Summary
여기서, 동물 조직에서 헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있는 간단하고 잘 확립된 비색 분석법을 사용한다.
Abstract
철분은 필수 미량 영양소입니다. 철분 과부하와 결핍 모두 인간에게 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절됩니다. 철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델의 사용은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다. 동물 조직에서 총 철 수준의 측정은 일반적으로 원자 흡수 분광법 또는 비 헴철과 바토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석으로 수행됩니다. 수년 동안, 비색 분석은 광범위한 동물 조직에서 비헴철 함량의 측정에 사용되어 왔다. 원자 흡수 분광법과는 달리, 적혈구에 포함 된 헤모글로빈에서 유래 한 헴철의 기여를 배제합니다. 또한 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않으므로 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 마지막으로, 비색 분석은 큐벳 기반이거나 마이크로플레이트 형식에 맞게 조정될 수 있으므로 더 높은 샘플 처리량이 가능합니다. 본 연구는 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 철분 수준의 변화를 검출하는데 적합한 잘 확립된 프로토콜을 제공한다.
Introduction
철분은 산소 수송, 에너지 생산 또는 DNA 합성과 같은 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 기능에 필요한 필수 미량 영양소입니다. 중요한 것은 철분 과잉과 철분 결핍 모두 인체 건강에 매우 해롭고 조직 철분 수치가 미세하게 조절된다는 것입니다. 비정상적인식이 철분 흡수, 철분 결핍식이 요법, 반복적 인 수혈 및 만성 염증은 전 세계 수십억 명의 사람들에게 영향을 미치는 철분 관련 장애의 일반적인 원인입니다1,2,3.
철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델은 철분 항상성의 전신 및 세포 조절과 관련된 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상시키는 데 도움이되었습니다4. 지난 이십 년 동안 이루어진 상당한 진전에도 불구하고, 많은 주요 측면은 여전히 애매하다. 앞으로 몇 년 동안 동물 조직의 총 철분 수준을 정확하게 측정하는 것은 철 생물학 분야의 연구를 발전시키는 중요한 단계로 남아있을 것입니다.
대부분의 실험실은 원자 흡수 분광법 (AAS), 유도 결합 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS) 또는 비 헴철과 바스토페난트롤린 시약의 반응을 기반으로 한 비색 분석법으로 조직 철분을 정량화합니다. 후자는 50 년 전에 Torrance와 Bothwell이 묘사 한 원래의 방법을 기반으로합니다.5,6. 이 방법의 변형이 바스토페난트롤린7의 대안으로 페로진을 사용하여 개발되었지만, 후자는 문헌에서 가장 널리 인용 된 발색 시약으로 남아 있습니다.
선택 방법은 종종 사용 가능한 전문 지식과 인프라에 달려 있습니다. AAS 및 ICP-MS가 더 민감하지만, 비색 분석은 다음과 같은 중요한 이점을 제시하기 때문에 널리 사용되고 있습니다 : i) 적혈구에 포함 된 헤모글로빈으로부터 유래 된 헴철의 기여를 배제합니다. ii) 정교한 분석 기술이나 고가의 장비가 필요하지 않습니다. iii) 원래의 큐벳-기반 분석은 마이크로플레이트 포맷에 적응될 수 있고, 더 높은 샘플 처리량을 허용한다. 이 연구에서 제시된 비색 접근법은 설치류에서 물고기 및 초파리에 이르기까지 철분 과부하 또는 철분 결핍의 다양한 실험 동물 모델에서 조직 비 헴 철분 수준의 변화를 정량화하는 데 일상적으로 사용됩니다. 여기서, 동물 조직에서 비헴철 함량을 측정하기 위한 프로토콜이 제공되며, 대부분의 실험실에서 구현하기 쉬운 단순하고 잘 확립된 비색 분석을 사용한다.
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Protocol
C57BL/6 마우스는 상업적으로 구입하였고, C57BL/6 배경8의 헵시딘-널(Hamp1-/-) 마우스는 소피 발론트(프랑스 코친인스티투트)로부터 일종의 선물이었다. 동물들은 표준 설치류 차우와 물에 자유롭게 접근 할 수있는 온도 및 조명 제어 환경에서 특정 병원체가없는 조건 하에서 i3S 동물 시설에 수용되었습니다. 유럽 농어(Dicentrarchus labrax)는 상업용 어류 농장에서 구입하여 ICBAS 동물 시설, 온도 및 조명 조절 환경에서 수용하고 표준 농어 사료로 매일 광고 리비툼을 공급했습니다. 척추 동물과 관련된 모든 절차는 i3S 동물 윤리위원회와 국가 당국 인 Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV)의 승인을 받았습니다. 상업용 시약, 장비 및 동물에 대한 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 용액 준비
참고: 모든 시약과 용액을 철이 없는 유리 제품 또는 일회용 플라스틱 제품으로 취급하고 준비하십시오. 철 오염의 위험으로 인해 금속 실험실 재료 (예 : 스테인레스 스틸 주걱)가 시약 또는 용액과 접촉하는 것을 허용하지 마십시오. 재사용 가능한 유리 제품은 철분이 없는지 확인하십시오. 재료를 적절한 실험실 세제로 30-60 분 동안 씻고, 탈 이온수로 헹구고, 탈이온수로 1:3으로 희석 된 37 % 질산 용액에 밤새 담그고, 탈이온수로 다시 헹구고, 건조시킵니다.
- 산 혼합물: 유리 병에 37% 염산 82.2 mL에 트리클로로아세트산 10 g을 첨가하고, 완전히 용해시키고, 탈이온수로 최종 부피를 100 mL로 조정한다. 사용 전에 흔들어 주십시오. 또는 조직 소화를 위해 37 % 염산 만 사용하십시오.
참고 : 용액은 짙은 갈색 유리 시약 병에 보관할 때 적어도 2 개월 동안 안정적입니다.
주의: 염산과 트리클로로아세트산은 부식성이 있으며, 농축된 형태는 독성 산성 증기를 방출합니다. 산을 취급 할 때 보호 복, 내화학성 장갑 및 화학 스플래시 고글을 항상 착용하십시오. 그들을 호흡하지 말고 흄 후드 아래에있는 동안 항상 산을 다루십시오. - 포화 아세트산나트륨: 유리병에 탈이온수 400mL에 무수 초산나트륨 228g을 넣고 실온에서 밤새 교반한다. 용액을 쉬게하고 하루 동안 침전시킵니다. 침전이 발생하지 않으면 소량의 아세트산 나트륨을 계속 첨가하십시오. 용액을 유리 병에 보관하십시오.
- 염색체 시약: 염색체 시약 1 mL를 준비하기 위해, 탈이온수 500 μL에 4,7-디페닐-1,10-페난트롤린 디술폰산 디소듐염 1 mg을 첨가하고, 농축된 티오글리콜산 10 μL(100%)를 첨가하고, 완전히 용해시킨다. 탈이온수로 최종 부피를 1 mL로 구성한다.
참고: 필요에 따라 염색체 시약을 준비하십시오. 용액은 빛으로부터 보호 될 때 1 개월 동안 안정적입니다. - 작동 염색체 시약 (WCR) : 5 부피의 포화 아세트산 나트륨과 5 부피의 탈 이온수에 염색체 시약 1 부피를 첨가하십시오.
참고 :이 솔루션은 사용 당일에 새로 준비해야합니다. - 스톡 철 표준 용액: 20 mM 원철 용액을 제조하기 위해, 111.5 mg의 카보닐 철 분말을 37% 염산 5,480 μL를 함유하는 250 mL 용적 플라스크에 넣는다. 실온에서 밤새 용해되도록 두십시오 (또는 끓는 수조에서 배양하십시오). 이어서, 용액을 탈이온수로 100 mL의 최종 부피로 구성한다.
참고: 표준 용액은 단단히 밀봉된 용기에 보관할 때 무기한으로 보관할 수 있습니다. - 작동 철 표준 용액 (WISS) : 탈이온수 500 μL에 37 % 염산 13.5 μL를 첨가하십시오. 스톡철 표준 용액 10 μL를 첨가하고 탈이온수(Fe/mL 11.169 μg, 200 μM, AAS로 측정)로 최종 부피를 1 mL로 구성한다.
참고 : 작업 용액은 사용 당일에 새로 준비해야합니다.
2. 샘플 건조
- 메스 블레이드로 무게 10-100mg의 조직 샘플을 자릅니다. 작은 파라필름 조각(신선한 무게)에 대한 분석적/정밀 균형으로 정확하게 무게를 재십시오.
- 플라스틱 핀셋을 사용하여 조직 조각을 24-웰 플레이트 (물 증발을 허용하도록 뚜껑을 벗김)에 놓고 65 °C의 표준 인큐베이터에서 48 시간 동안 건조시킵니다.
- 또는 조직 샘플을 건조하기 위해 실험실 전자 레인지 소화 오븐을 사용하십시오. 플라스틱 핀셋을 사용하여 칭량된 티슈 조각을 철분이 없는 테프론 컵에 넣고 전자레인지에서 건조시킵니다. 계측기의 사용 설명서에 따라 작동 매개변수를 설정합니다.
참고: 참고로, 특정 소화 오븐( 재료 표 참조)을 사용하여 간 샘플을 건조하기 위한 작동 파라미터는 표 1에 나와 있습니다. - 플라스틱 핀셋을 사용하여 각 건조 된 조직 조각을 분석 / 정밀 저울 내부의 작은 파라 필름 위에 놓고 정확하게 무게를 측정하십시오 (건조 중량).
3. 샘플 산성 소화
- 플라스틱 핀셋을 사용하여 건조된 각 조직 조각을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 산 혼합물 1 mL를 첨가하고 마이크로원심분리 튜브를 닫는다. 조직이 생략된 것을 제외하고는 동일한 방법으로 산 블랭크를 준비한다.
주의: 산 혼합물은 부식성이 있으며 독성 증기를 방출합니다. 산성 혼합물을 취급 할 때 보호 복, 내화학성 장갑 및 화학 스플래시 고글을 착용하십시오. 그것을 호흡하지 말고 흄 후드 아래에있는 동안 항상 그것을 다루십시오. - 마이크로원심분리 튜브를 20시간 동안 65°C의 인큐베이터에서 인큐베이션함으로써 조직을 소화시킨다.
- 실온으로 냉각한 후, 500 μL의 투명한(노란색) 산 추출물(상청액)을 플라스틱 팁이 장착된 마이크로피펫을 사용하여 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 명확한 상층액을 얻을 수 없다면, 짧은 원심분리 스핀을 수행하십시오.
주의: 상청액은 매우 산성입니다. 상층액을 취급 할 때 보호 복, 내화학성 장갑 및 화학 스플래시 고글을 착용하십시오. 흄 후드 아래에서 항상 다루십시오.
참고: 이 시점에서, 산 추출물은 비색 검정을 위해 즉시 사용되거나 추후 사용을 위해 -20°C에서 동결될 수 있다. 냉동된 샘플을 실온으로 완전히 해동하고 사용 전에 와류합니다.
4. 색상 개발
- 표 2에 나타낸 바와 같이 염색체 반응을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 준비하거나, 더 높은 처리량을 위해 평평한 바닥, 96-웰, 투명하고 처리되지 않은 폴리스티렌 마이크로플레이트 내로 직접 넣는다. 모든 반응 (산 블랭크, 표준 및 샘플)을 적어도 중복으로 준비하십시오.
- 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
5. 흡광도 판독
- 분광광도계 또는 플레이트 리더에서 탈이온수 기준치에 대해 535 nm의 파장에서 샘플 흡광도를 측정한다. 플레이트는 뚜껑을 닫거나 뚜껑을 덮지 않고 읽을 수 있습니다. 뚜껑이 달린 경우, 흡광도 판독에 방해가 되지 않도록 측정 직전에 뚜껑에서 산성 증기가 방출되어 형성된 응축을 제거하십시오.
참고: 탈이온수에 대해 판독된 산 블랭크의 광학 흡광도(참조)는 0.015 미만이어야 합니다. 표준 및 샘플의 광학 흡광도는 0.100과 1.000 사이이어야합니다. 철 함량이 매우 높거나 매우 낮은 샘플의 경우 산 추출물 (상청액) 및 diH2O의 부피를 조정해야 할 수도 있습니다 (표 2) : 흡광도가 1.0보다 큰 경우 더 작은 샘플 (상청액) 부피를 사용하십시오. 흡광도가 0.1보다 낮 으면 상층액을 더 많이 사용하십시오. 샘플 부피(Vsmp)는 각 샘플의 조직 철분 함량을 계산할 때 고려된다(단계 6 참조).
6. 조직 철분 함량의 계산
- 다음 방정식으로 비 헴 조직 철분 함량을 계산하십시오.
조직 철분(μg/g 건조 조직) =
AT = 시험 샘플의 흡광도
AB = 산성 블랭크의 흡광도
AS = 표준의 흡광도
Fes = WISS의 철 농도 (μg Fe/mL)
W = 건조 조직의 중량 (g)
Vsmp = 샘플 부피 (표 2의 상등액의 가변 부피가 mL로 변환됨)
Vf = 65°C에서 밤새 인큐베이션한 후 산 혼합물의 최종 부피 (mL의 산 부피 플러스 건조 조직 부피에 상응함; 샘플 중량이 유의하게 다르지 않은 경우, 1 mL≈ 일정한 부피를 가정함)
Vstd = 철 표준 부피(mL로 변환된 표 2의 WISS의 부피)
Vrv = 최종 반응 부피 (표 2의 총 부피를 mL로 환산)
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Representative Results
큐벳 대 96웰 마이크로플레이트 비교
Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 원래 기술된 바토페난트롤린 시약과의 반응에 의한 조직 비헴철의 측정은 흡광도 판독을 위한 분광광도계의 사용에 의존한다. 따라서, 염색체 반응에 사용되는 부피는 일반 분광 광도계 큐벳의 크기와 양립 가능하다. 본 연구는 마이크로플레이트 판독기에서 흡광도 측정을 위해 염색체 반응이 96-웰 마이크로플레이트에서 직접 제조되는 방법 적응을 설명하며, 더 작은 시약 부피를 요구하고 더 높은 처리량을 허용한다.
두 접근법의 감도를 비교하기 위해, 작동 철 표준 용액 (WISS)의 연속 희석이 초기에 제조되었고, 염색체 반응은 표 2에 표시된 바와 같이 1.5 mL 튜브 또는 96-웰 플레이트에서 조립되었다. 흡광도는 분광광도계(큐벳 포함) 또는 마이크로플레이트 판독기에서 각각 측정하였다. 두 가지 접근법으로 생성된 대표적인 표준 곡선은 도 1A에 도시되어 있다. 두 경우 모두에서, 선형성은 시험된 철 농도에 걸쳐 매우 높았다(마이크로플레이트 및 큐벳의 경우 각각 r2 = 0.9996 및 r2 = 0.9997).
주목할 만하게도, 11.169 μg의 Fe/mL를 함유하는 WISS가 사용되었다. 본 데이터는 더 낮은 철 농도가 표준을 준비하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 그러나 철분 농도가 높은 WISS를 사용하는 것은 분광 광도계의 선형 동적 감지 범위를 초과하는 흡광도 값을 유도하여 표준 곡선을 고원으로 만들 수 있으므로 권장하지 않습니다.
큐벳- 및 마이크로플레이트-기반 검정을 추가로 비교하기 위해, 비-헴철 함량을 총 55개의 마우스 조직 샘플(간, 비장, 심장, 폐, 골수)에서 측정하였다. 두 방법론 사이에 매우 높은 수준의 상관관계가 관찰되었고(r = 0.999, p< 0.0001), 이는 마이크로플레이트 기반 방법이 원래의 큐벳 기반 방법에 대한 유효한 대안임을 나타낸다(그림 1B).
마지막으로, 마우스 조직에서의 비헴철 수준은 염산과 트리클로로아세트산의 혼합물 (본래의 방법 설명에 따라) 또는 염산 단독으로, 동일한 조직으로부터 유래된 샘플을 산성 소화시킨 후 마이크로플레이트 기반 방법으로 정량화하였다. 매우 높은 상관관계가 관찰되었고(r=0.999, p< 0.0001, 도 1C), 트리클로로아세트산이 산 소화로부터 생략될 수 있음을 보여준다.
이하에 포함된 대표적인 결과는 96-웰 플레이트에서 샘플 흡광도를 측정함으로써 얻어졌다.
유전자 혈색소침착증의 마우스 모델에서 조직 비헴철 수준의 측정
바스토페난트롤린-기반 비색 검정을 사용하여, 비헴철 함량을 일반적으로 사용되는 마우스 균주 C57BL/6 및 헵시딘 녹아웃(Hamp1-/-) 마우스(C57BL/6 유전적 배경에서)로부터 다양한 조직(간, 비장, 심장 및 췌장)에서 결정하였다. 대표적인 철 수준은 그림 2에 묘사되어 있다. 헵시딘은 철 대사의 핵심 조절자이며 그 붕괴는 심한 간, 췌장 및 심장 철분 축적과 비장 철분 고갈과 함께 혈색소 침착과 같은 철 침착 표현형으로 이어집니다8.
실험 철 변조 후 농어 간에서 비 헴 철 수준의 측정
바스토페난트롤린-기반 비색 분석법을 사용하여, 비헴 철 수준은 건강한 간(대조군), 철분 처리(복강 내 경로를 통해 투여된 철 덱스트란 2mg) 및 빈혈(인과혈관에서 채취한 혈액의 2% v/w) 유럽 농어(Dicentrarchus labrax)의 간에서 결정되었다. 예상대로, 철분 처리 동물에서는 간 철분 수치가 크게 증가한 반면, 빈혈은 간 철분 저장소의 경미한 감소를 일으켰습니다(그림 3).
전체 초파리 멜라노가스터에서 비헴 철분 수치 측정
현재의 방법은 작은 체질량 (평균 체중은 남성과 여성의 경우 각각 0.6mg과 0.8mg)으로 인해 개별 초파리 파리에서 비 헴 철분 수준을 측정하는 데 적합하지 않지만 9, 풀링 된 파리와 함께 성공적으로 사용할 수 있습니다. 그림 4 는 야생형 오레곤-R 또는 말볼리오(Mvl) 녹아웃인 20마리의 전체 수컷 파리의 그룹에 대한 대표적인 비헴철 수준을 묘사한다. Mvl은 포유동물 SLC11A2 유전자의 상동체이며, 이는 2가 금속 수송체 1 (DMT1)이라고 불리는 단백질을 암호화하며, 그 유전 적 파괴는 철 결핍을 초래합니다10. 예상대로, Mlv 파리는 야생형에 비해 실질적으로 낮은 체내 비헴철 함량을 나타냈다.
| 힘 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 압력 (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시간 (분): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| 압력 시간 (탭) : | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 팬: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
표 1: 여기에 사용된 전자레인지 소화 오븐에서 간 건조를 위한 작동 파라미터.
| WCR (μL) | 산 혼합물 (μL) | 상청액(μL) | 위스(μL) | diH2O (μL) | 총 부피 (μL) | ||
| 1.5 mL 튜브 | 산성 블랭크 | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| 표준 | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| 견본 | 1000 | 변수 | 변수 | 1300 | |||
| 96웰 마이크로플레이트 | 산성 블랭크 | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| 표준 | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| 견본 | 150 | 변수 | 변수 | 195 |
표 2: 1.5 mL 튜브 또는 96-웰 플레이트에서 염색체 반응의 제조.
도 1: 큐벳- 또는 96-웰 마이크로플레이트-기반 비색 검정에 의한 비헴철의 결정. (A) 마이크로플레이트-(개방 사각형
) 및 큐벳-기반 (개방 삼각형 Δ) 검정에 대한 표준 곡선. (B) 간(고체 원), 비장(열린 원), 심장(고체 삼각형
), 폐(별
표) 및 골수(다이아몬드
)를 포함한 6개월 된 수컷 C57BL/6 마우스의 
55개 
조직 샘플에서 큐벳 기반 및 마이크로플레이트 기반 비헴철 수준 간의 상관관계. (c) 6개월된 수컷 마우스(간, 고체 원; 비장, 개방 원)로부터의 조직의 서브세트에서의 비헴철 수준은 염산과 트리클로로아세트산(HCl + C2HCl3O2) 또는 염산 단독(HCl)의 혼합물로 샘플을 산성 소화시킨 후 96-웰 마이크로플레이트 기반 분석법으로 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 바토페난트롤린-기반 비색 분석법에 의해 다양한 조직에서 결정된 비헴철 함량. 수컷 C57BL/6 야생형 마우스(개방 원 )와 수컷 헵시딘 결핍 Hamp1-/- 마우스의 간, 비장, 심장 및 췌장의 비헴철 수준은 C57BL/6 유전자 배경(개방 사각형 )에서 8주령에 목욕페난트롤린 기반 비색 분석법으로 측정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 실험적 철 변조에 따른 청소년 여성 유럽 농어의 간장 비헴 철분 수준. 철분 과부하는 철 덱스트란 2mg의 복강 내 투여에 의해 달성되는 반면, 빈혈은 꼬리 혈관에서 혈액의 2 % v / w의 철수에 의해 유도되었다. 간은 철분 처리 또는 혈액 수집 후 4일에 수집하였다. 대조 동물은 건강하고, 처리되지 않은 농어였다. 비-헴철 수준은 바토페난트롤린-기반 비색 검정으로 측정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 1개월령 초파리에서의 비헴철 수준, 바토페난트롤린-기반 비색 분석법으로 측정. 결과는 (A) 20 마리의 파리의 각 풀에서 비 헴 철 함량 또는 (B) 0.64 mg / fly의 평균 중량을 고려하여 각 개별 파리의 추정 철 함량을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동물 조직에서 헴철 함량의 측정을 위한 프로토콜이 제공되며, 원래 Torrance 및 Bothwell5,6에 의해 기술된 바토페난트롤린-기반 비색 분석법의 적응을 이용한다. 상기 방법의 중요한 단계는 조직 샘플 건조; 단백질 변성 및 산 가수분해에 의한 무기 철의 방출; 환원제 티오글리콜산의 존재 하에 철(Fe3+)철을 철 상태(Fe2+)로 환원시키고, 바토페난트롤린 시약과의 반응(염색체 반응); 생성된 철이온/바토페난트롤린 핑크 복합체의 흡광도 판독; 및 조직 철분 함량의 계산.
본 연구는 원래의 큐벳 기반 프로토콜이 분석 감도를 손상시키지 않고 더 높은 처리량을 위해 96-well 기반 형식으로 어떻게 적용될 수 있는지를 보여줍니다. 특히,이 적응은 상당한 시간 절약을 허용하기 때문에 : 1) 더 많은 수의 염색체 반응이 다중 채널 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트에서 동시에 준비 될 수 있습니다. 2) 흡광도 판독값은 분광광도계를 사용할 때보다 플레이트 리더에서 극적으로 더 빠릅니다. 마이크로플레이트 기반 분석의 또 다른 중요한 이점은 염색체 반응 부피의 조정이며, 이는 시약 (특히 바스토페난트롤린 시약과 함께)을 사용한 비용을 실질적으로 감소시킨다. 전체 프로토콜은 4 일 이내에 완료 될 수 있습니다. 샘플 건조 (65 °C의 오븐에서 수행 할 때 최대 48 시간이 걸릴 수 있음)와 산성 소화 (20 시간 동안 하룻밤 동안 편리하게 수행됨)는 가장 시간이 많이 걸리는 두 가지 단계입니다. 샘플 건조는 다양한 물질의 소화, 용해, 가수 분해 또는 건조에 실험실 사용을 위해 설계된 전자 레인지 소화 오븐을 사용하여 가속화 될 수 있습니다. 대부분의 조직 샘플을 2.5 시간 이내에 건조시킬 수 있기 때문에 단 2 일 만에 전체 프로토콜을 수행 할 수 있습니다. 그러나 마이크로파의 용량은 적합할 수 있는 테프론 컵의 수로 제한되기 때문에 컵은 매번 사용 후 세척 및 오염 제거가 필요하기 때문에 사용자는 많은 수의 샘플을 취급할 때 65°C의 24웰 플레이트에서 샘플을 건조하는 것이 더 편리하다는 것을 알 수 있습니다. 조직을 건조시키는 데 필요한 시간은 여전히 65°C 이상의 온도를 사용하여 감소될 수 있고; 그러나 플라스틱 재료는 녹을 위험이 있으므로 피해야합니다.
이전에, Grundy et al.11 은 샘플 건조 단계를 포함하지 않고 전체 분석이 96-웰 플레이트에서 수행되는 방법의 적응을 개발하였다. 그러나, 건조 중량 대신 습윤 중량을 사용하는 조직 내의 금속의 측정은 신선 및 냉동 조직 샘플 모두에서 공기 건조를 통한 가변적인 체중 감소량에 의해 유의하게 영향을 받는다12. 따라서 조직 건조 중량에 대해 철분 함량을 정상화하는 것이 좋습니다. 조직 건조가 실행 가능한 옵션(예를 들어, 지방 조직)이 아닌 경우, 검정이 샘플 수집 시 신속하게 수행되어 신선한 중량의 정확한 결정이 저장 아티팩트에 의해 유의하게 영향을 받지 않도록 하는 것이 좋습니다.
산 용액의 조성 또한 다루어졌다. 원래의 프로토콜 5,6에 따르면, 조직은 염산과 트리클로로 아세트산으로 구성된 산 혼합물로 소화됩니다. 그러나 현재의 연구는 37 % 염산 단독이 적어도 간과 비장 샘플을 소화하는 데 똑같이 효율적이라는 것을 보여줍니다.
원철 표준 용액은 저렴하고 매우 순수한 철 분말 인 카르보닐 철 분말을 사용하여 제조됩니다. 본원에 기재된 접근법에 따라, AAS에 의해 후속적으로 결정된 바와 같이, 1.1169 mg의 Fe/mL (20 mM)를 함유하는 원철 표준 용액을 제조하였다. 철의 다른 공급원 (예를 들어, 황산철, 철 니트릴로트리아세테이트) 또는 상업적 표준 용액은 실제 철 농도가 결정되고, 분석 선형성이 표준 곡선을 수행함으로써 확인되는 경우에 한해, 원철 표준 용액을 생성하는데 사용될 수 있다.
현재의 방법을 사용하여, 다양한 동물 조직의 비헴철 함량을 성공적으로 측정하였다. 설치류 조직 (간, 비장, 심장 및 췌장), 농어 간 및 전체 초파리로 얻은 대표적인 결과가 포함됩니다. 이 방법은 정교한 분석 도구 나 값 비싼 인프라를 필요로하지 않으므로 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 요약하면, 본원에 기재된 방법은 철분 과부하 또는 결핍의 실험 동물 모델을 채용하는 철 항상성 및 철 관련 장애의 연구에 널리 적용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 UIDB/04293/2020 프로젝트에 따라 FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.를 통해 National Fund가 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
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