Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

طرق زراعة اللولبيات من مجمع بوريليا بورغدورفيري سينسو لاتو وحمى الانتكاس بوريليا

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

الثقافة في المختبر هي طريقة للكشف المباشر عن وجود البكتيريا الحية. يصف هذا البروتوكول طرق استزراع اللولبيات البوريليا المتنوعة، بما في ذلك تلك الخاصة بمجمع بوريليا بورغدورفيري بالمعنى الواسع للكلمة، وأنواع بوريليا الحمى الانتكاسية، وبوريليا مياموتوي. هذه الأنواع سريعة وبطيئة النمو ولكن يمكن استزراعها.

Abstract

يتكون Borrelia من ثلاث مجموعات من الأنواع ، تلك الخاصة بمجموعة Lyme borreliosis (LB) ، والمعروفة أيضا باسم B. burgdorferi sensu lato (s.l.) وأعيد تصنيفها مؤخرا إلى Borreliella ، ومجموعة الحمى الانتكاسية (RF) Borrelia ، ومجموعة ثالثة مرتبطة بالزواحف من اللولبيات. تظل الأساليب القائمة على الثقافة هي المعيار الذهبي للكشف المختبري عن الالتهابات البكتيرية لكل من البحث والعمل السريري ، حيث أن زراعة مسببات الأمراض من سوائل أو أنسجة الجسم تكتشف مباشرة تكاثر مسببات الأمراض وتوفر مادة مصدر للبحث. Borrelia و Borreliella spirochetes هي سريعة وبطيئة النمو ، وبالتالي لا يتم استزراعها عادة للأغراض السريرية. ومع ذلك ، فإن الثقافة ضرورية للبحث. يوضح هذا البروتوكول المنهجية والوصفات المطلوبة للنجاح في استزراع اللولبيات LB و RF ، بما في ذلك جميع الأنواع المعترف بها من مجمع B. burgdorferi s.l. بما في ذلك B. afzelii ، B. americana ، B. andersonii ، B. bavariensis ، B. bissettii / bissettiae ، B. burgdorferi sensu stricto (s.s.) ، B. californiensis ، B. carolinensis ، B. chilensis ، B. finlandensis ، B. garinii ، B. japonica ، B. kurtenbachii ، B. lanei ، B. lusitaniae ، B. maritima، B. mayonii، B. spielmanii، B. tanukii، B. turdi، B. sinica، B. valaisiana، B. yangtzensis، و RFspirochetes، B. anserina، B. coriaceae، B. crocidurae، B. duttonii، B. hermsii، B. hispanica، B. persica، B. recurrentis، و B. miyamotoi. الوسيلة الأساسية لزراعة اللولبيات LB و RF هي وسط Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II أو BSK-H) ، والذي يدعم بشكل موثوق نمو اللولبيات في الثقافات الراسخة. لتكون قادرة على زراعة عزلات بوريليا المعزولة حديثا من العينات المشتقة من القراد أو المضيف حيث يكون عدد spirochete الأولي منخفضا في اللقاح ، يفضل استخدام وسط Kelly-Pettenkofer المعدل (MKP). تدعم هذه الوسيلة أيضا نمو B. miyamotoi. يعتمد نجاح زراعة اللولبيات RF أيضا بشكل حاسم على جودة المكونات.

Introduction

Borrelia هو جنس من البكتيريا spirochete التي تشمل ثلاث مجموعات رئيسية: مجموعة Lyme borreliosis (LB) ، ومجموعة الحمى الانتكاسية (RF) ، ومجموعة أقل تميزا على ما يبدو تقتصر على الزواحف. تصنيف بوريليا في حالة تغير مستمر مع ظهور المنهجيات الجزيئية التي تسمح بمقارنات الجينوم والبروتين ، كما هو الحال في معظم المجموعات التصنيفية الأخرى1،2،3،4،5،6،7. يطلق على مجموعة LB (وتسمى أيضا مجموعة مرض لايم) تقليديا اسم Borrelia burgdorferi sensu lato بعد عضوها الأفضل تميزا Borrelia burgdorferi بالمعنى الضيق. تستخدم هذه الورقة المصطلحات الأكثر استخداما حاليا: LB و RF والمجموعة المرتبطة بالزواحف ، وتصف بروتوكولات الاستزراع لمجموعات LB و RF.

كما هو متوقع لأحد أفراد عائلة Spirochaetaceae ، يمكن أن تتبنى Borrelia الشكل الحلزوني الطويل والرقيق المميز ، وعادة ما يكون طوله 20-30 ميكرومتر وعرضه 0.2-0.3 ميكرومتر. ومع ذلك ، فإن خلايا Borrelia متعددة الأشكال للغاية ويمكن أن تتبنى العديد من الأشكال الأخرى في كل من الثقافة وفي الجسم الحي 1,8 نتيجة لتركيبها الخلوي والجيني المعقد. في شكله اللولبسي ، ينتج مورفولوجيا الموجة الجيبية المستوية عن دوران السوط الداخلي المحوري في الفضاء المحيطي بين الأغشية الداخلية والخارجية. يتيح هذا الهيكل للخلايا أن تكون شديدة الحركة ، حيث يحتوي الغشاء الخارجي على بروتينات تمكن الخلية من التفاعل مع الأنسجة المضيفة 9,10. يتم تنظيم التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي بإحكام ولا يؤثر فقط على غزو أنسجة المضيف ولكن أيضا على التفاعل مع الجهاز المناعي المضيف11. يسمح هذا التعبير الجيني المعقد لخلايا بوريليا بالتنقل بين البيئات المختلفة جدا لمضيفات الفقاريات ونواقل اللافقاريات. جينوم بوريليا غير عادي بين بدائيات النوى ، ويتكون من كروموسوم خطي وليس دائري. بالإضافة إلى الكروموسوم الخطي ، تحتوي أنواع Borrelia على 7-21 بلازميدات ، بعضها خطي وبعضها دائري. تحتوي البلازميدات على غالبية الجينات اللازمة لتكيف المضيف وضراوته ، ويعتقد أن البلازميدات الدائرية المشتقة من النبوءات مسؤولة عن غالبية تدفق الجينات الأفقي بين الخلايا اللولبية12,13. تمشيا مع دور في تكيف المضيف ، يفقد بعض ، وربما العديد أو كل ، أعضاء مجموعة Lyme borreliosis البلازميدات في الثقافة14. تحتوي أفضل سلالة "متكيفة مختبريا" تمت دراستها من B. burgdorferi ، B31 ، على سبعة فقط من البلازميدات التسعة الموجودة في العزلات البرية لهذا النوع15. وبالمثل ، يفقد B. garinii البلازميدات في الثقافة16. أظهرت بعض الدراسات أن أنواع RF و B. miyamotoi تحتفظ بالبلازميدات عند استزراعها 14،17 ، لكن العمل الحديث يوضح تغير البلازميدات والعدوى مع الزراعة المختبرية طويلة الأجل18.

تظل الطرق القائمة على الثقافة هي المعيار الذهبي للكشف المختبري عن الالتهابات البكتيرية ، لكل من البحث والعمل السريري14,17. تكتشف ثقافة مسببات الأمراض من سوائل أو أنسجة الجسم بشكل مباشر تكاثر مسببات الأمراض وتوفر مادة مصدر للبحث14,17. يوضح هذا البروتوكول المنهجية والوصفات المطلوبة لاستزراع اللولبيات بنجاح لمجموعة LB وكذلك RF Borrelia و B. miyamotoi. الوسيلة الأساسية لزراعة اللولبيات Borrelia هي وسط Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II أو BSK-H المتاح تجاريا) ، مع أو بدون مضادات حيوية لتقليل نمو بدائيات النوى الملوثة. تم تكييف هذه الوسيلة من وسيط يستخدم في الأصل لدعم RF Borrelia19 ، وتم تعديله بواسطة Stoenner20 ثم بواسطة Barbour21. تم تطوير العديد من التعديلات منذ ذلك الحين ، ولكل منها تأثيرات على فسيولوجيا البكتيريا التي يمكن أن تؤثر على النمو والعدوى والإمراضية22. تدعم هذه الوسيلة بشكل موثوق نمو اللولبيات في الثقافات الراسخة وقد استخدمت لعزل اللولبيات من القراد والثدييات والعينات السريرية23. يمكن أن يوفر الشكل الذي تم تطويره مؤخرا ، وهو وسيط Kelly-Pettenkofer (MKP) المعدل ، نجاحا أفضل في العزل ، والتشكل ، والحركة عند عزل عزلات Borrelia الجديدة من العينات البيئية ، عندما يكون عدد اللولبيات الموجودة في العينة المتاحة لبذر الثقافة منخفضا23,24. وفي جميع الحالات، يعتمد نجاح الزراعة بشكل حاسم على الوسط الطازج واستخدام المكونات المناسبة؛ لا تنتج جميع المكونات التجارية وسطا عالي الجودة. يمكن تحضين المزارع الملقحة بسهولة دون اهتزازها في حاضنة تقليدية 32-34 درجة مئوية في وجود كمية صغيرة من الأكسجين المحيط المتبقي. Borrelia spirochetes هي لاهوائية ولكنها تتعرض بطبيعتها لتقلبات في تركيزات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون وتستجيب للتغيرات في التعبير الجيني26،27،28،29. وبالتالي ، يجب أن يتحكم التعبير الجيني والنمو والدراسات الأيضية الأخرى في مستويات الأكسجين وثاني أكسيد الكربون باستخدام حاضنة يتحكم فيها الأكسجين أو غرفة لاهوائية. في الثقافة ، يتم فحص الثقافات أسبوعيا ، أو في كثير من الأحيان ، بحثا عن وجود اللولبيات إما باستخدام المجهر المظلم أو الفحص المجهري لتباين الطور. يمكن تلطيخ مسحات الثقافة إما بالبقع الفضية أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية أو من خلال استخدام سلالات موسومة بالفلورسنت29,30. PCR متبوعا بتسلسل الحمض النووي هو طريقة حساسة ومحددة للكشف عن أنواع Borrelia 30،31،32،33 وتحديدها وراثيا أو تأكيدها.

توجد العديد من الاختلافات الطفيفة على BSK-II ، وبعضها متاح تجاريا. تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا في القسم 1 من Barbour (1984)21. وسيط MKP السائل هو وسيط تم تطويره مؤخرا ويتم وصفه في القسم 2. يتم إعداده وفقا للبروتوكول33,34 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا ، والذي يتكون ، على غرار وسيط BSK ، من خطوتين: إعداد الوسيط الأساسي وإعداد الوسط الكامل. يمكن تحضير وسط استزراع البوريليا بالمضادات الحيوية أو بدونها ، كما هو موضح في القسم 3 ؛ تعمل المضادات الحيوية على الحد من البكتيريا الملوثة التي يتم إدخالها عند التلقيح بعينات سريرية أو بيئية ، كما هو موضح في القسم 4 ؛ في حالة التلقيح باستخدام ثقافة Borrelia sp. النقية ، قد لا تكون هناك حاجة إلى المضادات الحيوية. غالبا ما يكون صنع أسهم Borrelia طويلة الأجل أمرا مهما ، ويتم وصف بروتوكول للقيام بذلك في القسم 5. يصف القسم 6 استخدام هذه الوسائط لعزل استنساخ Borrelia sensu lato النقي من العينات السريرية أو البيئية. هناك عدد من النهج الممكنة36 ؛ أدناه هو واحد وجد أن تكون فعالة. وسيط الطلاء المستخدم في هذا البروتوكول هو تعديل لوسط الطلاء BSK-II37 و MKPالمتوسط 34 (مع زيادة مصل الأرانب إلى 10٪ 38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي تنطوي على عينات تم الحصول عليها من موضوع بشري من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة و / أو المرفق الطبي ذي الصلة ، وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المشاركين قبل جمع العينات. تمت الموافقة على جميع الدراسات التي تنطوي على عينات تم الحصول عليها من الحيوانات وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية. وحيثما كان ذلك مناسبا، تم الحصول على موافقات لأخذ عينات بيئية.

ملاحظة: يعتمد نجاح الثقافة بشكل حاسم على جودة المكونات. يتوفر وسيط BSK التجاري ويدعم بقوة نمو B. burgdorferi النقي المكيف مختبريا والأنواع ذات الصلة حيث يمكن استخدام جرعة عالية من اللقاح لزرع الثقافة. بالنسبة لعزلات السلالات من المواد البيولوجية الأولية ، يفضل استخدام الوسط الطازج وغالبا ما يكون ضروريا.

Borrelia sp. هي مسببات الأمراض المعروفة أو المشتبه بها ، ويمكن أن تكون الأنسجة البشرية أو الحيوانية غير المفحوصة أيضا خطرا بيولوجيا. يتطلب التعامل مع المواد التي يحتمل أن تكون معدية معدات حماية شخصية وتقنية معقمة لسلامة المحقق. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوسط غني بالمغذيات بحيث تتلوث الثقافة بسهولة. ويكون احتواء مستوى السلامة الأحيائية 2 مطلوبا عموما لهذا العمل وينبغي إجراء جميع الأعمال مع Borrelia sp. أو العينات في خزانة السلامة البيولوجية.

1. تعليمات لجعل BSK-II المتوسطة

  1. إعداد وسيط BSK-II كامل
    1. الحصول على الكواشف لتحضير 1 لتر من الوسط ، كما هو موضح في الجدول 1.
      ملاحظة: نقاء BSA (أو نقص النقاء) أمر بالغ الأهمية للنمو الأمثل. على وجه الخصوص ، يختلف نقاء BSA بين كل من الشركة المصنعة والكثير. يرجى الاطلاع على الجدول 2 للحصول على قائمة بالمنتجات الأكثر نجاحا مقابل المنتجات الأقل نجاحا. يعد الحصول على عدة عينات من بائعين مختلفين ، واختبارها لتحقيق النمو الأمثل ، ثم شراء كمية كبيرة من أفضل مجموعة استراتيجية فعالة للتخفيف من هذه المشكلة وإنتاج وسيط جيد.
    2. ابدأ بإذابة BSA في دورق عن طريق التقليب في الماء ، الأمر الذي سيستغرق نصف ساعة على الأقل.
    3. أضف جميع المواد الكيميائية الجافة واتركها تذوب. ثم أضف CMRL.
    4. اضبط الرقم الهيدروجيني لوسط BSK-II على 7.6 ، إذا لزم الأمر ، باستخدام 1 M NaOH.
    5. أضف مصل الأرنب إلى وسط BSK-II بتركيز 6٪ -10٪. تعقيم المرشح (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) وسط BSK-II. الكمية المطلوبة من المصل تعتمد على أنواع بوريليا . استخدم 6٪ -7٪ لأنواع وسلالات RF ، ول Borrelia burgdorferi sensu lato. إذا لم يكن النمو قويا ، أضف مصل أرنب معقم آخر بنسبة 1٪ -2٪ إلى الوسط.
    6. قم بتجميد مخزون BSK-II المتوسط في 100 مل أو 400 مل من القسامة.
    7. بالنسبة لسلالات التردد اللاسلكي ، يلزم الجيلاتين. أضف 100 مل من الجيلاتين المعقم بنسبة 7٪ (تم تسخينه قليلا لوضعه في محلول) إلى 400 مل من وسط BSK-II. قم بتسخين BSK-II بالجيلاتين عند 37 درجة مئوية لجعل الجيلاتين يذوب قبل تلقيح الثقافة.
      ملاحظة: يمكن تجميد الوسط (-20 درجة مئوية) قبل التعقيم بالترشيح وإضافة مصل الأرانب والجيلاتين (ل RF spirochetes) أو بعد تعقيم المرشح وإضافة المصل (والجيلاتين). الوسط مستقر عند تجميده لفترة طويلة. عند تخزينها في الثلاجة ، استخدم الوسيط في غضون 1 شهر. تنمو أنواع RF بشكل أفضل مع وسط جديد ، وعادة لا يزيد عمره عن 1 أسبوع. إذا لم يتم تجميدها ، فقم بفحص جودة الوسط بصريا بحثا عن التعكر. تخلص من الوسط الذي يبدو أنه ملوث أو مسبب للمكونات أو مشكوك فيه.
    8. إذا كان سيتم إضافة المضادات الحيوية إلى الوسط ، فقم بإضافتها إلى القسامات المتوسطة الطازجة أو المجمدة مسبقا ؛ هذا الأخير هو النهج الأكثر مرونة. استخدم تركيزات المضادات الحيوية كما وصفها Oliver et al.39.
    9. أثناء إذابة أنبوب من الوسط ، قم بوزن المضادات الحيوية في أنابيب معقمة (معقم) سعة 1.7 مل أو أنابيب مخروطية معقمة سعة 15 مل ، باستخدام ميزان دقيق. قم بإعداد حلول المخزون على النحو التالي: قم بإذابة 25 مجم من الأمفوتريسين B في 10 مل من DMSO ، و 20 مجم من الفوسفوميسين في 1 مل من الماء المقطر المعقم ، و 50 مجم من ريفامبيسين في 1 مل من DMSO.
    10. مرشح تعقيم (0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة) المضادات الحيوية ونقلها إلى أنبوب جديد من الحجم المناسب.
    11. تمييع المضادات الحيوية بنسبة 1: 1000 من الوسط للوصول إلى تركيزها النهائي. بالنسبة ل 500 مل من BSK ، أضف 0.5 مل من محلول مخزون الأمفوتريسين B (2.5 مجم / مل في DMSO) ، و 0.5 مل من محلول مخزون الفوسفوميسين (20 مجم / مل في H2O المعقم) ، و 0.5 مل من محلول مخزون ريفامبيسين (الولايات المتحدة: ريفامبين) (50 مجم / مل في DMSO).
    12. استخدم الوسط المكمل بالمضادات الحيوية أو القسمة وقم بتجميدها عند -20 درجة مئوية.
المكونات المبلغ (/ لتر)
جزء BSA الخامس ٥٠ غرام
CMRL-1066 (10x) 100 مل
نيوببتون 5 غرام
هيبس 6 غرام
حامض الستريك ملح ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدرات 0.7 غ
الجلوكوز 5 غرام
TC خميرة 2 غرام
حمض البيروفيك (ملح نا) 0.8 غ
إن-أسيتيل-د-جلوكوزامين 0.4 غ
بيكربونات الصوديوم 2.2 غ
ماء (عالي النقاء) 900 مل

الجدول 1: تكوين 1 لتر من وسط BSK-II.

مصدر ملاءمه
Serva GmbH, هايدلبرغ, ألمانيا نعم
المستحضرات البيولوجية المرنة ، بون IA ، الولايات المتحدة الأمريكية نعم
سيغما (ميليبور-سيغما وسيغما- ألدريتش)، سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة لا

الجدول 2: مصادر BSA ومدى ملاءمتها لوسط BSK-II.

2. تعليمات لصنع MKP

  1. إعداد المتوسطة الأساسية
    1. قم بوزن وإذابة جميع مكونات المسحوق بعناية كما هو موضح أدناه في الجدول 3 في 3 /4 من الحجم النهائي ل ddH2O (حوالي 750 مل) عن طريق التقليب حتى الذوبان الكامل ، والذي يستغرق ~ 1 ساعة.
    2. بعد الذوبان الكامل ، اضبط الرقم الهيدروجيني مع NaOH إلى 7.6 والحجم إلى 1000 مل ، ثم قم بالتعقيم عن طريق الترشيح (مرشح 0.22 ميكرومتر).
      ملاحظة: يمكن تخزين الوسط الأساسي في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. إعداد MKP متوسطة كاملة
    1. خلط جميع المكونات كما هو موضح في الجدول 4 بطريقة معقمة ؛ تعقيم الجيلاتين عن طريق التعقيم والتعامل بطريقة معقمة. اعمل في خزانة أمان بيولوجي معقمة واستخدم مصلا مصفى معقما.
    2. القسمة MKP في أنابيب 50 مل. ضع قسامة صغيرة واحدة عند 33 درجة مئوية لعدة أيام ، ثم تحقق تحت مجهر الحقل المظلم لعدم وجود تلوث.
      ملاحظة: حافظ على وسط MKP الكامل عند +4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 شهر ، ولا تجمد. يمكن تعقيم الوسط الكامل بشكل إضافي عن طريق الترشيح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
المكونات المبلغ (/ لتر)
CMRL-1066 (10x بدون الجلوتامين) 100 مل (إذا كان سائلا) / 9.7 جم / لتر إذا كان مسحوق
نيوببتون 3 غرام
هيبس 6 غرام
حامض الستريك 0.7 غ
الجلوكوز 3 غرام
حمض البيروفيك 0.8 غ
إن-أسيتيل جلوكوزامين 0.4 غ
بيكربونات الصوديوم 2 غرام

الجدول 3: تكوين 1 لتر من وسط MKP الأساسي (Kelly-Pettenkofer المعدل).

المكونات المبلغ (مل)
الوسط الأساسي 500
7٪ جيلاتين (في H2O) (معقم طازجا ولكن ليس ساخنا) 100
مصل الأرنب 36
35٪ BSA 17.5

الجدول 4: تكوين MKP (تعديل كيلي بيتنكوفر) وسط كامل.

3. ثقافة بوريليا ، مع أو بدون المضادات الحيوية

  1. قم بإجراء جميع الخطوات التجريبية في ظل ظروف عمل معقمة في خزانة السلامة البيولوجية. تطهير السطح وجميع المواد مع 70 ٪ من الإيثانول ، ونقلها على الفور إلى خزانة السلامة البيولوجية. تعقيم جميع المواد غير البيولوجية بالأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 5 دقائق قبل بدء العمل.
  2. استخدم أحدث وسيلة ممكنة.
  3. لبدء ثقافة ، قم بتسخين الوسط مسبقا (33 درجة مئوية - 37 درجة مئوية) في حاضنة. ضع الرج إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: اعتمادا على حجم الوسط ، قد تستغرق هذه الخطوة عدة ساعات.
  4. أضف ~ 1 مل من ثقافة بوريليا المذابة من الجلسرين أو مخزون مشابه ، تم تخزينه مسبقا عند -80 درجة مئوية وإذابته في درجة حرارة الغرفة (RT) ، بمجرد أن يصبح سائلا ، إلى 5-15 مل من وسط BSK المسخن مسبقا. تلقيح الثقافة في حجم صغير (5-15 مل من BSK) باستخدام قوارير زجاجية أو بلاستيكية متوفرة تجاريا مع أغطية لولبية. املأ الأنابيب ممتلئة تقريبا لعمل جو دقيق أو لاهوائي. أغلق الأنابيب بإحكام ؛ إذا تم استزراعه بهذه الطريقة ، فلن تكون هناك حاجة إلى CO2 .
  5. تنمو أنواع RF (و B. persica) عند 37 درجة مئوية في حاضنة دون تحريك أو تحريك. تنمو أنواع B. burgdorferi sensu lato عند 33-34 درجة مئوية.
  6. راقب نمو ثقافة Borrelia باستخدام تباين الطور أو الفحص المجهري المظلم عند تكبير 200x-400x (الشكل 3). لضمان التوزيع المتساوي للخلايا ، امزج المزرعة مع ماصة مصلية أو لمزيد من الخلط مع ماصة نقل 3 مل أثناء السحب لأعلى ولأسفل.
    ملاحظة: تكون البوريليا أكثر وضوحا عند التكبير العالي (200X-400X) ، ولكن من الأفضل عدها عند تكبير 200X على مقياس الدم40. حركة Borrelia والتشكل تدل على وجود هذه البكتيريا.
  7. لتحديد النمو البكتيري ، عد عدة (10) مربعات صغيرة فردية في نمط الشبكة المكون من ستة عشر مجالا لمنطقة العد على جانبي مقياس الدم والمتوسط. اضرب متوسط عدد الخلايا لكل مربع صغير مع عامل التحويل المناسب لمقياس الدم المستخدم لتحديد عدد الخلايا لكل مل.
  8. مراقبة نمو البكتيريا على فترات 1-2 يوم. يعتمد النمو الأسي للبوريليا على الجدوى وكثافة الخلايا وقد يستغرق 1 أسبوع أو أكثر عند 34 درجة مئوية. قم بتخفيف ثقافات الطور الأسي بنسبة 1: 2 أو 1: 4 باستخدام الوسط في أنبوب سعة 1.7 مل قبل التحميل على مقياس الدم. قم بتضمين الاعتبار المناسب لعامل التخفيف عند تحديد عدد الخلايا. بعد الاستخدام ، قم برش الأسطح ومقياس الدم باستخدام المبيض المخفف (10٪) و / أو 70٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: Borrelia في نمو أسي عندما تكون تركيزات الخلايا 1-5 × 107 خلايا / مل. ضمن هذا النطاق ، تنمو الخلايا بشكل جيد.
  9. سوف تستنفد الثقافة الممتدة العناصر الغذائية وتغير درجة الحموضة المتوسطة ، لذا يلزم الاستزراع الفرعي. في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية ، انقل 1/10 من حجم الاستزراع إلى أنبوب جديد واملأه بالوسط الجديد (قسامة جديدة من نفس الوسط تستخدم لزراعة المقطع السابق). التخفيف 1:10 هو الأمثل. إذا كان سيتم تغيير حجم المزرعة ، فاضبط كمية اللقاح وفقا لذلك ، واستمر في الحضانة. يزداد عدد المقاطع مع كل تغيير وسيط.
  10. لاستخراج الحمض النووي أو عزل خلايا بوريليا ، قم بالطرد المركزي في المرحلة الأسية بوريليا لمدة 10 دقائق عند 4000 × جم لحبيبات البكتيريا. تخلص من المادة الطافية في النفايات البيولوجية المناسبة. قم بمعالجة البكتيريا المحببة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية أو أعد تعليق البكتيريا في وسط مناسب للتجربة المقصودة.
  11. في نهاية كل تلاعب ، قم بتعقيم جميع المعدات بالإيثانول والأشعة فوق البنفسجية ، حسب الاقتضاء للمعدات. اجمع النفايات السائلة ، بما في ذلك الثقافة الزائدة ، في زجاجة نفايات وأضف المبيض إلى تركيز نهائي بنسبة 10٪. ضع هذه الزجاجة على حرارة -80 درجة مئوية قبل التخلص منها. بدلا من ذلك ، قم بتعقيم النفايات السائلة والثقافة بدون مبيض أو كحول عن طريق التعقيم.

4. تخزين طويل الأجل لثقافات بوريليا

  1. إعداد مخزون الجلسرين من ثقافة بوريليا
    1. خذ ~ 1.8 مل من حصص ثقافات الطور الأسي ، وتركيزات الخلايا ~ 10 7-10 8 خلايا / مل ، وأضف الجلسرين المعقم إلى تركيز نهائي قدره 10٪ (تركيزات 5٪ -20٪ عمل).
    2. ضع في قوارير مبردة بغطاء لولبي سعة 2 مل. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
    3. الحفاظ على مخزون مع ما لا يقل عن 10 أنابيب من كل سلالة في الثلاجة.
  2. وصفة تخزين بديلة لإنتاج مخزون الجلسرين للتخزين الدائم
    1. مزيج 2/3 من ثقافة بوريليا مع 1/3 من 15 ٪ الجلسرين في مرق البروسيلا . استخدم 2.8 غرام من مرق البروسيلا المذاب في 100 مل من ddH2O ، والذي تم ترشيحه بشكل معقم (0.22 ميكرومتر).
    2. احتفظ بمخزون الجلسرين من العينات عند -70 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية.

5. عزل اللولبيات من المصادر البيئية أو السريرية

ملاحظة: في حالة عزل المواد من مصادر بشرية أو حيوانية أو بيئية ، يجب الحصول على أخلاقيات البحث أو رعاية الحيوان أو الشهادة البيئية ، حسب الاقتضاء.

  1. زراعة بوريليا من القراد الصلب
    1. اجمع الإناث البالغات والذكور و / أو القراد الحوريات.
    2. سطح تعقيم جميع عينات القراد عن طريق غمسها في 70 ٪ من الإيثانول لمدة 2 دقيقة والهواء الجاف في خزانة السلامة البيولوجية. تشريح بشكل فردي إلى عدة قطع مع مشرط معقم. ضع القطع في أنبوب سعة 2 مل يحتوي على 1.5 مل من الوسط ، مع استكمال المضادات الحيوية.
    3. احتضان الثقافات عند 34 درجة مئوية وتحقق من وجود اللولبيات بواسطة المجهر المظلم أو تباين الطور مرتين أسبوعيا لأول أسبوعين وأسبوعيا بعد ذلك لمدة 6 أسابيع (في كثير من الأحيان ل spirochetes RF). عينات إيجابية للاستزراع الفرعي في 5 مل من نفس الوسط.
      ملاحظة: يمكن تنقية المزارع الملوثة إلى حد ما عن طريق الترشيح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. قد تكون هناك حاجة إلى المضادات الحيوية لحل التلوث بشكل كامل.
  2. زراعة بوريليا من عينات الدم
    ملاحظة: يجب أخذ عينة الدم من قبل أخصائي طبي أو بيطري أو باحث مؤهل ، اعتمادا على مصدر المادة. يجب أن ينقضي أقل من 24 ساعة عند RT بين العينة
    الإزالة والوصول إلى المختبر.
    1. الحصول على 10 مل من الدم ، التي تم جمعها في أنابيب جمع الدم الزجاجية مع حمض سيترات سكر العنب (ACD; "قمة صفراء") كمضاد للتخثر. اتركيه في درجة حرارة الغرفة. يوصى بمرور أقل من 24 ساعة بين جمع الدم والتلقيح.
    2. طرد مركزي الدم مع مضادات التخثر لمدة 10 دقائق في 200-400 × غرام لفصل البلازما عن خلايا الدم.
    3. قم بإزالة البلازما برفق من الأنبوب وقم بتلقيح 1 مل من البلازما إلى 5 مل من وسط MKP الكامل المسخن مسبقا. يمكن استكمال MKP بالمضادات الحيوية. احتضان الثقافات عند 33 درجة مئوية مع الفحص البصري اليومي والفحص المجهري الأسبوعي لتباين الحقل المظلم أو الطور حتى يتم ملاحظة نمو الملل (في كثير من الأحيان ل RF Borrelia) ، والذي قد يستغرق ما يصل إلى 9 أسابيع.
      ملاحظة: في حالة استخدام أحجام تلقيح أكبر أو أصغر ، حافظ على نسبة 1: 5 من اللقاح إلى المتوسط. استخدم الأمصال أو البلازما بدلا من الدم الكامل.
  3. زراعة بوريليا من خزعة الجلد
    1. سطح تعقيم خزعة الجلد (من الناحية المثالية مكعب 3 مم × 3 مم × 3 مم ؛ أي مع 70 ٪ من الإيثانول وبيروكسيد الهيدروجين). ضع عينة الخزعة في محلول ملحي فسيولوجي.
      ملاحظة: يجب أخذ عينة الخزعة من قبل أخصائي طبي أو بيطري أو باحث مؤهل ، اعتمادا على مصدر المادة. يجب أن تنقضي أقل من 24 ساعة في RT بين إزالة العينة ووصولها إلى المختبر.
    2. قطعي العينة إلى قطعتين إلى ست قطع أصغر باستخدام شفرة حلاقة معقمة في طبق بتري زجاجي معقم أثناء غمرها في محلول ملحي فسيولوجي. نقل جميع العينات و ~ 1 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي الذي تم فيه تخزين خزعة الجلد في 5 مل من الوسط المسخن مسبقا المكمل بالمضادات الحيوية واحتضانه عند 33 درجة مئوية.
    3. في حالة فرط نمو البكتيريا الملوثة ، أضف المضادات الحيوية كما في الخطوة 1.1.10 أعلاه ، أو عن طريق إضافة قرصين من سلفاميثوكسازول (23.75 مجم ؛ التركيز النهائي 5 مجم / مل) + تريميثوبريم (1.25 مجم ؛ 0.25 مجم / مل) أو باكترم (الحد الأدنى للتركيز المثبط >128 ميكروغرام / مل) ، قرصان من أميكاسين (2 × 30 ميكروغرام ؛ التركيز النهائي 12 ميكروغرام / مل) ، وقرصين من الفوسفوميسين (2 × 200 ميكروغرام ؛ التركيز النهائي 80 ميكروغرام / مل).
      ملاحظة: في جميع الحالات ، تأكد من البقاء أقل من الحد الأدنى للتركيز المثبط لهذا المضاد الحيوي لأنواع Borrelia التي تتم محاولة استزراعها41،42،43.
    4. إذا كانت الثقافة إيجابية لبوريليا ، احتفظ بالثقافة لمدة 3-4 أيام إضافية أو حتى تصل كمية بوريليا إلى 10+ لوبيات في حقل مجهر باستخدام هدف 40X. إنشاء مخزون الجلسرين للتخزين الدائم.

6. عزل مجموعات وحيدة النسيلة من B. burgdorferi sensu lato spirochetes و B. miyamotoi من المزارع السائلة عن طريق الزراعة على الوسائط الصلبة

  1. لصنع الأطباق ، قم بتسخين 300 مل من 1.5X MKP متوسطة كاملة (بدون جيلاتين). أيضا ، قم بتسخين 200 مل من 1.7٪ من الأغاروز (معقم في ماء منزوع الأيونات ، وتخزينه في RT ، وتسخينه في الميكروويف قبل الاستخدام) إلى 55 درجة مئوية. خلط كلا السائل.
  2. ماصة 15 مل من هذا الخليط في كل من 16 طبق بتري عميق لجعل أوسيلاير أجار القاع.
  3. احتفظ ببقية الوسط عند 55 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: يتم خلط البوريليا في طبقة الأغاروز العلوية.
  4. أولا ، قم بقياس كثافة ثقافة Borrelia باستخدام مقياس الدم وتخفيفه إلى الكثافة المطلوبة في وسط سائل.
    ملاحظة: 500 و 200 و 100 و 50 لولبيات لكل لوحة تعمل بشكل جيد.
  5. بعد أن تتجمد الصفائح السفلية، أضف 10 مل من خليط الأغاروز المتبقي إلى أنبوب سعة 15 مل يحتوي على العدد المناسب من اللولبيات.
  6. صب التعليق على agarose القاع في طبق بتري المسمى .
    ملاحظة: نظرا لأن اللولبيات Borrelia حساسة لدرجة الحرارة العالية ، يجب توخي الحذر لضمان عدم تعرض البكتيريا ل 55 درجة مئوية لفترة طويلة من الزمن. صب أجار العلوي فور إضافته إلى الخلايا البكتيرية في الوسط.
  7. بعد أن تصلب الأطباق تماما ، أغلق أطباق بتري وضعها رأسا على عقب عند 34-35 درجة مئوية في 2.5٪ CO2.
    ملاحظة: سوف تظهر المستعمرات 1 أسبوع بعد الطلاء إذا كان الإجراء ناجحا.
  8. لفحص وتوسيع المستعمرات الفردية ، حدد مستعمرات مفردة من الألواح وضعها في 1.5 مل من MKP السائل المعدل ، أو وسائط أخرى مناسبة ، في أنابيب استزراع معقمة سعة 2 مل.
  9. احتضان الثقافات عند 34 درجة مئوية وفحص اللولبيات بواسطة المجهر المظلم أو الطور. استخدم هذه الثقافات للتحليل أو الأسهم ، كما هو موضح أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وسائط ثقافة Borrelia BSK و MKP ، والمتغيرات ، هي وسائط ثقافة غنية بالمكونات التي تحتاج إلى التحضير والتعقيم بالتتابع. عند تحضيره بشكل صحيح ، يجب أن يكون وسيط BSK أحمر برتقالي وواضح (الشكل 1). تشير العكارة وهطول الأمطار التي تستمر بعد الاحترار إلى مكونات إشكالية أو إنتاج متوسط أو تلوث ؛ من الأفضل التخلص من هذه الوسيلة. إذا تمت إضافة الجيلاتين إلى BSK ومع MKP ، فسيكون الوسط جيلاتينيا عند تبريده ؛ عند الاحترار ، سيكون سائلا ، على الرغم من أنه لزج قليلا.

نمو ثقافات بوريليا النقية لن يغير تعكر الوسط. ومع ذلك ، فإن نمو الثقافات البكتيرية ، Borrelia ، وكذلك الملوثات ، سوف يتغير لونه المتوسط نتيجة لمؤشر الأس الهيدروجيني. سيؤدي النمو المفرط للبكتيريا الأخرى إلى حدوث تعكر ومواد متكتلة (الشكل 2).

يمكن مراقبة نمو الثقافة عن طريق تباين الطور أو الفحص المجهري المظلم (الشكل 3 والشكل 4). عادة ما تكون خلايا بوريليا في المرحلة الأسية نحيلة وملتوية ومتحركة إلى حد ما. مع دخول الثقافات في المرحلة الثابتة ، تصبح الأجسام المستديرة واضحة بشكل متزايد (الشكل 5). غالبا ما تحتوي العزلات السريرية أو البيئية على سلالات و / أو أنواع بوريليا متعددة. لعزل الحيوانات المستنسخة النقية ، يمكن طلاء الثقافات السائلة لعزل المستعمرات وحيدة النسيلة (الشكل 6) ؛ في بعض الأحيان ، قد تكون هناك حاجة إلى جولات متعددة من عزل المستعمرة.

Figure 1
الشكل 1: وسط BSK و MKP . (أ) BSK (مع المضادات الحيوية) مع ثقافة نقية من Borrelia burgdorferi. مع أو بدون B. burgdorferi يبقى الوسيط بدون تعكر مرئي وهو برتقالي كهرماني (يختلف اللون قليلا باختلاف المكونات). (ب) وسط MKP ، غير ملقح ، ذوبان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: وسط BSK و MKP الملوث مع فرط نمو البكتيريا المتنافسة. يتغير لون الوسط ، عكر ، وبمرور الوقت تموت البكتيريا المتنافسة وتترسب في قاع الأنبوب. (أ) أنبوب BSK متضخم. (ب) أنبوب BSK القديم مع البكتيريا الملوثة المترسبة. (C) أنبوب MKP مع (يسار) وبدون (وسط) ثقافة وثقافة ملوثة (يمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: استخدام مقياس الدم لمراقبة نمو البوريليا. سلالة Borrelia burgdorferi B31 (مجموعة فرعية يشار إليها بالأسهم) ينظر إليها على مقياس الدم (يشار إلى سطر واحد من الشبكة الصغيرة بواسطة رأس السهم) تحت تباين الطور 200X. يسمح هذا التكبير والعملية بمراقبة الثقافات وتقدير كثافة الخلايا. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: صورة داركفيلد لبوريليا بورغدورفيري . صورة الحقل المظلم لسلالة بوريليا بورغدورفيري SCW-53 ، بكثافة عالية في المرحلة الأسية بعد 5-7 أيام من الزراعة في وسط MKP (تكبير 400X). شريط المقياس هو 20 ميكرومتر. تم عزل هذه السلالة من القراد الصلب Ixodes affinis ، الذي تم جمعه في ساوث كارولينا ، الولايات المتحدة الأمريكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: بوريليا في الثقافات القديمة. مع دخول خلايا بوريليا في المرحلة الثابتة في الثقافات القديمة ، ينظر إلى أشكال الجسم المستديرة بشكل متزايد على أنها تحل محل الشكل اللولبي. قد تكون هذه أشكال نائمة أو خلايا ميتة. اللوحة اليسرى ، صبغة ديترل ؛ اللوحة الوسطى ، وصمة عار الكيمياء المناعية ؛ واللوحة اليمنى ، تهجين فلوري في الموقع لثقافة بوريليا (يفترض أن تكون B. burgdorferi على أساس الأصل ولكن لم يتم تحديد الأنواع والسلالة جزيئيا) ملقحة ببول الكلاب. تمت الموافقة على جمع البيانات في الشكل 5 من قبل لجنة رعاية الحيوان بجامعة Mrt. أليسون ، رقم الموافقة 16-1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: اللولبيات المعقدة بوريليا بورغدورفيري بالمعنى الدلبي. مستعمرات Borrelia burgdorferi sensu lato المعقدة spirochetes نمت على وسط صلب من أجل عزل السكان النسيلي النقي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الثقافة المختبرية للبكتيريا هي نقطة انطلاق للبحث. تتجسد الميزة العميقة التي تمنحها القدرة على الثقافة في النضال ، على مدى أكثر من قرن من الزمان الذي بلغ ذروته مؤخرا في النجاح ، لثقافة اللولبية الشاحبة ، اللولبية التي هي العامل المسبب لمرض الزهري44. تشكل اللولبيات Borrelia أيضا تحديا للثقافة ، لكن الثقافة ممكنة23،24،34،44،45،46،47،48،49.

خلايا بوريليا شديدة الحساسية وكل نوع وسلالة ، وحتى عزل يختلف ، وراثيا ومن خلال التكيف مع المضيف الذي تم عزلهامنه 51،52،53،54،55. عند صنع الوسائط ، فإن استخدام المكونات المناسبة يحدث فرقا هائلا في قوة ثقافة بوريليا أو حتى جدوى الثقافة. يعد استخدام الوسائط الطازجة والمخصبة للغاية والمخزنة بشكل صحيح أمرا ضروريا لتعزيز نمو البكتيريا وهو مطلب راسخ لنمو البكتيريا. بالنسبة لبوريليا ، فإن الحفاظ على الظروف اللاهوائية أو الهوائية الدقيقة مطلوب للنمو الجيد. يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق ملء الأنابيب إلى الأعلى ، لذلك لا يوجد سوى القليل من الهواء المتبقي في الأنبوب وتنمية الثقافات دون إثارة ؛ قد تكون هناك حاجة إلى رقابة أكثر صرامة على الأكسجين وثاني أكسيد الكربون للتعبير الجيني والدراسات ذات الصلة26،27،28،29،30. قد تبدو إضافة المضادات الحيوية إلى وسط الثقافة البكتيرية غير بديهية. استخدام جرعات منخفضة من المضادات الحيوية في وسط بوريليا هو تثبيط نمو البكتيريا الأسرع نموا. إذا تم تلقيح الثقافة بعزل بوريليا نقي ، فلن تكون هناك حاجة لإضافة المضادات الحيوية ؛ ومع ذلك ، فإن استخدام المضادات الحيوية المضافة ضروري لتثبيط فرط النمو من البكتيريا المتنافسة عند التلقيح بعينات سريرية أو بيئية. يمكن أيضا استكمال وسط BSK ب 3٪ -7٪ جيلاتين. هذا ضروري لنمو أنواع RF Borrelia 21. يعتمد استخدام BSK أو MKP لنمو أنواع Borrelia burgdorferi sensu lato على مصدر العزلة. يدعم كلا الوسائطين نمو الثقافات الراسخة ، ولكن تم العثور على MKP لأداء أفضل عند بذر ثقافات جديدة بأعداد منخفضة من خلايا Borrelia ، كما يحدث مع العزلات السريرية أو البيئية23,24. تسمح هذه الوسيلة أيضا بثقافة B. miyamotoi56،57،58. في نهاية المطاف ، هناك عنصر فني لعلم زراعة الميكروبات السريعة ، لكنه ممكن بعناية ومثابرة.

تكمن ثقافة بوريليا في التقدم في البحوث الطبية الحيوية. سمحت ثقافة بوريليا بتحديد الجينوم الكامل والبروتين للعديد من أنواع بوريليا ، مما سمح للباحثين بالبدء في كشف تطور وبيولوجيا هذه اللولبيات 54،58،59. وبالمثل ، فإن الوصول إلى الثقافات النقية لبوريليا يسمح بفهم العديد من التفاعلات المعقدة لبوريليا مع مضيف الثدييات وناقل المفصليات 61،62،63،64،65 ، بما في ذلك التفاعلات مع الجهاز المناعي المضيف11،65 ، يسمح باستنتاج آليات الانتقال29،66، ويوفر أداة التحقيق الرئيسية للتمييز بين الخلايا القابلة للزراعة ، وبالتالي الحية بالضرورة ، من الحطام الخلوي ، وهو تمييز حاسم في كشف آليات التسبب في المرض وكذلك أنظمة العلاج الفعالة8،67،68،69،70،71. في حين أن ثقافة Borrelia في المختبر يمكن أن تستغرق عدة أسابيع قبل أن تكون اللولبيات وفيرة بما يكفي للكشف ، فإن الحد من تطبيقات التشخيص السريري ، والفهم الأساسي لبيولوجيا Borrelia ، وعلم الجينوم ، والتفاعلات بين المضيف والممرض والعديد من التطبيقات الأخرى قد اعتمد على القدرة على عزل Borrelia النقي الثقافات من العزلات البيئية ، وتضخيم تلك العزلات من خلال الثقافة لإنتاج مواد كافية للتحليل الكيميائي الحيوي والجيني. هناك دفعة مجتمعية للاستجابة السريعة للعدوى لدعم التشخيص والعلاج السريعين. غير أن العنصر الآخر لهذه الحاجة هو البحوث الطبية الحيوية والبيولوجية اللازمة لوضع أساس متين يمكن على أساسه علاج الأمراض والوقاية منها بشكل مناسب وناجح. على الرغم من التحدي ، فإن زراعة اللولبيات Borrelia في المختبر ممكنة ويمكن أن تدعم هذه الاحتياجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولم يعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا والمؤسسة الكندية لمرض لايم (AB و VL) ، ومجلس البحوث السويدي (SB ، M-LF و IN) ، ومشروع TAČR GAMA 2 - "دعم التحقق من إمكانات التطبيق 2.0 في مركز البيولوجيا CAS" (TP01010022) (MG و NR) ، وبمنحة من وزارة الصحة في الجمهورية التشيكية NV19-05-00191 (MG و NR). نشكر S. Vranjes (2021 ، مختبر Rudenko) على الصورة في الشكل 4 و J. Thomas-Ebbett (2021 ، مختبر لويد) على الصور في الشكل 5. نشكر جميع الباحثين الذين ساهموا في هذا المجال ونعتذر لأولئك الذين لم نتمكن من الاستشهاد بعملهم بسبب قيود المساحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 189
طرق زراعة اللولبيات من مجمع <em>بوريليا بورغدورفيري</em> سينسو لاتو وحمى الانتكاس <em>بوريليا</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter