Summary
在这里，提供了一种测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用一种简单，成熟的比色法，可以在大多数实验室中轻松实施。
Abstract
铁是一种必需的微量营养素。铁超负荷和缺乏都对人类非常有害，组织铁水平受到精细调节。铁超负荷或缺乏的实验动物模型的使用有助于提高铁稳态的全身和细胞调节机制的知识。动物组织中总铁水平的测量通常使用原子吸收光谱或基于非血红素铁与菲罗啉试剂反应的比色测定进行。多年来，比色测定法一直用于测量各种动物组织中的非血红素铁含量。与原子吸收光谱不同，它排除了来自红细胞中含有的血红蛋白的血红素铁的贡献。此外，它不需要复杂的分析技能或昂贵的设备，因此可以在大多数实验室中轻松实施。最后，比色法可以基于比色皿，也可以适应微孔板形式，从而实现更高的样品通量。本工作提供了一个完善的方案，适用于检测铁超载或缺铁的各种实验动物模型中组织铁水平的改变。
Introduction
铁是一种必需的微量营养素，是参与关键生物过程（如氧气运输、能量产生或DNA合成）的蛋白质功能所必需的。重要的是，铁过量和缺铁都对人体健康非常有害，组织铁水平受到精细调节。饮食中铁吸收异常、缺铁饮食、反复输血和慢性炎症是影响全球数十亿人的铁相关疾病的常见原因1，2，3。
铁超负荷或缺乏的实验动物模型有助于提高我们对铁稳态的全身和细胞调节机制的了解4。尽管在过去二十年中取得了重大进展，但许多关键方面仍然难以捉摸。在未来几年，准确测量动物组织中的总铁水平仍将是推进铁生物学领域研究的关键一步。
大多数实验室使用原子吸收光谱（AAS），电感耦合血浆质谱（ICP-MS）或基于非血红素铁与菲螺母试剂反应的比色测定来定量组织铁。后者基于Torrance和Bothwell在50多年前描述的原始方法5，6。虽然随后开发了该方法的变体，采用亚铁嗪作为菲咯啉的替代品7，但后者仍然是文献中引用最广泛的显色试剂。
选择的方法通常取决于可用的专业知识和基础结构。虽然AAS和ICP-MS更敏感，但比色测定仍然被广泛使用，因为它具有以下重要优点：i）它排除了来自红细胞中含有的血红蛋白的血红素铁的贡献;ii）它不需要复杂的分析技能或昂贵的设备;iii）原始的基于比色皿的测定可以适应微孔板形式，从而实现更高的样品通量。这项工作中提出的比色方法通常用于量化从啮齿动物到鱼和果蝇的各种铁超载或缺铁实验动物模型中组织非血红素铁水平的变化。在这里，提供了一种测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用简单，成熟的比色测定法，大多数实验室应该发现易于实施。
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Protocol
C57BL / 6小鼠是商业购买的，C57BL / 6背景上的铁调素空（Hamp1−/−）小鼠8 是Sophie Vaulont（法国科钦研究所）的善意礼物。动物被安置在i3S动物设施中，在特定的无病原体条件下，在温度和光线受控的环境中，可以自由获取标准的啮齿动物食物和水。欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）是从一个商业养鱼场购买的，饲养在ICBAS动物设施中，在温度和光线受控的环境中，每天用标准鲈鱼饲料 随意 喂养。所有涉及脊椎动物的程序均由i3S动物伦理委员会和国家当局Direcão-Geral de Alimentação e Veterinária（DGAV）批准。有关商业试剂、设备和动物的信息列在 材料表中。
1. 溶液制备
注意：使用无铁玻璃器皿或一次性塑料器皿处理并准备所有试剂和溶液。由于存在铁污染的风险，不要让金属实验室材料（例如不锈钢刮刀）与任何试剂或溶液接触。确保任何可重复使用的玻璃器皿都是无铁的。用适当的实验室洗涤剂洗涤材料30-60分钟，用去离子水冲洗，在用去离子水以1：3稀释的37%硝酸溶液中浸泡过夜，用去离子水再次冲洗，然后晾干。
- 酸混合物：在玻璃瓶中加入10克三氯乙酸至82.2毫升37%盐酸中，彻底溶解，并用去离子水调节最终体积至100毫升。使用前摇匀。或者，仅使用37%的盐酸进行组织消化。
注意：当溶液储存在深棕色玻璃试剂瓶中时，溶液至少稳定2个月。
注意：盐酸和三氯乙酸具有腐蚀性，浓缩形式会释放有毒的酸性蒸汽。处理酸时，请始终穿着防护服、耐化学腐蚀的手套和化学防溅护目镜。避免吸入它们，并始终在通风橱下处理酸。 - 饱和乙酸钠：将228克无水乙酸钠加入玻璃瓶中的400毫升去离子水中，并在室温下搅拌过夜。让溶液休息并沉淀一天。如果没有沉淀，继续添加少量的乙酸钠。将溶液储存在玻璃瓶中。
- 染血原试剂：制备1mL染色原试剂，加入1mg4，7-二苯基-1，10-菲咯啉二磺酸二钠盐至500μL去离子水和10μL浓缩（100%）硫代乙醇酸，并彻底溶解。用去离子水将最终体积补足至1 mL。
注意：根据需要准备尽可能多的染色原试剂。当避光时，该溶液稳定1个月。 - 工作发色试剂（WCR）：将1体积的染色原试剂加入5体积的饱和乙酸钠和5体积的去离子水中。
注意：本溶液应在使用当天新鲜制备。 - 储备铁标准溶液：要制备20mM储备铁溶液，将111.5mg羰基铁粉放入含有5，480μL 37%盐酸的250mL容量瓶中。在室温下溶解过夜（或在沸水浴中孵育）。然后，用去离子水将溶液制成最终体积为100 mL。
注意：当标准溶液储存在密封的容器中时，可以无限期保存。 - 工作铁标准溶液（WISS）：将13.5μL37%盐酸加入500μL去离子水中。加入10μL储备铁标准溶液，并用去离子水（11.169μgFe / mL，200μM;由AAS测量）将最终体积组成1mL。
注意：工作溶液应在使用当天新鲜制备。
2. 样品干燥
- 用手术刀刀片切下重10-100毫克的组织样本。在分析/精密天平中，在一小块石蜡膜（新鲜重量）上准确称量。
- 使用塑料镊子，将组织块置于24孔板（未盖以允许水蒸发）中，并在65°C的标准培养箱上干燥48小时。
- 或者，使用实验室微波消解烘箱干燥组织样品。使用塑料镊子，将称重的纸巾放入无铁特氟龙杯中，然后在微波炉中干燥。根据仪器的说明手册设置操作参数。
注：作为参考，使用特定的消化炉干燥肝脏样品的操作参数（见 材料表）如 表1所示。 - 使用塑料镊子，将每块干燥的组织放在分析/精密天平内的一小块石膏膜上，并准确称量（干重）。
3. 样品酸性消解
- 使用塑料镊子，将每块干燥的组织转移到1.5 mL微量离心管中。
- 加入1mL酸混合物并关闭微量离心管。以相同的方式准备酸坯，只是省略了组织。
注意：酸混合物具有腐蚀性，会释放有毒蒸气。处理酸性混合物时，请穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和化学防溅护目镜。避免吸入，并始终在通风橱下处理它。 - 通过将微量离心管在65°C的培养箱中孵育20小时来消化组织。
- 冷却至室温后，使用装有塑料尖端的微量移液器将500μL透明（黄色）酸提取物（上清液）转移到新的1.5 mL微量离心管中。如果无法获得清除的上清液，请进行短速离心旋转。
注意：上清液是高酸性的。处理上清液时，请穿戴防护服、耐化学手套和化学飞溅护目镜。始终在通风橱下处理它们。
注意：此时，酸提取物可以立即用于比色测定或在-20°C下冷冻以供以后使用。将冷冻样品完全解冻至室温，并在使用前涡旋。
4. 色彩发展
- 按照 表2 所示在1.5 mL微量离心管中制备发色剂反应，或者为了获得更高的通量，直接进入平底，96孔，透明，未经处理的聚苯乙烯微孔板。准备所有反应（酸空白，标准品和样品）至少一式两份。
- 在室温下孵育15分钟。
5. 吸光度读数
- 在分光光度计或读板器中以535 nm的波长测量样品吸光度，与去离子水参考。板可以不盖或盖上盖子读取。在盖子的情况下，在测量之前清除由于盖子释放酸蒸气而形成的任何冷凝物，以避免对吸光度读数的可能干扰。
注：酸坯对去离子水（参考）的光吸光度应小于0.015;标准品和样品的吸光度应在0.100~1.000之间。对于铁含量非常高或非常低的样品，可能需要调整酸提取物（上清液）和diH2O的体积（表2）：如果吸光度大于1.0，则使用较小的样品（上清液）体积;当吸光度低于0.1时，使用较高体积的上清液。在计算每个样品的组织铁含量时，考虑样品体积（Vsmp）（见步骤6）。
6. 组织铁含量的计算
- 使用以下等式计算非血红素组织铁含量：
组织铁（μg/g 干组织）=
AT = 测试样品的吸光度
AB = 酸性坯料的吸光度
AS = 标准的吸光度
Fes = WISS 的铁浓度 （μg Fe/mL）
W = 干组织重量（g）
Vsmp = 样品体积（表2中上清液的可变体积转换为mL）
Vf = 在65°C下孵育过夜后酸混合物的最终体积（相当于酸体积加上以mL为单位的干组织体积;如果样品重量没有显着差异，则假设恒定体积≈1mL）
Vstd = 铁标准体积（表2中WISS的体积转换为mL）
Vrv = 最终反应体积（表2中的总体积转换为mL）
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Representative Results
比色皿与 96 孔微孔板比较
通过与最初由Torrance和Botthwell5，6描述的菲咯啉试剂反应测量组织非血红素铁依赖于使用分光光度计进行吸光度读数。因此，染色原反应中使用的体积与常规分光光度计比色皿的大小相容。本工作描述了一种方法适应性，其中染色原反应直接在96孔微孔板中制备，用于在酶标仪中测量吸光度，需要更小的试剂体积并允许更高的通量。
为了比较两种方法的灵敏度，最初制备了工作铁标准溶液（WISS）的连续稀释，并将染色原反应组装在1.5mL管或96孔板中，如表2所示。吸光度分别在分光光度计（带比色皿）或酶标仪中测量。使用这两种方法生成的代表性标准曲线如图1A所示。在这两种情况下，测试铁浓度的线性度都非常高（微孔板和比色皿的线性度分别为r2 = 0.9996和r2 = 0.9997）。
值得注意的是，使用了含有11.169μgFe / mL的WISS。目前的数据表明，可以使用较低的铁浓度来制备标准品。但是，不建议使用铁浓度较高的WISS，因为这可能导致吸光度值超过分光光度计的线性动态检测范围，从而导致标准曲线趋于平稳。
为了进一步比较基于比色皿和微孔板的测定，在总共55个小鼠组织样品（肝脏，脾脏，心脏，肺，骨髓）中测量了非血红素铁含量。在两种方法之间观察到非常高的相关性（r = 0.999，p<0.0001），表明基于微孔板的方法是原始基于比色皿的方法的有效替代方案（图1B）。
最后，在用盐酸和三氯乙酸的混合物（根据原始方法描述）或单独盐酸消化来自相同组织的样品后，用基于微孔板的方法定量小鼠组织中的非血红素铁水平。观察到非常高的相关性（r = 0.999，p<0.0001， 图1C），表明可以从酸消化中省略三氯乙酸。
下面包括的代表性结果是通过测量96孔板中的样品吸光度获得的。
遗传性血色病小鼠模型中组织非血红素铁水平的测量
使用基于菲咯啉的比色法测定法，从常用的小鼠菌株C57BL / 6和铁调素敲除（Hamp1-/-）小鼠（在C57BL / 6遗传背景中）测定各种组织（肝脏，脾脏，心脏和胰腺）中的非血红素铁含量。代表性的铁水平如图 2所示。铁调素是铁代谢的关键调节剂，其破坏可导致血色病样铁沉积表型，伴有严重的肝、胰腺和心脏铁蓄积以及脾铁耗竭8。
实验性铁调节后海鲈肝中非血红素铁水平的测量
使用基于菲罗啉的比色法测定法，测定健康（对照），铁处理（ 通过 腹膜内途径施用的2mg铁葡聚糖）和贫血（2%v / w从尾血管抽取的血液）欧洲鲈鱼（Dicentrarchus labrax）肝脏中的非血红素铁水平。正如预期的那样，在铁处理的动物中，肝铁水平显着增加，而贫血导致肝铁储存轻度减少（图3）。
测量整个黑腹果蝇中的非血红素铁水平
虽然目前的方法不适合测量果 蝇个体果蝇的非血 红素铁水平，因为它们的体重很小（男性和女性的平均体重分别为0.6毫克和0.8毫克）9，但它可以成功地用于混合苍蝇。 图4 描绘了20只全雄蝇的代表性非血红素铁水平，无论是野生型Oregon-R还是Malvolio（Mvl）敲除。Mvl是哺乳动物SLC11A2基因的同源物，该基因编码一种称为二价金属转运蛋白1（DMT1）的蛋白质，其遗传破坏导致缺铁10。正如预期的那样，与野生型相比，Mlv苍蝇的身体非血红素铁含量要低得多。
| 功率 650W （%）： | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 压力（PSI）： | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 时间（分钟）： | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| 压力下的时间 （TAP）： | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 扇： | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
表1：这里使用的微波消化炉中肝脏干燥的操作参数。
| 白粉盒（μL） | 酸混合物（μL） | 上清液（μL） | 丝毫（μL） | 二H2O （μL） | 总体积（μL） | ||
| 1.5 mL 离心管 | 酸性毛坯 | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| 标准 | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| 样本 | 1000 | 变量 | 变量 | 1300 | |||
| 96 孔微孔板 | 酸性毛坯 | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| 标准 | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| 样本 | 150 | 变量 | 变量 | 195 |
表2：在1.5 mL管或96孔板中制备染色原反应。
图1：通过比色皿或96孔基于微孔板的比色法测定非血红素铁。
（B）来自6个月大的雄性C57BL / 6小鼠的55个组织样本中基于比色皿和基于微孔板的非血红素铁水平之间的相关性，包括肝脏（实心圆圈
），脾脏（开放圆圈
），心脏（实心三角形
），肺（星
号）和骨髓（钻石
）。（C）在用盐酸和三氯乙酸（HCl + C2HCl3O2）的混合物酸性消化样品后，用96孔基于微孔板的测定法测量来自6个月大雄性小鼠的组织子集（肝脏，实心圈;脾脏，开放圈）中的非血红素铁水平。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：通过基于菲罗啉浴的比色法测定各种组织中的非血红素铁含量。 雄性C57BL / 6野生型小鼠（开放圈 ）和雄性铁调素缺乏的 Hamp1-/ - 小鼠在8周龄时在C57BL / 6遗传背景（开放方块 ）上的肝脏，脾脏，心脏和胰腺中的非血红素铁水平，用基于菲罗啉的比色法测定法测量。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：实验性铁调节后幼年雌性欧洲鲈鱼的肝脏非血红素铁水平。 通过腹膜内给予2mg铁葡聚糖来实现铁超负荷，而贫血是通过从尾血管中抽出2%v / w的血液引起的。在铁治疗或采血后4天收集肝脏。对照动物是健康的，未经处理的鲈鱼。使用基于菲罗啉的比色法测量非血红素铁水平。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：使用基于菲罗啉的比色法测定的1个月大 果蝇中的非血红素铁水平。 结果显示（A）每只苍蝇池中的非血红素铁含量或（B）每只苍蝇的估计铁含量，考虑到平均重量为0.64毫克/苍蝇。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
提供了测量动物组织中非血红素铁含量的方案，使用最初由Torrance和Bothwell描述的基于菲罗啉的比色测定法的适应性5，6。该方法的关键步骤是组织样品干燥;蛋白质变性并通过酸水解释放无机铁;在还原剂硫代乙醇酸存在下将铁（Fe3 +）还原为亚铁状态（Fe2 +），并将其与菲咯啉试剂反应（染色原反应）;所得黑色离子/菲咯啉粉红色复合物的吸光度读数;和组织铁含量的计算。
目前的工作表明，基于比色皿的原始方案如何适应基于96孔的格式，从而在不影响测定灵敏度的情况下实现更高的通量。值得注意的是，这种适应性可以节省大量时间，因为：1）使用多通道移液器可以在96孔板中同时制备更多的染色原反应;2）读板器中的吸光度读数比使用分光光度计时快得多。基于微孔板的测定的另一个重要优点是调整了发色剂反应体积，这大大降低了试剂（特别是使用菲洛啉试剂）的成本。整个协议可以在4天内完成。样品干燥（在65°C的烤箱中进行时可能需要长达48小时）和酸性消解（方便地过夜20小时）是两个最耗时的步骤。使用专为实验室用于消化、溶解、水解或干燥各种材料的微波消解烘箱，可以加速样品干燥。由于可以在不到2.5小时内干燥大多数组织样品，因此可以在短短2天内执行整个方案。然而，由于微波炉的容量仅限于其可以容纳的特氟龙杯的数量，并且由于杯子在每次使用后都需要清洗和去污，因此当处理大量样品时，用户可能会发现在65°C的24孔板中干燥样品更方便。通过使用高于65°C的温度仍然可以减少干燥组织所需的时间;但是，由于存在熔化风险，必须避免使用塑料材料。
此前，Grundy等人已经开发 出一种方法的适应性，其中整个测定在96孔板中进行，不包括样品干燥步骤。然而，使用湿重而不是干重测量组织中的金属会受到新鲜和冷冻组织样品中通过空气干燥的可变重量损失量的显着影响12。因此，建议将铁含量与组织干重正常化。如果组织干燥不是一个可行的选择（例如，脂肪组织），建议在样品收集时立即进行测定，以便新鲜重量的准确测定不会受到储存伪影的显着影响。
酸溶液的组成也得到了解决。根据原始方案5，6，组织用由盐酸和三氯乙酸组成的酸混合物消化。然而，目前的研究表明，单独使用37%的盐酸同样有效，至少对于消化肝脏和脾脏样本而言。
库存铁标准溶液是使用羰基铁粉制备的，羰基铁粉是一种廉价且高纯度的铁粉。按照本文描述的方法，制备了含有1.1169mg Fe / mL（20mM）的储备铁标准溶液，随后由AAS测定。铁的其他来源（例如，硫酸铁，硝基三乙酸铁）或商业标准溶液可用于生成库存铁标准溶液，前提是确定实际铁浓度，并通过执行标准曲线确认测定线性度。
使用目前的方法，成功测量了多种动物组织的非血红素铁含量。包括啮齿动物组织（肝脏、脾脏、心脏和胰腺）、鲈鱼肝和整个果蝇获得的代表性结果。该方法不需要复杂的分析工具或昂贵的基础设施，因此可以在大多数实验室中轻松实施。综上所述，本文所述的方法可广泛应用于铁稳态和铁相关病症的研究，采用铁超负荷或缺铁的实验动物模型。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由国家基金通过FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia，I.P.资助，在UIDB/04293/2020项目下。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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