Summary
यहां, पशु ऊतकों में गैर-हीम लोहे की सामग्री के माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, एक सरल, अच्छी तरह से स्थापित colorimetric परख का उपयोग करके जिसे अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है।
Abstract
आयरन एक आवश्यक सूक्ष्म पोषक तत्व है। लोहे के अधिभार और कमी दोनों मनुष्यों के लिए अत्यधिक हानिकारक हैं, और ऊतक लोहे के स्तर को बारीक विनियमित किया जाता है। लोहे के अधिभार या कमी के प्रयोगात्मक पशु मॉडल का उपयोग लोहे के होमोस्टैसिस के प्रणालीगत और सेलुलर विनियमन में शामिल तंत्र के ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण रहा है। जानवरों के ऊतकों में कुल लोहे के स्तर का माप आमतौर पर परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ या एक colorimetric परख के साथ एक bathophenanthroline अभिकर्मक के साथ गैर हीम लोहे की प्रतिक्रिया के आधार पर प्रदर्शन किया जाता है। कई वर्षों के लिए, colorimetric परख पशु ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में गैर हीम लोहे की सामग्री के माप के लिए इस्तेमाल किया गया है. परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के विपरीत, यह लाल रक्त कोशिकाओं में निहित हीमोग्लोबिन से प्राप्त हीम आयरन के योगदान को बाहर करता है। इसके अलावा, इसे परिष्कृत विश्लेषणात्मक कौशल या अत्यधिक महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है, और इस प्रकार अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है। अंत में, colorimetric परख या तो cuvette आधारित या एक microplate प्रारूप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उच्च नमूना throughput की अनुमति देता है. वर्तमान कार्य एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो लोहे के अधिभार या लोहे की कमी के विभिन्न प्रयोगात्मक पशु मॉडल में ऊतक लोहे के स्तर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।
Introduction
लोहा एक आवश्यक सूक्ष्म पोषक तत्व है, जो ऑक्सीजन परिवहन, ऊर्जा उत्पादन या डीएनए संश्लेषण जैसी महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन के कार्य के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण रूप से, लोहे की अधिकता और लोहे की कमी दोनों मानव स्वास्थ्य के लिए अत्यधिक हानिकारक हैं, और ऊतक लोहे के स्तर को बारीक विनियमित किया जाता है। असामान्य आहार लोहा अवशोषण, लोहे की कमी वाले आहार, बार-बार रक्त आधान, और पुरानी सूजन लोहे से जुड़े विकारों के सामान्य कारण हैं जो दुनिया भर में अरबों लोगों को प्रभावित करते हैं1,2,3।
लोहे के अधिभार या कमी के प्रयोगात्मक पशु मॉडल लोहे के होमोस्टैसिस 4 के प्रणालीगत और सेलुलर विनियमन में शामिल तंत्र के हमारे ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई गई है। पिछले दो दशकों के दौरान की गई पर्याप्त प्रगति के बावजूद, कई प्रमुख पहलू मायावी बने हुए हैं। आने वाले वर्षों में, पशु ऊतकों में कुल लोहे के स्तर का सटीक माप लोहे के जीव विज्ञान के क्षेत्र में अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम बना रहेगा।
अधिकांश प्रयोगशालाएं या तो परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (एएएस), आगमनात्मक रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) के साथ ऊतक लोहे की मात्रा निर्धारित करती हैं, या एक बाथोफेनान्थ्रोलाइन अभिकर्मक के साथ गैर-हीम लोहे की प्रतिक्रिया के आधार पर एक colorimetric परख। उत्तरार्द्ध 50 साल पहले 50 साल पहले 5,6 पर Torrance और Bothwell द्वारा वर्णित मूल विधि पर आधारित है। जबकि इस विधि की एक भिन्नता बाद में बाथोफेनान्थ्रोलाइन 7 के विकल्प के रूप में फेरोज़िन को नियोजित करते हुए विकसित की गई थी, उत्तरार्द्ध साहित्य में सबसे व्यापक रूप से उद्धृत क्रोमोजेनिक अभिकर्मक बना हुआ है।
पसंद की विधि अक्सर उपलब्ध विशेषज्ञता और बुनियादी ढांचे पर निर्भर करती है। जबकि एएएस और आईसीपी-एमएस अधिक संवेदनशील हैं, colorimetric परख व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि यह निम्नलिखित महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करता है: i) यह लाल रक्त कोशिकाओं में निहित हीमोग्लोबिन से व्युत्पन्न हेम आयरन के योगदान को बाहर करता है; ii) इसे परिष्कृत विश्लेषणात्मक कौशल या अत्यधिक महंगे उपकरणों की आवश्यकता नहीं है; और iii) मूल cuvette-आधारित परख एक microplate प्रारूप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, उच्च नमूना throughput की अनुमति देता है. इस काम में प्रस्तुत colorimetric दृष्टिकोण नियमित रूप से लोहे के अधिभार या लोहे की कमी के प्रयोगात्मक पशु मॉडल की एक किस्म में ऊतक गैर हीम लोहे के स्तर में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, कृन्तकों से मछली और फल मक्खी के लिए। यहां, पशु ऊतकों में गैर-हीम लोहे की सामग्री के माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, एक सरल, अच्छी तरह से स्थापित, colorimetric परख का उपयोग करके कि अधिकांश प्रयोगशालाओं को लागू करना आसान होना चाहिए।
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Protocol
C57BL /6 चूहों को व्यावसायिक रूप से खरीदा गया था और C57BL/6 background8 पर हेप्सिडिन-नल (Hamp1−/−) चूहे सोफी वॉलंट (इंस्टीट्यूट कोचीन, फ्रांस) से एक तरह का उपहार थे। जानवरों को विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त परिस्थितियों में i3S पशु सुविधा में रखा गया था, एक तापमान और प्रकाश-नियंत्रित वातावरण में, मानक कृंतक चाउ और पानी तक मुफ्त पहुंच के साथ। यूरोपीय समुद्री बास (Dicentrarchus labrax) को एक वाणिज्यिक मछली के खेत से खरीदा गया था और ICBAS पशु सुविधा में रखा गया था, तापमान और प्रकाश-नियंत्रित वातावरण में, और मानक समुद्र बास फ़ीड के साथ दैनिक विज्ञापन लिबिटम खिलाया गया था। कशेरुकी जानवरों से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को i3S पशु नैतिकता समिति और राष्ट्रीय प्राधिकरण, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV) द्वारा अनुमोदित किया गया था। वाणिज्यिक अभिकर्मकों, उपकरणों और जानवरों के बारे में जानकारी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है।
1. समाधान की तैयारी
नोट: लोहे से मुक्त ग्लासवेयर या डिस्पोजेबल प्लास्टिकवेयर के साथ सभी अभिकर्मकों और समाधानों को संभालें और तैयार करें। लोहे के संदूषण के जोखिम के कारण धातु प्रयोगशाला सामग्री (जैसे, स्टेनलेस स्टील स्पैटुला) को किसी भी अभिकर्मक या समाधान के संपर्क में आने की अनुमति न दें। सुनिश्चित करें कि कोई भी पुन: प्रयोज्य ग्लासवेयर आयरन मुक्त है। 30-60 मिनट के लिए उपयुक्त प्रयोगशाला डिटर्जेंट के साथ सामग्री को धोएं, विआयनीकृत पानी के साथ कुल्ला करें, विआयनीकृत पानी के साथ 1: 3 पतला 37% नाइट्रिक एसिड समाधान में रात भर भिगोएं, विआयनीकृत पानी के साथ फिर से कुल्ला करें, और सूखने की अनुमति दें।
- एसिड मिश्रण: एक कांच की बोतल में 37% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 82.2 मिलीलीटर में 10 ग्राम ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड जोड़ें, अच्छी तरह से भंग करें, और विआयनीकृत पानी के साथ अंतिम मात्रा को 100 मिलीलीटर में समायोजित करें। उपयोग करने से पहले हिलाएं। वैकल्पिक रूप से, ऊतक पाचन के लिए केवल 37% हाइड्रोक्लोरिक एसिड का उपयोग करें।
नोट: समाधान कम से कम 2 महीने के लिए स्थिर है जब गहरे भूरे रंग के कांच अभिकर्मक बोतलों में संग्रहीत किया जाता है।
सावधानी: हाइड्रोक्लोरिक एसिड और ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड संक्षारक होते हैं, और केंद्रित रूप विषाक्त अम्लीय वाष्प जारी करते हैं। एसिड को संभालते समय सुरक्षात्मक कपड़े, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, और रासायनिक छप चश्मे हर समय पहनें। उन्हें साँस लेने से बचें और हमेशा एक धुएं के हुड के नीचे एसिड को संभालें। - संतृप्त सोडियम एसीटेट: एक कांच की बोतल में 400 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 228 ग्राम निर्जल सोडियम एसीटेट जोड़ें और कमरे के तापमान पर रात भर आंदोलन करें। समाधान को आराम करने दें और एक दिन के लिए अवक्षेपित करें। यदि कोई वर्षा नहीं होती है, तो सोडियम एसीटेट की छोटी मात्रा को जोड़ना जारी रखें। घोल को कांच की बोतल में स्टोर करें।
- क्रोमोजेन अभिकर्मक: क्रोमोजेन अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, 4,7-डाइफिनाइल-1,10-फेनान्थ्रोलाइन डाइसल्फोनिक एसिड डाइसोडियम नमक के 1 मिलीग्राम को 500 μL विआयनीकृत पानी और 10 μL केंद्रित (100%) थायोग्लाइकोलिक एसिड के 10 μL जोड़ें, और पूरी तरह से भंग हो जाएं। विआयनीकृत पानी के साथ 1 मिलीलीटर तक अंतिम मात्रा बनाएं।
नोट: आवश्यकतानुसार अधिक क्रोमोजेन अभिकर्मक तैयार करें। समाधान प्रकाश से संरक्षित होने पर 1 महीने के लिए स्थिर होता है। - क्रोमोजेन अभिकर्मक (डब्ल्यूसीआर): संतृप्त सोडियम एसीटेट के 5 संस्करणों और विआयनीकृत पानी के 5 संस्करणों में क्रोमोजेन अभिकर्मक की 1 मात्रा जोड़ें।
नोट: इस समाधान को उपयोग के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए। - स्टॉक आयरन स्टैंडर्ड सॉल्यूशन: 20 एमएम स्टॉक आयरन समाधान तैयार करने के लिए, 250 मिलीलीटर वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में 111.5 मिलीग्राम कार्बोनिल आयरन पाउडर रखें जिसमें 37% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 5,480 μL होते हैं। कमरे के तापमान पर रात भर भंग करने के लिए छोड़ दें (या उबलते पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें)। फिर, विआयनीकृत पानी के साथ 100 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा का समाधान बनाएं।
नोट: मानक समाधान अनिश्चित काल के लिए रखा जा सकता है जब एक कसकर सील पोत में संग्रहीत किया जाता है। - वर्किंग आयरन स्टैंडर्ड सॉल्यूशन (WISS): 500 μL विआयनीकृत पानी में 37% हाइड्रोक्लोरिक एसिड का 13.5 μL जोड़ें। स्टॉक आयरन स्टैंडर्ड सॉल्यूशन के 10 μL जोड़ें और विआयनीकृत पानी के साथ 1 mL तक अंतिम मात्रा बनाएं (Fe / mL, 200 μM के 11.169 μg; AAS द्वारा मापा गया)।
नोट: काम करने वाले समाधान को उपयोग के दिन नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए।
2. नमूना सुखाने
- एक स्केलपेल ब्लेड के साथ 10-100 मिलीग्राम वजन वाले ऊतक का एक नमूना काटें। पैराफिल्म (ताजा वजन) के एक छोटे से टुकड़े पर एक विश्लेषणात्मक / परिशुद्धता संतुलन में इसे सटीक रूप से तौलें।
- प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करते हुए, ऊतक के टुकड़े को 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखें (पानी के वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए अनलिड) और इसे 48 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक इनक्यूबेटर पर सूखने दें।
- वैकल्पिक रूप से, ऊतक के नमूनों को सुखाने के लिए एक प्रयोगशाला माइक्रोवेव पाचन ओवन का उपयोग करें। प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करते हुए, ऊतक के वजन वाले टुकड़े को लोहे से मुक्त टेफ्लॉन कप में रखें और इसे माइक्रोवेव में सुखाएं। उपकरण के निर्देश मैनुअल के अनुसार ऑपरेटिंग पैरामीटर सेट करें।
नोट:: एक संदर्भ के रूप में, विशिष्ट पाचन ओवन का उपयोग कर जिगर के नमूनों को सुखाने के लिए ऑपरेटिंग पैरामीटर ( सामग्री की तालिका देखें) तालिका 1 में दिखाए गए हैं। - प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करते हुए, ऊतक के प्रत्येक सूखे टुकड़े को एक विश्लेषणात्मक / सटीक संतुलन के अंदर पैराफिल्म के एक छोटे से टुकड़े पर रखें और इसे सटीक रूप से वजन करें (सूखा वजन)।
3. नमूना अम्लीय पाचन
- प्लास्टिक चिमटी का उपयोग करते हुए, ऊतक के प्रत्येक सूखे टुकड़े को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- एसिड मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को बंद कर दें। उसी तरह से एक एसिड रिक्त तैयार करें, सिवाय इसके कि ऊतक को छोड़ दिया गया है।
सावधानी: एसिड मिश्रण संक्षारक है और विषाक्त वाष्प जारी करता है। एसिड मिश्रण को संभालते समय सुरक्षात्मक कपड़े, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने और रासायनिक छप चश्मे पहनें। इसे साँस लेने से बचें और हमेशा इसे संभालें, जबकि धुएं के हुड के नीचे। - 20 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को इनक्यूबेट करके ऊतकों को पचाएं।
- कमरे के तापमान पर ठंडा करने के बाद, प्लास्टिक युक्तियों के साथ फिट माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्पष्ट (पीले) एसिड निकालने (supernatant) के 500 μL को स्थानांतरित करें। यदि एक स्पष्ट supernatant प्राप्त करना संभव नहीं है, तो एक छोटा सेंट्रीफ्यूजेशन स्पिन करें।
सावधानी: supernatant अत्यधिक अम्लीय है. supernatants हैंडलिंग करते समय सुरक्षात्मक परिधान, रासायनिक प्रतिरोधी दस्ताने, और रासायनिक छप चश्मे पहनें। हमेशा उन्हें संभाल, जबकि एक धुएं हुड के नीचे.
नोट: इस बिंदु पर, एसिड अर्क तुरंत colorimetric परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए. पूरी तरह से कमरे के तापमान के लिए जमे हुए नमूनों को पिघलाएं और उपयोग करने से पहले उन्हें भंवर करें।
4. रंग विकास
- क्रोमोजेन प्रतिक्रियाओं को तैयार करें जैसा कि तालिका 2 में 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में इंगित किया गया है या, उच्च थ्रूपुट के लिए, सीधे फ्लैट तल में, 96-अच्छी तरह से, स्पष्ट, अनुपचारित पॉलीस्टीरीन माइक्रोप्लेट्स में। सभी प्रतिक्रियाओं (एसिड रिक्त, मानक, और नमूना) कम से कम डुप्लिकेट में तैयार करें।
- 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
5. Absorbance पठन
- एक विआयनीकृत जल संदर्भ के खिलाफ 535 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या प्लेट रीडर में नमूना अवशोषण को मापें। प्लेटों को बिना ढक्कन या ढक्कन के पढ़ा जा सकता है। ढक्कन के मामले में, अवशोषण पढ़ने के साथ संभावित हस्तक्षेप से बचने के लिए माप से ठीक पहले ढक्कन से एसिड वाष्पों की रिहाई के कारण गठित किसी भी संघनन को हटा दें।
नोट: विआयनीकृत पानी (संदर्भ) के खिलाफ पढ़ने वाले एसिड रिक्त का ऑप्टिकल अवशोषण 0.015 से कम होना चाहिए; मानक और नमूनों का ऑप्टिकल अवशोषण 0.100 और 1.000 के बीच होना चाहिए। बहुत अधिक या बहुत कम लोहे की सामग्री वाले नमूनों के लिए, एसिड निकालने (supernatant) और diH2O की मात्रा को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है (तालिका 2): यदि अवशोषण 1.0 से अधिक है, तो एक छोटे नमूने (supernatant) मात्रा का उपयोग करें; जब absorbance 0.1 से कम है, supernatant की एक उच्च मात्रा का उपयोग करें। नमूना मात्रा (Vsmp) को प्रत्येक नमूने की ऊतक लोहे की सामग्री की गणना करते समय ध्यान में रखा जाता है (चरण 6 देखें)।
6. ऊतक लौह सामग्री की गणना
- निम्नलिखित समीकरण के साथ गैर-हीम ऊतक लोहे की सामग्री की गणना करें:
ऊतक लोहा (μg / g शुष्क ऊतक) =
AT = परीक्षण नमूने का अवशोषण
AB = एसिड रिक्त का अवशोषण
AS = मानक का अवशोषण
Fes = WISS की लोहे की सांद्रता (μg Fe/mL)
W = शुष्क ऊतक का वजन (g)
Vsmp = नमूना आयतन (तालिका 2 में Supernatant का चर आयतन mL में परिवर्तित)
Vf = 65 °C पर रात भर इनक्यूबेशन के बाद एसिड मिश्रण की अंतिम मात्रा (एमएल में एसिड की मात्रा और शुष्क ऊतक की मात्रा के अनुरूप; यदि नमूना वजन काफी भिन्न नहीं है, तो 1 मिलीलीटर ≈ एक स्थिर आयतन मान लें)
Vstd = लोहा मानक आयतन (तालिका 2 में WISS का आयतन mL में परिवर्तित)
Vrv = अंतिम अभिक्रिया आयतन (तालिका 2 में कुल आयतन mL में परिवर्तित)
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Representative Results
Cuvette बनाम 96 अच्छी तरह से microplate तुलना
ऊतक गैर-हीम लोहे का माप एक बाथोफेनान्थ्रोलाइन अभिकर्मक के साथ प्रतिक्रिया द्वारा मूल रूप से Torrance और Bothwell5,6 द्वारा वर्णित अवशोषण पढ़ने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के उपयोग पर निर्भर करता है। इसलिए, क्रोमोजेन प्रतिक्रिया में नियोजित वॉल्यूम एक नियमित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर क्यूवेट के आकार के साथ संगत हैं। वर्तमान कार्य एक विधि अनुकूलन का वर्णन करता है जिसमें क्रोमोजेन प्रतिक्रियाओं को सीधे माइक्रोप्लेट रीडर में अवशोषण माप के लिए 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में तैयार किया जाता है, जिसमें छोटे अभिकर्मक वॉल्यूम की आवश्यकता होती है और उच्च थ्रूपुट की अनुमति होती है।
दोनों दृष्टिकोणों की संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए, काम करने वाले लोहे के मानक समाधान (डब्ल्यूआईएसएस) का एक सीरियल कमजोर पड़ने को शुरू में तैयार किया गया था, और क्रोमोजेन प्रतिक्रियाओं को या तो 1.5 एमएल ट्यूबों में या 96-अच्छी तरह से प्लेटों में इकट्ठा किया गया था, जैसा कि तालिका 2 में इंगित किया गया है। Absorbance को क्रमशः एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (क्यूवेट के साथ) या एक माइक्रोप्लेट रीडर में मापा गया था। दो दृष्टिकोणों के साथ उत्पन्न प्रतिनिधि मानक वक्रों को चित्र 1A में दर्शाया गया है। दोनों मामलों में, रैखिकता परीक्षण किए गए लोहे की सांद्रता में बहुत अधिक थी (r2 = 0.9996 और r2 = 0.9997 क्रमशः माइक्रोप्लेट और क्यूवेट के लिए)।
उल्लेखनीय है, एक WISS जिसमें Fe / mL के 11.169 μg शामिल थे, का उपयोग किया गया था। वर्तमान डेटा से पता चलता है कि मानक तैयार करने के लिए कम लोहे की सांद्रता का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, उच्च लोहे की सांद्रता के साथ एक WISS के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि इससे अवशोषण मूल्यों को जन्म दिया जा सकता है जो स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की पहचान की रैखिक गतिशील सीमा से अधिक है, जिससे मानक वक्र पठार हो सकते हैं।
आगे क्यूवेट- और माइक्रोप्लेट-आधारित assays की तुलना करने के लिए, गैर-हीम लोहे की सामग्री को कुल 55 माउस ऊतक नमूनों (जिगर, प्लीहा, हृदय, फेफड़े, अस्थि मज्जा) में मापा गया था। दो पद्धतियों (r = 0.999, p < 0.0001) के बीच सहसंबंध की एक बहुत ही उच्च डिग्री देखी गई थी, यह दर्शाता है कि माइक्रोप्लेट-आधारित विधि मूल क्यूवेट-आधारित विधि (चित्रा 1 B) के लिए एक वैध विकल्प है।
अंत में, माउस ऊतकों में गैर-हीम लोहे के स्तर को या तो हाइड्रोक्लोरिक एसिड और ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (मूल विधि विवरण के अनुसार) या अकेले हाइड्रोक्लोरिक एसिड के मिश्रण के साथ एक ही ऊतक से प्राप्त नमूनों के अम्लीय पाचन के बाद माइक्रोप्लेट-आधारित विधि के साथ परिमाणित किया गया था। एक बहुत ही उच्च सहसंबंध देखा गया था (r = 0.999, p < 0.0001, चित्रा 1C), यह दर्शाता है कि एसिड पाचन से ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड को छोड़ा जा सकता है।
नीचे शामिल प्रतिनिधि परिणाम 96-अच्छी तरह से प्लेटों में नमूना absorbance को मापने के द्वारा प्राप्त किए गए थे।
आनुवांशिक हेमोक्रोमैटोसिस के माउस मॉडल में ऊतक गैर-हीम लोहे के स्तर का मापन
bathophenanthroline-आधारित colorimetric परख का उपयोग करते हुए, गैर-हीम लोहे की सामग्री को विभिन्न ऊतकों (जिगर, प्लीहा, दिल और अग्न्याशय) में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले माउस तनाव C57BL / 6 से और हेप्सिडिन नॉकआउट (Hamp1-/-) चूहों (C57BL / 6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि में) से निर्धारित किया गया था। प्रतिनिधि लोहे के स्तर को चित्र 2 में दर्शाया गया है। हेप्सिडिन लोहे के चयापचय का एक प्रमुख नियामक है और इसके विघटन से एक हेमोक्रोमैटोसिस जैसे लोहे के जमाव फेनोटाइप की ओर जाता है, जिसमें गंभीर यकृत, अग्नाशय, और कार्डियक आयरन संचय, और स्प्लेनिक आयरन की कमी 8 होती है।
प्रयोगात्मक लौह मॉडुलन के बाद समुद्र बास जिगर में गैर-हीम लोहे के स्तर का मापन
बाथोफेनान्थ्रोलाइन-आधारित colorimetric परख का उपयोग करते हुए, गैर-हीम लोहे के स्तर को स्वस्थ (नियंत्रण), लोहे का इलाज (इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से प्रशासित लोहे के डेक्सट्रान के 2 मिलीग्राम) और एनीमिक (2% वी / डब्ल्यू रक्त के पुच्छल वाहिकाओं से खींचे गए) यूरोपीय समुद्री बास (Dicentrarchus labrax) के जिगर में निर्धारित किया गया था। जैसा कि अपेक्षित था, हेपेटिक लोहे के स्तर में लोहे के इलाज वाले जानवरों में बड़े पैमाने पर वृद्धि हुई, जबकि एनीमिया ने यकृत लोहे के भंडार में हल्की कमी का कारण बना (चित्रा 3)।
पूरे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में गैर-हीम लोहे के स्तर का मापन
यद्यपि वर्तमान विधि व्यक्तिगत ड्रोसोफिला मक्खियों में गैर-हीम लोहे के स्तर को मापने के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि उनके छोटे शरीर के द्रव्यमान के कारण (पुरुषों और महिलाओं के लिए औसत वजन क्रमशः 0.6 मिलीग्राम और 0.8 मिलीग्राम है) 9, इसे पूल की गई मक्खियों के साथ सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 4 20 पूरे पुरुष मक्खियों के समूहों के लिए प्रतिनिधि गैर-हीम लोहे के स्तर को दर्शाता है, या तो जंगली-प्रकार के ओरेगन-आर या मालवोलियो (एमवीएल) नॉकआउट। Mvl स्तनधारी SLC11A2 जीन का होमोलॉग है, जो द्विसंयोजक धातु ट्रांसपोर्टर 1 (DMT1) नामक प्रोटीन के लिए एन्कोड करता है, और इसके आनुवंशिक व्यवधान से लोहे की कमी 10 होती है। जैसा कि अपेक्षित था, Mlv मक्खियों ने जंगली-प्रकार की तुलना में काफी कम शरीर की गैर-हीम लोहे की सामग्री प्रस्तुत की।
| पावर 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| दबाव (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| समय (मिनट): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| दबाव में समय (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| पंखा: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
तालिका 1: यहां उपयोग किए जाने वाले माइक्रोवेव पाचन ओवन में जिगर सुखाने के लिए ऑपरेटिंग पैरामीटर।
| WCR (μL) | एसिड मिश्रण (μL) | Supernatant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | कुल आयतन (μL) | ||
| 1.5 mL ट्यूब | एसिड रिक्त | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| मानक | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| नमूना | 1000 | परिवर्तनशील | परिवर्तनशील | 1300 | |||
| 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट | एसिड रिक्त | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| मानक | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| नमूना | 150 | परिवर्तनशील | परिवर्तनशील | 195 |
तालिका 2: या तो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों या 96-अच्छी तरह से प्लेटों में क्रोमोजेन प्रतिक्रियाओं की तैयारी।
चित्रा 1: क्यूवेट- या 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट-आधारित colorimetric assays द्वारा गैर-हीम लोहे का निर्धारण। (A) माइक्रोप्लेट के लिए मानक वक्र- (खुले वर्ग
) और क्यूवेट-आधारित (खुले त्रिभुज) assays। (बी) जिगर (ठोस हलकों), प्लीहा (खुले हलकों
), हृदय (ठोस त्रिकोण), फेफड़े (तारांकन
), और अस्थि मज्जा (हीरे) सहित 6 महीने के पुरुष C57BL / 6 चूहों से 55 ऊतक नमूनों 
में क्यूवेट-आधारित और माइक्रोप्लेट-आधारित गैर-हीम लोहे के स्तर के 
बीच सहसंबंध। (सी) 6 महीने के पुरुष चूहों (जिगर, ठोस हलकों; प्लीहा, खुले हलकों) से ऊतकों के एक सबसेट में गैर-हीम लोहे का स्तर हाइड्रोक्लोरिक एसिड और ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (HCl + C2HCl3O2) या अकेले हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) के मिश्रण के साथ नमूनों के अम्लीय पाचन के बाद 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट-आधारित परख के साथ मापा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: गैर हीम लोहे की सामग्री bathophenanthroline-आधारित colorimetric परख द्वारा विभिन्न ऊतकों में निर्धारित. जिगर, तिल्ली, दिल, और पुरुष C57BL / 6 जंगली प्रकार के चूहों (खुले हलकों ) और पुरुष hepcidin-कमी Hamp1-/ - C57BL / 6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि (खुले वर्गों ) पर चूहों के अग्न्याशय में गैर हीम लोहे का स्तर 8 सप्ताह की उम्र में, bathophenanthroline-आधारित colorimetric परख के साथ मापा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: प्रयोगात्मक लौह मॉडुलन के बाद किशोर महिला यूरोपीय समुद्र बास में हेपेटिक गैर-हीम लोहे का स्तर। लोहे के अधिभार को 2 मिलीग्राम लोहे के डेक्सट्रान के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन द्वारा प्राप्त किया गया था, जबकि एनीमिया को पुच्छल वाहिकाओं से रक्त के 2% वी / डब्ल्यू की निकासी से प्रेरित किया गया था। लोहे के उपचार या रक्त संग्रह के 4 दिनों के बाद लिवर एकत्र किए गए थे। नियंत्रण जानवर स्वस्थ, अनुपचारित समुद्री बास थे। गैर हीम लोहे के स्तर bathophenanthroline आधारित colorimetric परख के साथ मापा गया था. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: 1 महीने पुराने ड्रोसोफिला में गैर-हीम लोहे का स्तर, बाथोफेनान्थ्रोलाइन-आधारित colorimetric परख के साथ मापा जाता है। परिणाम (ए) 20 मक्खियों के प्रत्येक पूल में गैर-हीम लोहे की सामग्री या (बी) प्रत्येक व्यक्तिगत मक्खी की अनुमानित लोहे की सामग्री दिखाते हैं, 0.64 मिलीग्राम / मक्खी के औसत वजन पर विचार करते हुए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
पशु ऊतकों में गैर-हीम लोहे की सामग्री के माप के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जो मूल रूप से Torrance और Bothwell5,6 द्वारा वर्णित बाथोफेनान्थ्रोलाइन-आधारित colorimetric परख के अनुकूलन का उपयोग करता है। विधि के महत्वपूर्ण चरण ऊतक नमूना सुखाने हैं; प्रोटीन विकृतीकरण और एसिड हाइड्रोलिसिस द्वारा अकार्बनिक लोहे की रिहाई; फेरिक (Fe3+) लौह राज्य (Fe2+) लौह राज्य (Fe2+) को कम करने वाले एजेंट थायोग्लाइकोलिक एसिड की उपस्थिति में कमी, और एक बाथोफेनान्थ्रोलाइन अभिकर्मक (क्रोमोजेन प्रतिक्रिया) के साथ इसकी प्रतिक्रिया; परिणामी लौह आयन / बाथोफेनान्थ्रोलाइन गुलाबी परिसर का अवशोषण पठन; और ऊतक लौह सामग्री की गणना।
वर्तमान काम से पता चलता है कि कैसे मूल cuvette-आधारित प्रोटोकॉल परख संवेदनशीलता से समझौता किए बिना, उच्च थ्रूपुट के लिए एक 96-अच्छी तरह से आधारित प्रारूप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से, यह अनुकूलन काफी समय की बचत के लिए अनुमति देता है क्योंकि: 1) मल्टीचैनल पिपेट्स के उपयोग के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेटों में क्रोमोजेन प्रतिक्रियाओं की एक बड़ी संख्या को एक साथ तैयार किया जा सकता है; और 2) absorbance रीडिंग नाटकीय रूप से एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते समय की तुलना में एक प्लेट रीडर में तेजी से कर रहे हैं. माइक्रोप्लेट-आधारित परख का एक और महत्वपूर्ण लाभ क्रोमोजेन प्रतिक्रिया मात्राओं का समायोजन है, जो अभिकर्मकों के साथ लागत को काफी हद तक कम कर देता है (विशेष रूप से बाथोफेनान्थ्रोलाइन अभिकर्मक के साथ)। पूरा प्रोटोकॉल 4 दिनों में पूरा किया जा सकता है। नमूना सुखाने (जो 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में प्रदर्शन करने पर 48 घंटे तक ले जा सकता है) और अम्लीय पाचन (जो आसानी से 20 घंटे के लिए रात भर किया जाता है) दो सबसे अधिक समय लेने वाले चरण हैं। नमूना सुखाने को माइक्रोवेव पाचन ओवन का उपयोग करके तेज किया जा सकता है जो सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला को पचाने, भंग करने, हाइड्रोलाइज़िंग या सुखाने में प्रयोगशाला उपयोग के लिए डिज़ाइन किया गया है। चूंकि अधिकांश ऊतक के नमूनों को 2.5 घंटे से कम समय में सुखाना संभव है, इसलिए कोई भी केवल 2 दिनों में पूरे प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर सकता है। हालांकि, क्योंकि एक माइक्रोवेव की क्षमता टेफ्लॉन कप की संख्या तक सीमित है जो इसे फिट कर सकती है, और क्योंकि कप को प्रत्येक उपयोग के बाद धोने और संदूषण की आवश्यकता होती है, उपयोगकर्ताओं को उच्च संख्या में नमूनों को संभालने पर 65 डिग्री सेल्सियस पर 24-अच्छी तरह से प्लेटों में नमूनों को सुखाने के लिए अधिक सुविधाजनक हो सकता है। ऊतकों को सुखाने के लिए आवश्यक समय अभी भी 65 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान का उपयोग करके कम किया जा सकता है; हालांकि, पिघलने के जोखिम के कारण प्लास्टिक सामग्री से बचा जाना चाहिए।
इससे पहले, Grundy et al.11 ने उस विधि का एक अनुकूलन विकसित किया था जिसमें पूरे परख को 96-अच्छी तरह से प्लेटों में किया जाता है, बिना किसी नमूना सुखाने के चरण को शामिल किए बिना। हालांकि, सूखे वजन के बजाय गीले वजन का उपयोग करके ऊतकों में धातुओं का माप ताजा और जमे हुए ऊतक नमूनों में हवा-सुखाने के माध्यम से वजन घटाने की परिवर्तनीय मात्रा से काफी प्रभावित होता है। इसलिए, ऊतक सूखे वजन के खिलाफ लोहे की सामग्री को सामान्य करने की सिफारिश की जाती है। यदि ऊतक सुखाने एक व्यवहार्य विकल्प नहीं है (उदाहरण के लिए, वसा ऊतक), तो यह सुझाव दिया जाता है कि परख नमूना संग्रह पर तुरंत किया जाता है, ताकि ताजा वजन का सटीक निर्धारण भंडारण कलाकृतियों से महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित न हो।
एसिड समाधान की संरचना को भी संबोधित किया गया था। मूल प्रोटोकॉल 5,6 के अनुसार, ऊतकों को हाइड्रोक्लोरिक एसिड और ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड से मिलकर एसिड मिश्रण के साथ पचाया जाता है। हालांकि, वर्तमान कार्य दर्शाता है कि अकेले 37% हाइड्रोक्लोरिक एसिड समान रूप से कुशल है, कम से कम जिगर और प्लीहा के नमूनों को पचाने के लिए।
स्टॉक आयरन मानक समाधान कार्बोनिल आयरन पाउडर का उपयोग करके तैयार किया जाता है, जो एक सस्ता और अत्यधिक शुद्ध लोहे का पाउडर है। यहां वर्णित दृष्टिकोण के बाद, 1.1169 मिलीग्राम Fe / mL (20 mM) वाले एक स्टॉक आयरन मानक समाधान तैयार किया गया था, जैसा कि बाद में एएएस द्वारा निर्धारित किया गया था। लोहे के अन्य स्रोतों (जैसे, लौह सल्फेट, लौह नाइट्रिलोट्रिएसीटेट) या वाणिज्यिक मानक समाधान का उपयोग स्टॉक आयरन मानक समाधान उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है, बशर्ते कि वास्तविक लोहे की एकाग्रता निर्धारित की जाती है, और परख रैखिकता की पुष्टि एक मानक वक्र प्रदर्शन करके की जाती है।
वर्तमान विधि का उपयोग करते हुए, विभिन्न प्रकार के पशु ऊतकों की गैर-हीम लोहे की सामग्री को सफलतापूर्वक मापा गया था। कृंतक ऊतकों (जिगर, प्लीहा, हृदय और अग्न्याशय), समुद्र बास जिगर, और पूरे ड्रोसोफिला के साथ प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम शामिल हैं। विधि को परिष्कृत विश्लेषणात्मक उपकरणों या महंगे बुनियादी ढांचे की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार अधिकांश प्रयोगशालाओं में आसानी से लागू किया जा सकता है। संक्षेप में, यहां वर्णित विधि को लोहे के होमियोस्टैसिस और लोहे से संबंधित विकारों के अध्ययन में व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है जो लोहे के अधिभार या कमी के प्रयोगात्मक पशु मॉडल को नियोजित करते हैं।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., परियोजना UIDB / 04293/2020 के तहत राष्ट्रीय फंड द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
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