opzione praticabile (ad esempio, tessuto adiposo), si suggerisce che il test venga eseguito tempestivamente al momento della raccolta del campione, in modo che la determinazione accurata del peso fresco non sia significativamente influenzata dagli artefatti di conservazione.
È stata anche affrontata la composizione della soluzione acida. Secondo il protocollo originale5,6, i tessuti vengono digeriti con una miscela acida costituita da acido cloridrico e acido tricloroacetico. Tuttavia, il presente lavoro dimostra che il 37% di acido cloridrico da solo è ugualmente efficiente, almeno per digerire campioni di fegato e milza.
La soluzione standard di ferro di riserva viene preparata utilizzando polvere di ferro carbonilico, che è una polvere di ferro economica e altamente pura. Seguendo l'approccio qui descritto, è stata preparata una soluzione standard di ferro madre contenente 1,1169 mg di Fe/mL (20 mM), come successivamente determinato da AAS. Altre fonti di ferro (ad esempio, solfato di ferro, nitrilotriacetato di ferro) o soluzioni standard commerciali possono essere utilizzate per generare la soluzione standard di ferro di riserva, a condizione che venga determinata la concentrazione effettiva di ferro e che la linearità del saggio sia confermata eseguendo una curva standard.
Utilizzando il metodo attuale, il contenuto di ferro non eme di una varietà di tessuti animali è stato misurato con successo. Sono inclusi i risultati rappresentativi ottenuti con i tessuti dei roditori (fegato, milza, cuore e pancreas), fegato di branzino e drosophila intera. Il metodo non richiede sofisticati strumenti analitici o costose infrastrutture e può quindi essere facilmente implementato nella maggior parte dei laboratori. In sintesi, il metodo qui descritto può essere ampiamente applicato negli studi sull'omeostasi del ferro e sui disturbi legati al ferro utilizzando modelli animali sperimentali di sovraccarico o carenza di ferro.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da Fondi Nazionali attraverso FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., nell'ambito del progetto UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
