Summary
Her er det gitt en protokoll for måling av ikke-heme jerninnhold i dyrevev, ved hjelp av en enkel, veletablert kolorimetrisk analyse som lett kan implementeres i de fleste laboratorier.
Abstract
Jern er en essensiell mikronæringsstoff. Både jernoverbelastning og mangel er svært skadelig for mennesker, og vevsjernnivået er fint regulert. Bruken av eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller mangel har vært medvirkende til å fremme kunnskap om mekanismene som er involvert i systemisk og cellulær regulering av jern homeostase. Måling av totale jernnivåer i dyrevev utføres vanligvis med atomabsorpsjonsspektroskopi eller med en kolorimetrisk analyse basert på reaksjonen av ikke-heme jern med et batofenanthroline reagens. I mange år har den kolorimetriske analysen blitt brukt til måling av ikke-heme jerninnholdet i et bredt spekter av dyrevev. I motsetning til atomabsorpsjon spektroskopi, utelukker det bidraget av heme jern avledet fra hemoglobin inneholdt i røde blodlegemer. Videre krever det ikke sofistikerte analytiske ferdigheter eller svært dyrt utstyr, og kan dermed enkelt implementeres i de fleste laboratorier. Til slutt kan den kolorimetriske analysen enten være cuvette-basert eller tilpasset et mikroplateformat, noe som gir høyere prøvegjennomstrømning. Det nåværende arbeidet gir en veletablert protokoll som er egnet for påvisning av endringer i vevsjernnivåer i en rekke eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller jernmangel.
Introduction
Jern er en essensiell mikronæringsstoff, som kreves for funksjonen av proteiner involvert i viktige biologiske prosesser som oksygentransport, energiproduksjon eller DNA-syntese. Det er viktig at både jernoverskudd og jernmangel er svært skadelig for menneskers helse, og vevsjernnivået er fint regulert. Unormal absorpsjon av kostholdsjern, jernmangel, gjentatte blodoverføringer og kronisk betennelse er vanlige årsaker til jernrelaterte lidelser som påvirker milliarder av mennesker over hele verden1,2,3.
Eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller mangel har vært medvirkende til å fremme vår kunnskap om mekanismene som er involvert i systemisk og cellulær regulering av jern homeostase4. Til tross for den betydelige fremgangen de siste to tiårene, er mange viktige aspekter fortsatt unnvikende. I de kommende årene vil nøyaktig måling av totale jernnivåer i dyrevev fortsatt være et kritisk skritt for å fremme forskning innen jernbiologifeltet.
De fleste laboratorier kvantifiserer vevsjern med enten atomabsorpsjonsspektroskopi (AAS), induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS), eller en kolorimetrisk analyse basert på reaksjonen av ikke-heme jern med et batofenanthroline reagens. Sistnevnte er basert på den opprinnelige metoden beskrevet av Torrance og Bothwell for over 50 år siden5,6. Mens en variasjon av denne metoden senere ble utviklet ved hjelp av ferrozin som et alternativ til badofenanthroline7, forblir sistnevnte det mest siterte kromogene reagenset i litteraturen.
Valgmetoden avhenger ofte av tilgjengelig kompetanse og infrastruktur. Mens AAS og ICP-MS er mer følsomme, forblir den kolorimetriske analysen mye brukt fordi den presenterer følgende viktige fordeler: i) den utelukker bidraget av hemejern avledet fra hemoglobin inneholdt i røde blodlegemer; ii) det krever ikke sofistikerte analytiske ferdigheter eller svært dyrt utstyr; og iii) den opprinnelige cuvette-baserte analysen kan tilpasses et mikroplateformat, noe som gir høyere prøvegjennomstrømning. Den kolorimetriske tilnærmingen som presenteres i dette arbeidet, brukes rutinemessig til å kvantifisere endringer i vevs ikke-heme jernnivåer i en rekke eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller jernmangel, fra gnagere til fisk og fruktflue. Her er en protokoll for måling av ikke-heme jerninnhold i dyrevev gitt, ved hjelp av en enkel, veletablert, kolorimetrisk analyse som de fleste laboratorier bør finne enkle å implementere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 mus ble kommersielt kjøpt og hepcidin-null (Hamp1−/−) mus på en C57BL/6 bakgrunn8 var en snill gave fra Sophie Vaulont (Institut Cochin, Frankrike). Dyr ble plassert på i3S dyreavdelingen under spesifikke patogenfrie forhold, i et temperatur- og lyskontrollert miljø, med fri tilgang til standard gnager chow og vann. Europeisk havabbor (Dicentrarchus labrax) ble kjøpt fra et kommersielt oppdrettsanlegg og plassert på ICBAS dyreanlegg, i et temperatur- og lyskontrollert miljø, og matet daglig ad libitum med standard havabborfôr. Alle prosedyrer som involverer virveldyr dyr ble godkjent av i3S Animal Ethics Committee og den nasjonale myndigheten, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (DGAV). Informasjon om kommersielle reagenser, utstyr og dyr er oppført i materiallisten.
1. Klargjøring av oppløsning
MERK: Håndter og forbered alle reagenser og løsninger med jernfritt glass eller engangsplast. Ikke la metalliske laboratoriematerialer (f.eks. spateler i rustfritt stål) komme i kontakt med noe reagens eller oppløsning, på grunn av risikoen for jernforurensning. Pass på at alle gjenbrukbare glassvarer er jernfrie. Vask materialene med passende laboratorievaskemiddel i 30-60 min, skyll med deionisert vann, suge over natten i en 37% salpetersyreoppløsning fortynnet 1:3 med deionisert vann, skyll igjen med deionisert vann og la det tørke.
- Syreblanding: Tilsett 10 g kloroacetisk syre til 82,2 ml 37% saltsyre i en glassflaske, oppløs grundig og juster det endelige volumet til 100 ml med deionisert vann. Rist før bruk. Alternativt kan du bare bruke 37% saltsyre for vevsfordøyelse.
MERK: Oppløsningen er stabil i minst 2 måneder når den oppbevares i mørkebrune glassreagensflasker.
FORSIKTIG: Saltsyre og trikloredsyre er etsende, og konsentrerte former frigjør giftige sure damper. Bruk verneplagg, kjemikaliebestandige hansker og kjemiske sprutbriller til enhver tid ved håndtering av syrer. Unngå å puste dem inn og håndter alltid syrer under en avtrekkshette. - Mettet natriumacetat: Tilsett 228 g vannfri natriumacetat til 400 ml deionisert vann i en glassflaske og rør over natten ved romtemperatur. La løsningen hvile og utfelle for en dag. Hvis det ikke oppstår nedbør, fortsett å legge til små mengder natriumacetat. Oppbevar oppløsningen i en glassflaske.
- Kromogenreagens: For å forberede 1 ml kromatogenreagens, tilsett 1 mg 4,7-difenyl-1,10-fenanthroline disulfonic acid disodium salt til 500 μL deionisert vann og 10 μL konsentrert (100%) tioglykolsyre, og oppløs grundig. Utgjør det endelige volumet til 1 ml med deionisert vann.
MERK: Forbered så mye kromatogenreagens som nødvendig. Løsningen er stabil i 1 måned når den er beskyttet mot lys. - Virkende kromatogenreagens (WCR): Tilsett 1 volum kromoogenreagens til 5 volumer mettet natriumacetat og 5 volumer deionisert vann.
MERK: Denne oppløsningen skal tilberedes fersk på bruksdagen. - Standardløsning for bestandsjern: For å lage en 20 mM bestandsjernløsning, plasser 111,5 mg karbonyljernpulver i en 250 ml volumetrisk kolbe som inneholder 5480 μL 37% saltsyre. La det oppløses over natten ved romtemperatur (eller inkubere i et kokende vannbad). Utgjør deretter løsningen til et endelig volum på 100 ml med deionisert vann.
MERK: Standardløsningen kan oppbevares på ubestemt tid når den oppbevares i et tett forseglet kar. - Arbeidsjern standardløsning (WISS): Tilsett 13,5 μL 37% saltsyre til 500 μL deionisert vann. Tilsett 10 μL av Stock Iron Standard Solution og utgjør det endelige volumet til 1 ml med deionisert vann (11,169 μg Fe/ml, 200 μM; målt ved AAS).
MERK: Arbeidsløsningen bør tilberedes fersk på bruksdagen.
2. Prøvetørking
- Klipp en prøve av vev som veier 10-100 mg med et skalpellblad. Vei den nøyaktig i en analytisk/presisjonsbalanse over et lite stykke parafilm (Fresh Weight).
- Bruk plast pinsett, plasser vevsstykket i en 24-brønns plate (uforlignelig for å tillate vannfordampning) og la det tørke på en standard inkubator ved 65 °C i 48 timer.
- Alternativt kan du bruke en laboratorie mikrobølgeovn fordøyelsesovn for tørking av vevsprøver. Bruk plast pinsett, plasser det veide vevet i en jernfri Teflon-kopp og tørk det i mikrobølgeovnen. Still inn betjeningsparametrene i henhold til instrumentets bruksanvisning.
MERK: Som referanse vises driftsparametere for tørking av leverprøver ved hjelp av den spesifikke fordøyelsesovnen (se Materialfortegnelse) i tabell 1. - Bruk plast pinsett, plasser hvert tørket stykke vev over et lite stykke parafilm inne i en analytisk / presisjonsbalanse og vei den nøyaktig (Tørrvekt).
3. Prøve sur fordøyelse
- Bruk plast pinsett, overfør hvert tørket stykke vev til et 1,5 ml mikrosenterrør.
- Tilsett 1 ml av syreblandingen og lukk mikrocentrifugerøret. Forbered en syre blank på samme måte, bortsett fra at vevet er utelatt.
FORSIKTIG: Syreblandingen er etsende og frigjør giftige damper. Bruk verneplagg, kjemikaliebestandige hansker og kjemiske sprutbriller når du håndterer syreblandingen. Unngå å puste den inn og håndter den alltid under en avtrekkshette. - Fordøye vevet ved å inkubere mikrocentrifugerørene i en inkubator ved 65 °C i 20 timer.
- Etter avkjøling til romtemperatur, overfør 500 μL av det klare (gule) syreekstraktet (supernatant) til et nytt 1,5 ml mikrosenterrør ved hjelp av en mikropipette utstyrt med plastspisser. Hvis det ikke er mulig å oppnå en klar supernatant, utfør et kort sentrifugeringsspinn.
FORSIKTIG: Supernatanten er svært sur. Bruk verneplagg, kjemikaliebestandige hansker og kjemiske sprutbriller når du håndterer supernatantene. Håndter dem alltid under en avtrekkshette.
MERK: På dette tidspunktet kan syreekstraktene umiddelbart brukes til den kolorimetriske analysen eller fryses ved -20 °C for senere bruk. Tin frosne prøver helt opp til romtemperatur og virvel dem før bruk.
4. Fargeutvikling
- Forbered kromoogenreaksjoner som angitt i tabell 2 i 1,5 ml mikrosenterrør eller, for høyere gjennomstrømning, direkte inn i den flate bunnen, 96-brønns, klare, ubehandlede polystyrenmikroplater. Forbered alle reaksjoner (syre blank, standard og prøve) minst i duplikat.
- Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
5. Absorbansavlesning
- Mål prøveabsorbering i et spektrofotometer eller en plateleser ved en bølgelengde på 535 nm mot en deionisert vannreferanse. Plater kan leses uforskannet eller lokket. I det lokkede tilfellet, fjern eventuell kondens dannet på grunn av frigjøring av syredamp fra lokket like før målingen for å unngå mulig interferens med absorbansavlesningen.
MERK: Den optiske absorbansen av syren blank les mot deionisert vann (referanse) bør være mindre enn 0,015; den optiske absorbansen av standarden og prøvene skal være mellom 0,100 og 1.000. For prøver med svært høyt eller svært lavt jerninnhold kan det hende at mengden syreekstrakt (supernatant) og diH2O må justeres (tabell 2): Hvis absorbansen er større enn 1,0, bruk et mindre prøvevolum (supernatant). Når absorbansen er lavere enn 0,1, bruk et høyere volum av supernatanten. Prøvevolum (Vsmp) tas i betraktning ved beregning av hver prøves vevsjerninnhold (se trinn 6).
6. Beregning av vev jern innhold
- Beregn ikke-heme vev jerninnhold med følgende ligning:
Vevsjern (μg/g tørt vev) =
AT = absorbans av testprøve
AB = absorbans av syre blank
AS = absorbans av standard
Fes = jernkonsentrasjon av WISS (μg Fe/ml)
W = vekt av tørt vev (g)
Vsmp = prøvevolum (variabelt volum supernatant i tabell 2 konvertert til ml)
Vf = endelig volum av syreblanding etter nattinkubasjon ved 65 °C (tilsvarende syrevolum pluss tørt vevsvolum i ml; hvis prøvevektene ikke varierer betydelig, anta et konstant volum ≈ 1 ml)
Vstd = jernstandardvolum (volum WISS i tabell 2 konvertert til ml)
Vrv = endelig reaksjonsvolum (Totalt volum i tabell 2 konvertert til ml)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cuvette versus 96-brønns mikroplatesammenligning
Måling av vev ikke-heme jern ved reaksjon med en bathophenanthroline reagens opprinnelig beskrevet av Torrance og Bothwell5,6 er avhengig av bruk av et spektrofotometer for absorbansavlesning. Derfor er volumene som brukes i kromatogenreaksjonen kompatible med størrelsen på en vanlig spektrofotometerklinatt. Det nåværende arbeidet beskriver en metodetilpasning der kromoogenreaksjonene fremstilles direkte i en 96-brønns mikroplate for absorbansmåling i en mikroplateleser, som krever mindre reagensvolumer og tillater høyere gjennomstrømning.
For å sammenligne følsomheten til begge tilnærmingene ble det i utgangspunktet utarbeidet en seriell fortynning av arbeidsjernsstandardløsningen (WISS), og kromoogenreaksjonene ble montert enten i 1,5 ml rør eller i 96-brønnsplater, som angitt i tabell 2. Absorbans ble målt i et spektrofotometer (med cuvette) eller i en mikroplateleser. Representative standardkurver generert med de to tilnærmingene er avbildet i figur 1A. I begge tilfeller var lineariteten svært høy (r2 = 0,9996 og r2 = 0,9997 for henholdsvis mikroplate og cuvette) på tvers av de testede jernkonsentrasjonene.
Bemerkelsesverdig ble det brukt en WISS som inneholder 11,169 μg Fe/ml. De nåværende dataene viser at lavere jernkonsentrasjoner kan brukes til å forberede standarden. Imidlertid anbefales det ikke å bruke en WISS med høyere jernkonsentrasjoner, da dette kan føre til absorberingsverdier som overskrider spektrofotometerets lineære dynamiske deteksjonsområde, noe som forårsaker standardkurver til platå.
For ytterligere å sammenligne cuvette- og mikroplatebaserte analyser ble ikke-heme jerninnhold målt i totalt 55 musevevsprøver (lever, milt, hjerte, lunge, benmarg). Det ble observert en svært høy grad av korrelasjon mellom de to metodene (r = 0,999, p < 0,0001), noe som indikerer at den mikroplatebaserte metoden er et gyldig alternativ til den opprinnelige cuvettebaserte metoden (figur 1B).
Til slutt ble ikke-heme jernnivåer i musevev kvantifisert med den mikroplatebaserte metoden etter sur fordøyelse av prøver avledet fra samme vev med enten en blanding av saltsyre og kloroacetisk syre (i henhold til den opprinnelige metodebeskrivelsen) eller saltsyre alene. En svært høy korrelasjon ble observert (r = 0,999, p < 0,0001, figur 1C), som viser at trikloredsyre kan utelates fra syrefordøyelsen.
De representative resultatene nedenfor ble oppnådd ved å måle prøveabsorbering i 96-brønnsplater.
Måling av vev ikke-heme jern nivåer i en musemodell av genetisk hemokromatose
Ved hjelp av den batofenantropinbaserte kolorimetriske analysen ble ikke-heme jerninnhold bestemt i ulike vev (lever, milt, hjerte og bukspyttkjertel) fra den ofte brukte musestammen C57BL/6 og fra hepcidin knockout (Hamp1-/-) mus (i en C57BL/6 genetisk bakgrunn). Representative jernnivåer er avbildet i figur 2. Hepcidin er en nøkkelregulator for jernmetabolisme, og dens forstyrrelser fører til en hemokromatoselignende jernavsetningsfenotype, med alvorlig lever-, bukspyttkjertel- og hjertejernakkumulering, og miltisk jernuttømming8.
Måling av ikke-heme jernnivåer i sjøabborlever etter eksperimentell jernmodulering
Ved hjelp av den batofenantropinbaserte kolorimetriske analysen ble ikke-heme jernnivåer bestemt i leveren av sunn (kontroll), jernbehandlet (2 mg jerndekstran administrert via intraperitonealruten) og anemisk (2% v / w blod trukket fra kaudale kar) europeisk havabbor (Dicentrarchus labrax). Som forventet økte leverjernsnivåene massivt hos jernbehandlede dyr, mens anemi forårsaket en mild reduksjon i leverjernsbutikkene (figur 3).
Måling av ikke-heme jern nivåer i hele Drosophila melanogaster
Selv om den nåværende metoden ikke er hensiktsmessig for å måle ikke-heme jernnivåer i individuelle Drosophila-fluer på grunn av deres lille kroppsmasse (gjennomsnittlig vekt er 0,6 mg og 0,8 mg for henholdsvis menn og kvinner)9, kan den med hell brukes med samlede fluer. Figur 4 viser representative ikke-heme jernnivåer for grupper på 20 hele mannlige fluer, enten wild-type Oregon-R eller Malvolio (Mvl) knockout. Mvl er homologen til pattedyret SLC11A2-genet, som koder for et protein som kalles divalent metalltransportør 1 (DMT1), og dets genetiske forstyrrelse fører til jernmangel10. Som forventet presenterte Mlv fluer et vesentlig lavere kropps ikke-heme jerninnhold sammenlignet med wild-type.
| Strøm 650 W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Trykk (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Tid (min): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Tid ved trykk (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| VIFTE: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabell 1: Driftsparametere for levertørking i mikrobølgeovn som brukes her.
| WCR (μL) | Syreblanding (μL) | Supernatant (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Totalt volum (μL) | ||
| 1,5 ml rør | Syre Tom | 1000 | 150 | 150 | 1300 | ||
| Standard | 1000 | 150 | 150 | 1300 | |||
| Eksempel | 1000 | Variabel | Variabel | 1300 | |||
| 96-brønns mikroplate | Syre Tom | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | ||
| Standard | 150 | 22.5 | 22.5 | 195 | |||
| Eksempel | 150 | Variabel | Variabel | 195 |
Tabell 2: Fremstilling av kromoogenreaksjoner i enten 1,5 ml rør eller 96-brønnsplater.
Figur 1: Bestemmelse av ikke-heme jern av cuvette- eller 96-brønns mikroplatebaserte kolorimetriske analyser. (A) standardkurver for mikroplate- (åpne firkanter
) og cuvettebaserte (åpne trekanter Δ) analyser. (B) Korrelasjon mellom cuvette-baserte og mikroplatebaserte ikke-heme jernnivåer i 55 vevsprøver fra 6 måneder gamle mannlige C57BL/6 mus, inkludert lever (faste sirkler
), milt (åpne sirkler
), hjerte (faste trekanter
), lunge (stjerner 
) og benmarg (diamanter 
). (C) ikke-heme jern nivåer i en undergruppe av vev fra 6 måneder gamle mannlige mus (lever, faste sirkler ; milt, åpne sirkler ) målt med 96-brønns mikroplatebasert analyse etter sur fordøyelse av prøver med en blanding av saltsyre og trikloredsyre (HCl + C2HCl3O2) eller saltsyre alene (HCl). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Ikke-heme jerninnhold bestemt i ulike vev ved batofenantropinbasert kolorimetrisk analyse. Ikke-heme jern nivåer i leveren, milten, hjertet og bukspyttkjertelen av mannlige C57BL /6 wild-type mus (åpne sirkler ) og mannlige hepcidin-mangelfull Hamp1-/- mus på C57BL/6 genetisk bakgrunn (åpne firkanter ) i en alder av 8 uker, målt med batofenanthroline-basert kolorimetrisk analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lever ikke-heme jernnivåer i ung kvinnelig europeisk havabbor etter eksperimentell jernmodulering. Jernoverbelastning ble oppnådd ved intraperitoneal administrering av 2 mg jern dextran, mens anemi ble indusert ved tilbaketrekking av 2% v / w blod fra kaudale kar. Lever ble samlet inn 4 dager etter jernbehandling eller blodinnsamling. Kontrolldyr var sunn, ubehandlet havabbor. Ikke-heme jernnivåer ble målt med den batofenanthroline-baserte kolorimetriske analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ikke-heme jernnivåer i 1 måned gamle Drosophila, målt med den batofenanthroline-baserte kolorimetriske analysen. Resultatene viser (A) ikke-heme jerninnholdet i hvert basseng med 20 fluer eller (B) det estimerte jerninnholdet i hver enkelt flue, med tanke på en gjennomsnittlig vekt på 0,64 mg / fly. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En protokoll for måling av ikke-heme jerninnhold i dyrevev er gitt, ved hjelp av en tilpasning av den batofenanthroline-baserte kolorimetriske analysen opprinnelig beskrevet av Torrance og Bothwell5,6. De kritiske trinnene i metoden er vevsprøvetørking; protein denaturering og frigjøring av uorganisk jern ved syrehydrolyse; reduksjon av jern (Fe3+) jern til jerntilstanden (Fe2+) i nærvær av reduksjonsmiddelet thioglykolsyre, og reaksjonen med et batofenanthroline reagens (kromatogenreaksjon); absorbansavlesning av det resulterende jernholdige ion / batofenanthroline rosa komplekset; og beregning av vevsjerninnhold.
Det nåværende arbeidet viser hvordan den opprinnelige cuvettebaserte protokollen kan tilpasses et 96-brønns format for høyere gjennomstrømning, uten at det går ut over analysefølsomheten. Spesielt gir denne tilpasningen betydelig tidsbesparelse siden: 1) et større antall kromoogenreaksjoner kan fremstilles samtidig i 96-brønnplater ved bruk av flerkanals pipetter; og 2) absorbansavlesninger er dramatisk raskere i en plateleser enn når du bruker et spektrofotometer. En annen viktig fordel med den mikroplatebaserte analysen er justeringen av kromoogenreaksjonsvolumene, noe som reduserer kostnadene betydelig med reagenser (spesielt med badeofenanthroline reagenset). Hele protokollen kan fullføres om 4 dager. Prøvetørking (som kan ta opptil 48 timer når den utføres i en ovn ved 65 °C) og sur fordøyelse (som enkelt utføres over natten i 20 timer) er de to mest tidkrevende trinnene. Prøvetørking kan akselereres ved hjelp av en mikrobølgeovn som er beregnet for laboratoriebruk i fordøyelse, oppløsning, hydrolyzing eller tørking av et bredt spekter av materialer. Siden det er mulig å tørke de fleste vevsprøver på mindre enn 2,5 timer, kan man utføre hele protokollen på bare 2 dager. Men fordi kapasiteten til en mikrobølgeovn er begrenset til antall teflonkopper som den kan passe, og fordi koppene trenger vask og dekontaminering etter hver bruk, kan brukerne finne det mer praktisk å tørke prøver i 24-brønnsplater ved 65 °C ved håndtering av et høyt antall prøver. Tiden det tar å tørke vevet kan fortsatt reduseres ved å bruke temperaturer over 65 °C; Plastmateriale må imidlertid unngås på grunn av risikoen for smelting.
Tidligere hadde Grundy et al.11 utviklet en tilpasning av metoden der hele analysen utføres i 96-brønnsplater, uten å inkludere et prøvetørkingstrinn. Imidlertid påvirkes målingen av metaller i vev ved hjelp av våt vekt i stedet for tørrvekt betydelig av den variable mengden vekttap gjennom lufttørking både i friske og frosne vevsprøver12. Derfor anbefales det å normalisere jerninnholdet mot vev tørr vekt. Hvis vevstørking ikke er et levedyktig alternativ (f.eks. fettvev), foreslås det at analysen utføres raskt ved prøvetaking, slik at nøyaktig bestemmelse av den friske vekten ikke påvirkes betydelig av lagringsartefakter.
Sammensetningen av syreoppløsningen ble også adressert. I henhold til den opprinnelige protokollen5,6 fordøyes vev med en syreblanding som består av saltsyre og trikloredsyre. Imidlertid viser det nåværende arbeidet at 37% saltsyre alene er like effektiv, i det minste for å fordøye lever- og miltprøver.
Lagerjernsstandardløsningen fremstilles ved hjelp av karbonyljernpulver, som er et billig og svært rent jernpulver. Etter tilnærmingen som er beskrevet her, ble det utarbeidet en standardløsning for bestandsjern som inneholder 1,1169 mg Fe/ml (20 mM), som senere bestemt av AAS. Andre kilder til jern (f.eks. jernsulfat, jernnitlotriacetat) eller kommersielle standardløsninger kan brukes til å generere bestandsjernsstandardløsningen, forutsatt at den faktiske jernkonsentrasjonen bestemmes, og analyse linearitet bekreftes ved å utføre en standardkurve.
Ved hjelp av den nåværende metoden ble ikke-heme jerninnholdet i en rekke dyrevev vellykket målt. Representative resultater oppnådd med gnagervev (lever, milt, hjerte og bukspyttkjertel), havabborlever og hele drosophila er inkludert. Metoden krever ikke sofistikerte analyseverktøy eller dyr infrastruktur, og kan dermed enkelt implementeres i de fleste laboratorier. Oppsummert kan metoden som er beskrevet her, brukes mye i studier av jern homeostase og jernrelaterte lidelser som bruker eksperimentelle dyremodeller av jernoverbelastning eller mangel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Funds gjennom FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under prosjektet UIDB/04293/2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well UV transparent plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Analytical balance | Kern | ABJ 220-4M | |
| Anhydrous sodium acetate | Merck | 106268 | |
| Bathophenanthroline sulfonate (4,7-Diphenyl-1,10-phenantroline dissulfonic acid) | Sigma-Aldrich | B1375 | |
| C57BL/6 mice (Mus musculus) | Charles River Laboratories | ||
| Carbonyl iron powder, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 44890 | |
| Disposable cuvettes in polymethyl methacrylate (PMMA) | VWR | 634-0678P | |
| Double distilled, sterile water | B. Braun | 0082479E | |
| Fluorescence microplate reader | BioTek Instruments | FLx800 | |
| Hydrochloric acid, 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Microwave digestion oven and white teflon cups | CEM | MDS-2000 | |
| Nitric acid | Fisher Scientific | 15687290 | |
| Oven | Binder | ED115 | |
| Rodent chow | Harlan Laboratories | 2014S | Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet containing 175 mg/kg iron |
| Sea bass (Dicentrarchus labrax) | Sonrionansa | ||
| Sea bass feed | Skretting | L-2 Alterna 1P | |
| Single beam UV-Vis spectrophotometer | Shimadzu | UV mini 1240 | |
| Thioglycolic acid | Merck | 100700 | |
| Trichloroacetic acid | Merck | 100807 |
References
- Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
- Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294 (2019).
- Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T.
- Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872 (2020).
- Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
- Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
- Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
- Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
- Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297 (2010).
- Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F.
- Grundy, M. A., Gorman, N., Sinclair, P. R., Chorney, M. J., Gerhard, G. S. High-throughput non-heme iron assay for animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 59, 195-200 (2004).
- Adrian, W. J., Stevens, M. L. Wet versus dry weights for heavy metal toxicity determinations in duck liver. Journal of Wildlife Diseases. 15, 125-126 (1979).
