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Immunology and Infection

Métodos de cultivo de espiroquetas de Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex y fiebre recidivante Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

El cultivo in vitro es un método de detección directa de la presencia de bacterias vivas. Este protocolo describe métodos para el cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluidas las del complejo Borrelia burgdorferi sensu lato, las especies de fiebre recidivante de Borrelia y Borrelia miyamotoi. Estas especies son fastidiosas y de crecimiento lento, pero pueden ser cultivadas.

Abstract

La Borrelia consiste en tres grupos de especies, las del grupo de la borreliosis de Lyme (LB), también conocido como B. burgdorferi sensu lato (s.l.) y recientemente reclasificado en Borreliella, el grupo de la fiebre recurrente (RF) Borrelia, y un tercer grupo de espiroquetas asociado a reptiles. Los métodos basados en el cultivo siguen siendo el estándar de oro para la detección de infecciones bacterianas en el laboratorio tanto para la investigación como para el trabajo clínico, ya que el cultivo de patógenos a partir de fluidos corporales o tejidos detecta directamente patógenos replicantes y proporciona material de origen para la investigación. Las espiroquetas de Borrelia y Borreliella son fastidiosas y de crecimiento lento, y por lo tanto no se cultivan comúnmente con fines clínicos; Sin embargo, la cultura es necesaria para la investigación. Este protocolo demuestra la metodología y las recetas necesarias para cultivar con éxito espiroquetas LB y RF, incluidas todas las especies reconocidas del complejo B. burgdorferi s.l., incluidas B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis yespiroquetas RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis y B. miyamotoi. El medio básico para cultivar espiroquetas LB y RF es el medio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H), que apoya de manera confiable el crecimiento de espiroquetas en cultivos establecidos. Para poder cultivar aislados de Borrelia recién aislados a partir de muestras derivadas de garrapatas o huéspedes donde el número inicial de espiroquetas es bajo en el inóculo, se prefiere el medio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado. Este medio también apoya el crecimiento de B. miyamotoi. El éxito del cultivo de espiroquetas de RF también depende críticamente de la calidad de los ingredientes.

Introduction

Borrelia es un género de bacterias espiroquetas que abarca tres clados principales: el grupo de la borreliosis de Lyme (LB), el grupo de la fiebre recurrente (RF) y un grupo menos caracterizado aparentemente restringido a los reptiles. La taxonomía de Borrelia está en constante cambio con el advenimiento de metodologías moleculares que permiten comparaciones de genomas y proteomas, como ocurre con la mayoría de los otros grupos taxonómicos 1,2,3,4,5,6,7. El grupo LB (también llamado grupo de la enfermedad de Lyme) se ha denominado tradicionalmente Borrelia burgdorferi sensu lato después de su miembro mejor caracterizado Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Este artículo utiliza la terminología más utilizada actualmente: el LB, el RF y el grupo asociado a reptiles, y describe los protocolos de cultivo para los grupos LB y RF.

Como se esperaría para un miembro de la familia Spirochaetaceae, Borrelia puede adoptar la forma espiral distintivamente larga y delgada, típicamente 20-30 μm de largo y 0.2-0.3 μm de ancho. Sin embargo, las células de Borrelia son altamente pleomórficas y pueden adoptar muchas otras formas tanto en cultivo como in vivo 1,8 como resultado de su compleja estructura celular y genética. En su forma espiroquetal, la morfología de la onda sinusoidal plana resulta de su endoflagelos axiales que giran en el espacio periplásmico entre las membranas interna y externa. Esta estructura permite que las células sean altamente móviles, con la membrana externa que contiene proteínas que permiten a la célula interactuar con los tejidos del huésped 9,10. La expresión de las proteínas de la membrana externa está estrechamente regulada y afecta no sólo la invasión del tejido del huésped, sino también la interacción con el sistema inmune del huésped11. Esta compleja expresión génica permite que las células de Borrelia se muevan entre los entornos muy diferentes de los huéspedes vertebrados y los vectores invertebrados. El genoma de Borrelia es inusual entre los procariotas, que consiste en un cromosoma lineal en lugar de circular. Además del cromosoma lineal, las especies de Borrelia contienen 7-21 plásmidos, algunos lineales y otros circulares. Los plásmidos albergan la mayoría de los genes necesarios para la adaptación y virulencia del huésped, y se cree que los plásmidos circulares derivados de los profagos son responsables de la mayor parte del flujo horizontal de genes entre las células espiroquetales12,13. De acuerdo con un papel en la adaptación del huésped, algunos, posiblemente muchos o todos, los miembros del grupo de borreliosis de Lyme pierden plásmidos en cultivo14. La cepa "adaptada en laboratorio" mejor estudiada de B. burgdorferi, B31, tiene solo siete de los nueve plásmidos encontrados en aislados silvestres de esta especie15. Del mismo modo, B. garinii pierde plásmidos en cultivo16. Algunos estudios han demostrado que las especies de RF y B. miyamotoi retienen plásmidos cuando se cultivan 14,17, pero trabajos recientes demuestran plásmidos alterados e infectividad con el cultivo in vitro a largo plazo18.

Los métodos basados en el cultivo siguen siendo el estándar de oro para la detección de infecciones bacterianas en laboratorio, tanto para la investigación como para el trabajo clínico14,17. El cultivo de patógenos a partir de fluidos corporales o tejidos detecta directamente patógenos replicantes y proporciona material de origen para la investigación14,17. Este protocolo demuestra la metodología y las recetas necesarias para cultivar con éxito las espiroquetas del grupo LB, así como RF Borrelia y B. miyamotoi. El medio básico para cultivar espiroquetas de Borrelia es el medio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o el BSK-H disponible comercialmente), con o sin antibióticos para reducir el crecimiento de procariotas contaminantes. Este medio fue adaptado de un medio utilizado originalmente para soportar RF Borrelia19, modificado por Stoenner20 y luego por Barbour21. Desde entonces, se han desarrollado muchas modificaciones, cada una con efectos sobre la fisiología bacteriana que pueden afectar el crecimiento, la infectividad y la patogenicidad22. Este medio apoya de manera confiable el crecimiento de espiroquetas en cultivos establecidos y ha sido utilizado para aislar espiroquetas de garrapatas, mamíferos y muestras clínicas23. La variación desarrollada más recientemente, el medio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado, puede proporcionar un mejor éxito de aislamiento, morfología y motilidad al aislar nuevos aislados de Borrelia de muestras ambientales, cuando el número de espiroquetas presentes en la muestra disponible para sembrar el cultivo es bajo23,24. En todos los casos, el éxito del cultivo depende críticamente del medio recién preparado y del uso de ingredientes apropiados; No todos los ingredientes comerciales producen medios de alta calidad. Los cultivos inoculados pueden incubarse convenientemente sin agitar en una incubadora convencional a 32-34 °C en presencia de una pequeña cantidad de oxígeno ambiental residual. Las espiroquetas de Borrelia son anaerobias, pero están expuestas en la naturaleza a fluctuaciones en las concentraciones de oxígeno y dióxido de carbono y responden con cambios en la expresión génica26,27,28,29. Por lo tanto, la expresión génica, el crecimiento y otros estudios metabólicos deben controlar los niveles de oxígeno y dióxido de carbono con el uso de una incubadora controlada por oxígeno o una cámara anaeróbica. En cultivo, los cultivos se revisan semanalmente, o más a menudo, para detectar la presencia de espiroquetas con microscopía de campo oscuro o microscopía de contraste de fase. Los frotis de cultivo se pueden teñir con tinciones de plata, inmunohistoquímica o mediante el uso de cepas marcadas con fluorescencia29,30. La PCR seguida de secuenciación del ADN es un método sensible y específico para detectar e identificar genéticamente o confirmar la especie Borrelia 30,31,32,33.

Existen muchas variaciones menores en BSK-II, y algunas están disponibles comercialmente. El protocolo descrito aquí en la sección 1 ha sido adaptado de Barbour (1984)21. El medio MKP líquido es un medio desarrollado más recientemente y se describe en la sección 2. Se prepara de acuerdo con un protocolo previamente reportado33,34, que, al igual que el medio BSK, consta de dos pasos: preparación del medio básico y preparación del medio completo. El medio de cultivo de Borrelia se puede preparar con o sin antibióticos, como se describe en la sección 3; los antibióticos actúan para reducir las bacterias contaminantes introducidas al inocular con muestras clínicas o ambientales, como se describe en la sección 4; si se inocula con cultivo puro de Borrelia sp., es posible que no se necesiten antibióticos. La fabricación de existencias de Borrelia a largo plazo es a menudo importante, y un protocolo para hacerlo se describe en la sección 5. La Sección 6 describe el uso de estos medios para aislar clones puros de Borrelia sensu lato de muestras clínicas o ambientales. Hay una serie de enfoques posibles36; A continuación se muestra uno que se encuentra para ser eficaz. El medio de recubrimiento utilizado en este protocolo es una modificación del medio de recubrimiento BSK-II37 y del medio MKP34 (con suero de conejo aumentado al 10%38).

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Protocol

Todos los estudios con muestras obtenidas de sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad y/o centro médico correspondiente, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes antes de que se recolectaran las muestras. Todos los estudios con muestras obtenidas de animales fueron aprobados y realizados bajo los lineamientos del Comité Institucional de Ética Animal. En su caso, se han obtenido aprobaciones para el muestreo ambiental.

NOTA: El éxito de la cultura depende críticamente de la calidad de los ingredientes. El medio BSK comercial está disponible y apoya robustamente el crecimiento de B. burgdorferi puro adaptado al laboratorio y especies relacionadas donde se puede usar inóculo de dosis altas para sembrar el cultivo. Para los aislamientos de cepas de material biológico primario, se prefiere un medio recién preparado y, a menudo, necesario.

Borrelia sp. son patógenos conocidos o sospechosos, y los tejidos humanos o animales no examinados también pueden ser un peligro biológico. La manipulación de material potencialmente infeccioso requiere equipo de protección personal y técnicas estériles para la seguridad del investigador. Además, el medio es tan rico en nutrientes que el cultivo se contamina fácilmente. Por lo general, se requiere contención de nivel 2 de bioseguridad para este trabajo y todo el trabajo con Borrelia sp. o muestras debe realizarse en un gabinete de seguridad biológica.

1. Instrucciones para hacer medio BSK-II

  1. Preparación del medio BSK-II completo
    1. Obtener reactivos para preparar 1 L del medio, como se muestra en la Tabla 1.
      NOTA: La pureza BSA (o falta de pureza) es crítica para un crecimiento óptimo. En particular, la pureza de BSA difiere entre el fabricante y el lote. Consulte la Tabla 2 para obtener una lista de productos más frente a productos menos exitosos. Obtener varias muestras de diferentes proveedores, probarlas para un crecimiento óptimo y luego comprar una gran cantidad del mejor lote es una estrategia efectiva para mitigar este problema y producir un buen medio.
    2. Comience disolviendo el BSA en un vaso de precipitados revolviendo en el agua, lo que tomará al menos media hora.
    3. Agregue todos los productos químicos secos y deje que se disuelvan. A continuación, agregue el CMRL.
    4. Ajustar el pH del medio BSK-II a 7,6, si es necesario, con NaOH 1 M.
    5. Agregue suero de conejo al medio BSK-II a una concentración de 6% -10%. El filtro esteriliza (tamaño de poro de 0,22 μm) el medio BSK-II. La cantidad requerida de suero depende de la especie de Borrelia . Use 6% -7% para las especies y cepas de RF, y para Borrelia burgdorferi sensu lato. Si el crecimiento no es fuerte, agregue otro suero de conejo estéril al 1% -2% al medio.
    6. Congelar las existencias de medio BSK-II en alícuotas de 100 ml o 400 ml.
    7. Para las cepas de RF, se requiere gelatina. Agregue 100 ml de gelatina estéril al 7% (ligeramente calentada para ponerla en una solución) a 400 ml de bsk-ii medio. Calentar el BSK-II con gelatina a 37 °C para que la gelatina se derrita antes de inocular el cultivo.
      NOTA: El medio puede congelarse (-20 °C) antes de la esterilización por filtro y la adición de suero de conejo y gelatina (para espiroquetas de RF) o después de la esterilización por filtro y la adición de suero (y gelatina). El medio es estable cuando se congela durante mucho tiempo. Cuando se almacena en un refrigerador, use el medio dentro de 1 mes. Las especies de RF crecen mejor con medio fresco, generalmente no más de 1 semana de edad. Si no está congelado, inspeccione visualmente la calidad del medio para detectar turbidez. Deseche el medio que parece estar contaminado, precipitando ingredientes o dudoso de otra manera.
    8. Si se van a añadir antibióticos al medio, añádalos a alícuotas medianas recién preparadas o previamente congeladas; Este último es el enfoque más flexible. Utilizar concentraciones de antibióticos como las descritas por Oliver et al.39.
    9. Mientras descongela un tubo del medio, pese los antibióticos en tubos estériles (esterilizados) de 1,7 ml o tubos cónicos estériles de 15 ml, utilizando una balanza de precisión. Prepare las soluciones madre de la siguiente manera: Disuelva 25 mg de anfotericina B en 10 ml de DMSO, 20 mg de fosfomicina en 1 ml de agua destilada esterilizada en autoclave y 50 mg de rifampicina en 1 ml de DMSO.
    10. Esterilizar con filtro (filtros de jeringa de 0,2 μm) los antibióticos y transferirlos a un nuevo tubo de tamaño apropiado.
    11. Diluir los antibióticos en una proporción de 1:1000 del medio para alcanzar su concentración final. Para 500 ml de BSK, añadir 0,5 ml de solución madre de anfotericina B (2,5 mg/ml en DMSO), 0,5 ml de solución madre de fosfomicina (20 mg/ml enH2Oestéril) y 0,5 ml de solución madre de rifampicina (US: rifampicina) (50 mg/ml en DMSO).
    12. Utilizar el medio o alícuota suplementado con antibióticos y congelar a -20 °C.
Componentes Importe (/L)
Fracción BSA V 50 g
CMRL-1066 (10x) 100 ml
Neopeptona 5 g
Hepes 6 g
Sal trisódica de ácido cítrico dihidratado 0,7 g
Glucosa 5 g
TC Yeastolate 2 g
Ácido pirúvico (sal de Na) 0,8 g
N-acetil-D-glucosamina 0,4 g
Bicarbonato de sodio 2,2 g
Agua (alta pureza) 900 ml

Tabla 1: Composición de 1 L de medio BSK-II.

Fuente Idoneidad
Serva GmbH, Heidelberg, Alemania Sí
Proliant Biologicals, Boone IA, Estados Unidos Sí
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Estados Unidos No

Tabla 2: Fuentes de BSA e idoneidad para el medio BSK-II.

2. Instrucciones para hacer MKP

  1. Preparación del medio básico
    1. Pesar y disolver cuidadosamente todos los componentes en polvo como se enumeran a continuación en la Tabla 3 en 3 /4 del volumen final deddH2O(ca. 750 ml) agitando hasta la disolución completa, que toma ~ 1 h.
    2. Después de la disolución completa, ajustar el pH con NaOH a 7,6 y el volumen a 1000 ml, y luego esterilizar por filtración (filtro de 0,22 μm).
      NOTA: El medio básico puede conservarse a -20 °C durante un máximo de 3 meses.
  2. Preparación de medio completo MKP
    1. Mezclar todos los componentes enumerados en la Tabla 4 de manera estéril; Esterilizar la gelatina en autoclave y manipular de forma estéril. Trabaje en un gabinete de seguridad biológica estéril y use un suero filtrado estéril.
    2. MKP alícuota en tubos de 50 mL. Poner una pequeña alícuota a 33 °C durante varios días, luego comprobar bajo un microscopio de campo oscuro la ausencia de contaminación.
      NOTA: Mantenga el medio completo MKP a +4 °C durante no más de 1 mes y no lo congele. El medio completo se puede esterilizar adicionalmente por filtración utilizando un filtro de 0,22 μm.
Componentes Importe (/L)
CMRL-1066 (10x sin glutamina) 100 ml (si es líquido)/9,7 g/l si es polvo
Neopeptona 3 g
Hepes 6 g
Ácido cítrico 0,7 g
Glucosa 3 g
Ácido pirúvico 0,8 g
N-acetilglucosamina 0,4 g
Bicarbonato de sodio 2 g

Tabla 3: Composición de 1 L de medio MKP básico (Kelly-Pettenkofer modificado).

Componentes Cantidad (ml)
Medio básico 500
Gelatina al 7% (en H2O) (recién esterilizada en autoclave pero no caliente) 100
Suero de conejo 36
35% BSA 17.5

Tabla 4: Composición del medio completo MKP (Kelly-Pettenkofer modificado).

3. Cultivo de Borrelia, con o sin antibióticos

  1. Realizar todos los pasos experimentales en condiciones de trabajo estériles en un armario de seguridad biológica. Desinfecte la superficie y todos los materiales con etanol al 70% y transfiéralos inmediatamente al gabinete de seguridad biológica. Esterilice con UV todos los materiales no biológicos en el gabinete de seguridad biológica durante 5 minutos antes del inicio del trabajo.
  2. Use el medio más fresco posible.
  3. Para iniciar un cultivo, precaliente el medio (33 °C - 37 °C) en una incubadora. Aplique agitación si es necesario.
    NOTA: Dependiendo del volumen del medio, este paso puede tardar varias horas.
  4. Añadir ~1 ml de cultivo de Borrelia descongelado de un glicerol o material similar, previamente almacenado a -80 °C y descongelado a temperatura ambiente (RT), tan pronto como esté líquido, a 5-15 ml de medio BSK precalentado. Inocular el cultivo en un volumen pequeño (5-15 ml de BSK) utilizando viales de vidrio o plástico disponibles comercialmente con tapones de rosca. Llene los tubos casi llenos para crear una atmósfera micro o anaeróbica. Cierre los tubos herméticamente; si se cultiva de esta manera, elCO2 no es necesario.
  5. Cultivar especies de RF (y B. persica) a 37 °C en una incubadora sin agitación ni agitación. Cultivar especies de B. burgdorferi sensu lato a 33-34 °C.
  6. Monitoree el crecimiento del cultivo de Borrelia usando contraste de fase o microscopía de campo oscuro con un aumento de 200x-400x (Figura 3). Para garantizar una distribución uniforme de las células, mezcle el cultivo con una pipeta serológica o, para más mezcla, mezcle con una pipeta de transferencia de 3 ml mientras se pipetea hacia arriba y hacia abajo.
    NOTA: Los borrelia son más visibles con un aumento más alto (200X-400X), pero son mejor contabilizados con un aumento de 200X en un hemocitómetro40. El movimiento y la morfología de Borrelia son indicativos de la presencia de estas bacterias.
  7. Para cuantificar el crecimiento bacteriano, cuente varios (10) cuadrados pequeños individuales en el patrón de cuadrícula de dieciséis campos de área de conteo en ambos lados del hemocitómetro y promedio. Multiplique el número promedio de células por cuadrado pequeño con el factor de conversión apropiado para el hemocitómetro que se utiliza para determinar el recuento de células por ml.
  8. Controle el crecimiento bacteriano a intervalos de 1-2 días. El crecimiento exponencial de Borrelia depende de la viabilidad y densidad celular y puede tardar 1 semana o más a 34 °C. Diluir los cultivos de fase exponencial en una proporción de 1:2 o 1:4 con el medio en un tubo de 1,7 ml antes de cargarlos en el hemocitómetro. Incluya una consideración apropiada del factor de dilución al determinar el recuento de células. Después de su uso, rocíe las superficies y el hemocitómetro con lejía diluida (10%) y/o etanol al 70%.
    NOTA: Los borrelia están en crecimiento exponencial cuando las concentraciones celulares son de 1-5 x 107 células/ml. Dentro de este rango, las células crecen bien.
  9. El cultivo prolongado agotará los nutrientes y cambiará el pH del medio, por lo que se requiere subcultivo. En condiciones estériles en un recipiente de seguridad biológica, transferir 1/10 del volumen de cultivo a un tubo nuevo y llenarlo con el nuevo medio (una alícuota fresca del mismo medio utilizado para cultivar el paso anterior). Una dilución 1:10 es óptima. Si se va a cambiar el volumen de cultivo, ajustar la cantidad de inóculo en consecuencia y continuar la incubación. El número de pasajes aumenta con cada cambio de medio.
  10. Para la extracción de ADN o el aislamiento de células de Borrelia , centrifugar la fase exponencial Borrelia durante 10 min a 4000 x g para granular las bacterias. Desechar el sobrenadante en residuos de riesgo biológico adecuados. Procesar las bacterias peletizadas con un kit comercial de extracción de ADN o resuspender las bacterias en un medio apropiado para el experimento previsto.
  11. Al final de cada manipulación, esterilice todo el equipo con etanol y radiación UV, según corresponda para el equipo. Recoja los residuos líquidos, incluido el exceso de cultivo, en una botella de desecho y agregue lejía a una concentración final del 10%. Coloque este frasco a -80 °C antes de desecharlo. Alternativamente, esterilice los desechos líquidos y cultive sin lejía ni alcohol en autoclave.

4. Almacenamiento a largo plazo de cultivos de Borrelia

  1. Preparación de stock de glicerol de cultivo de Borrelia
    1. Tome ~1.8 mL de alícuotas de cultivos de fase exponencial, concentraciones celulares ~107-10 8 células/mL, y agregue glicerol estéril a una concentración final de 10% (concentraciones de 5% -20% de trabajo).
    2. Colocar en viales criogénicos con tapón de rosca de 2 ml. Conservar a -80 °C.
    3. Mantenga un stock con al menos 10 tubos de cada cepa en el congelador.
  2. Una receta de almacenamiento alternativa para producir un stock de glicerol para almacenamiento permanente
    1. Mezclar 2/3 de cultivo de Borrelia con 1/3 de glicerol al 15% en caldo Brucella . Utilizar 2,8 g de caldo Brucella disuelto en 100 mL deddH2O, que fue filtrado estéril (0,22 μm).
    2. Mantener el stock de glicerol de las muestras entre -70 °C y -80 °C.

5. Aislamiento de espiroquetas de fuentes ambientales o clínicas

NOTA: Si se aísla material de fuentes humanas, animales o ambientales, se debe obtener ética de investigación, cuidado animal o certificación ecológica, según corresponda.

  1. Cultivo de Borrelia a partir de garrapatas duras
    1. Recolecte hembras adultas, machos y / o garrapatas ninfales.
    2. Esterilice la superficie todas las muestras de garrapatas sumergiéndolas en etanol al 70% durante 2 minutos y séquelas al aire en un gabinete de seguridad biológica. Diseccionar individualmente en varias piezas con un bisturí estéril. Coloque las piezas en un tubo de 2 ml que contenga 1,5 ml de medio, complementado con antibióticos.
    3. Incubar los cultivos a 34 °C y comprobar si hay espiroquetas mediante microscopía de campo oscuro o contraste de fase dos veces por semana durante las primeras 2 semanas y semanalmente a partir de entonces durante 6 semanas (más a menudo para las espiroquetas de RF). Muestras positivas para cultivo de subcultivo en 5 mL del mismo medio.
      NOTA: Los cultivos contaminados pueden purificarse en cierta medida mediante filtración utilizando un filtro de 0,2 μm; Es posible que se requieran antibióticos para resolver completamente la contaminación.
  2. Cultivo de Borrelia a partir de muestras de sangre
    NOTA: La muestra de sangre debe ser tomada por un médico, veterinario o profesional de investigación calificado, dependiendo de la fuente del material. Deben transcurrir menos de 24 h en RT entre la muestra
    Retirada y llegada al laboratorio.
    1. Obtener 10 ml de sangre, recogida en tubos de recolección de sangre de vidrio con dextrosa de citrato ácido (ACD; "parte superior amarilla") como anticoagulante. Dejar a temperatura ambiente. Se recomienda que transcurran menos de 24 h entre la recolección de sangre y la inoculación.
    2. Centrifugar la sangre con anticoagulante durante 10 min a 200-400 x g para separar el plasma de las células sanguíneas.
    3. Retire suavemente el plasma del tubo e inocule 1 ml de plasma en 5 ml de medio completo MKP precalentado. MKP se puede complementar con antibióticos. Incubar cultivos a 33 °C con inspección visual diaria y microscopía semanal de campo oscuro o contraste de fase hasta que se note el crecimiento borrelial (más a menudo para RF Borrelia), que puede tardar hasta 9 semanas.
      NOTA: Si utiliza volúmenes de inoculación mayores o menores, mantenga la proporción 1:5 de inoculante a medio. Use sueros o plasma en lugar de sangre entera.
  3. Cultivo de Borrelia a partir de biopsia de piel
    1. Esterilizar la superficie de la biopsia de piel (idealmente un cubo de 3 mm x 3 mm x 3 mm; es decir, con 70% de etanol y peróxido de hidrógeno). Coloque la muestra de biopsia en solución salina fisiológica.
      NOTA: Una muestra de biopsia debe ser tomada por un profesional médico, veterinario o de investigación calificado, dependiendo de la fuente del material. Deben transcurrir menos de 24 h en RT entre la extracción de la muestra y la llegada al laboratorio.
    2. Corte la muestra en dos a seis trozos más pequeños usando una cuchilla de afeitar estéril en una placa de Petri de vidrio estéril mientras se sumerge en la solución salina fisiológica. Transfiera todas las muestras y ~ 1 ml de la solución salina fisiológica en la que se almacenó la biopsia de piel en 5 ml de medio precalentado suplementado con antibióticos e incubar a 33 ° C.
    3. En caso de crecimiento excesivo de bacterias contaminantes, añadir antibióticos como en el paso 1.1.10 anterior, o añadiendo dos comprimidos de sulfametoxazol (23,75 mg; concentración final 5 mg/ml) + trimetoprima (1,25 mg; 0,25 mg/ml) o Bactrim (concentración inhibitoria mínima >128 μg/ml), dos comprimidos de amikacina (2 x 30 μg; concentración final 12 μg/ml), y dos comprimidos de fosfomicina (2 x 200 μg; concentración final 80 μg/ml).
      NOTA: En todos los casos, asegúrese de permanecer por debajo de la concentración inhibitoria mínima de ese antibiótico para la especie Borrelia para la cual se está intentando cultivar41,42,43.
    4. Si el cultivo es positivo para Borrelia, mantener el cultivo durante 3-4 días adicionales o hasta que la cantidad de Borrelia alcance 10 + espiroquetas en un campo de microscopio utilizando un objetivo 40X. Crear un stock de glicerol para el almacenamiento permanente.

6. Aislamiento de poblaciones monoclonales de espiroquetas de B. burgdorferi sensu lato y B. miyamotoi a partir de cultivos líquidos mediante cultivo en medios sólidos

  1. Para hacer placas, caliente 300 mL de medio completo 1.5X MKP (sin gelatina). Además, caliente 200 ml de agarosa al 1,7% (esterilizada en autoclave en agua desionizada, almacenada en RT y calentada en el microondas antes de su uso) a 55 °C. Mezclar ambos líquidos.
  2. Pipetear 15 ml de esta mezcla en cada una de las 16 placas de Petri profundas para hacer el oselayer de agar inferior.
  3. Retener el resto del medio a 55 °C en un baño maría.
    NOTA: Los Borrelia se mezclan en la capa superior de agarosa.
  4. Primero, cuantificar la densidad de cultivo de Borrelia usando un hemocitómetro y diluir a la densidad deseada en un medio líquido.
    NOTA: 500, 200, 100 y 50 espiroquetas por placa funcionan bien.
  5. Después de que las placas inferiores se hayan solidificado, agregue 10 ml de la mezcla de agarosa restante a un tubo de 15 ml que contenga la cantidad adecuada de espiroquetas.
  6. Vierta la suspensión en la parte inferior de agarosa en la placa de Petri etiquetada.
    NOTA: Dado que las espiroquetas de Borrelia son sensibles a altas temperaturas, se debe tener cuidado para garantizar que las bacterias no estén expuestas a 55 °C durante un período prolongado de tiempo; Vierta el agar superior inmediatamente después de agregarlo a las células bacterianas en el medio.
  7. Después de que las placas estén completamente solidificadas, cierre las placas de Petri y colóquelas boca abajo a 34-35 °C en 2.5% deCO2.
    NOTA: Las colonias aparecerán 1 semana después del enchapado si el procedimiento es exitoso.
  8. Para cribar y expandir las colonias individuales, seleccione colonias individuales de las placas y colóquelas en 1,5 ml de MKP líquido modificado, u otro medio adecuado, en tubos de cultivo estériles de 2 ml.
  9. Incubar los cultivos a 34 °C y examinar si hay espiroquetas mediante microscopía de campo oscuro o de fase. Utilice estos cultivos para análisis o existencias, realizadas como se describió anteriormente.

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Representative Results

Los medios de cultivo de Borrelia BSK y MKP, y sus variantes, son medios de cultivo ricos con ingredientes que deben prepararse y esterilizarse secuencialmente. Cuando se prepara correctamente, el medio BSK debe ser rojo-naranja y transparente (Figura 1). La turbidez y la precipitación que persisten después del calentamiento indican ingredientes problemáticos, producción media o contaminación; Tal medio es mejor descartarlo. Si se añade gelatina a BSK y con MKP, el medio será gelatinoso cuando se refrigere; Al calentarse, será líquido, aunque ligeramente viscoso.

El crecimiento de las culturas puras de Borrelia no cambiará la turbidez del medio. Sin embargo, el crecimiento de cultivos bacterianos, Borrelia, así como contaminantes, cambiará el color medio como resultado del indicador de pH. El crecimiento excesivo por otras bacterias producirá turbidez y materiales agrupados (Figura 2).

El crecimiento del cultivo puede ser monitoreado por contraste de fase o microscopía de campo oscuro (Figura 3 y Figura 4). Las células de Borrelia en la fase exponencial son típicamente delgadas y torcidas, y móviles hasta cierto punto. A medida que los cultivos entran en la fase estacionaria, los cuerpos redondos son cada vez más evidentes (Figura 5). Los aislados clínicos o ambientales frecuentemente contienen múltiples cepas y/o especies de Borrelia . Para aislar clones puros, se pueden colocar cultivos líquidos para aislar colonias monoclonales (Figura 6); A veces, pueden ser necesarias múltiples rondas de aislamiento de colonias.

Figure 1
Figura 1: Medio BSK y MKP . (A) BSK (con antibióticos) con cultivo puro de Borrelia burgdorferi. Con o sin B. burgdorferi el medio permanece sin turbidez visible y es de color naranja-ámbar (el color varía ligeramente con los ingredientes). (B) medio MKP, no inoculado, descongelación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Medio BSK y MKP contaminados con crecimiento excesivo de bacterias competidoras. El medio está descolorido, turbio y, con el tiempo, las bacterias competidoras mueren y precipitan al fondo del tubo. (A) Tubo BSK demasiado grande. (B) Tubo BSK viejo con bacterias contaminantes precipitadas. (C) Tubo MKP con (izquierda) y sin cultivo (medio) y cultivo contaminado (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Uso de un hemocitómetro para monitorizar el crecimiento de Borrelia . Borrelia burgdorferi cepa B31 (un subconjunto indicado por flechas) visto en un hemocitómetro (una línea de la pequeña cuadrícula está indicada por la punta de flecha) bajo contraste de fase 200X. Esta ampliación y proceso permiten el monitoreo de cultivos y la estimación de la densidad celular. La barra de escala es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagen de campo oscuro de Borrelia burgdorferi. Imagen de campo oscuro de la cepa SCW-53 de Borrelia burgdorferi , a alta densidad en fase exponencial después de 5-7 días de cultivo en medio MKP (aumento de 400X). La barra de escala es de 20 μm. Esta cepa se aisló de la garrapata dura Ixodes affinis, recolectada en Carolina del Sur, EE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Borrelia en culturas antiguas. A medida que las células de Borrelia entran en la fase estacionaria en cultivos antiguos, se ve cada vez más que las formas de cuerpo redondo reemplazan la forma espiroquetal. Estas pueden ser formas latentes o células muertas. Panel izquierdo, tinción de Dieterle; panel medio, tinción inmunohistoquímica; y panel derecho, hibridación fluorescente in situ de un cultivo de Borrelia (se presume que es B. burgdorferi basado en el origen, pero la especie y la cepa no se identificaron molecularmente) inoculado con orina canina. La recolección de los datos en la Figura 5 fue aprobada por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Mrt. Allison, número de aprobación 16-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Espiroquetas del complejo Borrelia burgdorferi sensu lato. Colonias de espiroquetas complejas Borrelia burgdorferi sensu lato cultivadas en medio sólido con el fin de aislar poblaciones clonales puras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El cultivo de bacterias en laboratorio es el trampolín para la investigación. La profunda ventaja conferida por la capacidad de cultivar se ejemplifica en la lucha, durante más de un siglo que culminó recientemente en éxito, para cultivar Treponema pallidum, la espiroqueta que es el agente etiológico de la sífilis44. Las espiroquetas de Borrelia también son difíciles de cultivar, pero la cultura es posible 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Las células de Borrelia son fastidiosas y cada especie y cepa, e incluso aisladas difieren, tanto genéticamente como a través de la adaptación al huésped del que se han aislado 51,52,53,54,55. Al hacer medios, el uso de ingredientes apropiados hace una enorme diferencia en el vigor de la cultura Borrelia o incluso en la viabilidad de la cultura. El uso de medios recién preparados, altamente enriquecidos y almacenados adecuadamente es esencial para promover el crecimiento bacteriano y es un requisito bien establecido para el crecimiento bacteriano. Para Borrelia, se requiere mantener condiciones anaeróbicas o microaeróbicas para un buen crecimiento. Esto se puede lograr simplemente llenando tubos hasta la parte superior, por lo que queda poco o nada de aire en el tubo y cultivando los cultivos sin agitación; Puede ser necesario un control más estricto del oxígeno y el dióxido de carbono para la expresión génica y estudios relacionados 26,27,28,29,30. La adición de antibióticos al medio de cultivo bacteriano puede parecer contraria a la intuición; el uso de dosis bajas de antibióticos en el medio Borrelia es para desalentar el crecimiento de bacterias de crecimiento más rápido. Si el cultivo se inocula con un aislado puro de Borrelia, no es necesaria la adición de antibióticos; Sin embargo, el uso de antibióticos añadidos es esencial para desalentar el crecimiento excesivo de bacterias competidoras cuando se inocula con muestras clínicas o ambientales. El medio BSK también se puede complementar con gelatina al 3% -7%. Esto es necesario para el crecimiento de la especie RF Borrelia 21. El uso de BSK o MKP para el crecimiento de especies de Borrelia burgdorferi sensu lato depende de la fuente del aislado. Ambos medios apoyan el crecimiento de cultivos establecidos, pero se ha encontrado que MKP funciona mejor cuando se siembran nuevos cultivos con un bajo número de células de Borrelia, como ocurre con aislados clínicos o ambientales23,24. Este medio también permite el cultivo de B. miyamotoi56,57,58. En última instancia, hay un elemento de arte en la ciencia del crecimiento de microbios fastidiosos, pero es posible con cuidado y persistencia.

La cultura de Borrelia subyace a los avances en la investigación biomédica. El cultivo de Borrelia ha permitido determinar el genoma completo y el proteoma de muchas especies de Borrelia, lo que ha permitido a los investigadores comenzar a desentrañar la evolución y biología de estas espiroquetas54,58,59. Del mismo modo, el acceso a cultivos puros de Borrelia permite la comprensión de las muchas interacciones complejas de Borrelia con el huésped mamífero y el vector artrópodo 61,62,63,64,65, incluidas las interacciones con el sistema inmune del huésped 11,65, permite inferir mecanismos de transmisión 29,66, y proporciona la herramienta de investigación clave para distinguir las células cultivables, por lo tanto necesariamente vivas, de los desechos celulares, una distinción que es crítica para desentrañar los mecanismos de patogénesis, así como los regímenes de tratamiento efectivos 8,67,68,69,70,71. Si bien el cultivo in vitro de Borrelia puede tomar varias semanas antes de que las espiroquetas sean lo suficientemente abundantes para la detección, lo que limita las aplicaciones de diagnóstico clínico, la comprensión fundamental de la biología de Borrelia, la genómica, las interacciones huésped-patógeno y muchas más aplicaciones de Borrelia se ha basado en la capacidad de aislar Borrelia pura. cultivos a partir de aislados ambientales, y amplificar esos aislados a través del cultivo para producir suficiente material para el análisis bioquímico y genético. Existe un impulso social para una respuesta rápida a las infecciones para apoyar el diagnóstico y tratamiento rápidos. El otro componente de esta necesidad, sin embargo, es la investigación biomédica y biológica necesaria para una base sólida sobre la cual tratar y prevenir enfermedades de manera adecuada y exitosa. Si bien es un desafío, el cultivo in vitro de espiroquetas de Borrelia es posible y puede satisfacer estas necesidades.

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Disclosures

No se declararon conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y la Fundación Canadiense de la Enfermedad de Lyme (AB y VL), el Consejo Sueco de Investigación (SB, M-LF e IN), el proyecto TAČR GAMA 2 - "Apoyo a la verificación del potencial de aplicación 2.0 en el Centro de Biología CAS" (TP01010022) (MG y NR), y por una subvención del Ministerio de Salud de la República Checa NV19-05-00191 (MG y NR). Agradecemos a S. Vranjes (2021, Rudenko lab) por la imagen de la Figura 4 y a J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) por las imágenes de la Figura 5. Agradecemos a todos los investigadores que han contribuido al campo y pedimos disculpas a aquellos cuyo trabajo no pudimos citar debido a limitaciones de espacio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

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Inmunología e infección Número 189
Métodos de cultivo de espiroquetas de Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato Complex y fiebre recidivante <em>Borrelia</em>
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Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

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