Summary
体外培养是检测活细菌存在的直接方法。该协议描述了各种螺旋疏螺旋体的培养方法，包括伯氏疏螺旋体复合体，回归热疏螺旋体属和宫本疏螺旋体的培养方法。 这些物种挑剔且生长缓慢，但可以养殖。
Abstract
疏螺旋体由三组物种组成，莱姆疏螺旋体病（LB）组，也称为B. burgdorferi sensu lato（s.l.），最近重新分类为疏螺旋体，回归热（RF）组Borrelia和第三组爬行动物相关的螺旋体。基于培养的方法仍然是实验室检测研究和临床工作中细菌感染的金标准，因为从体液或组织中培养病原体可直接检测复制的病原体并为研究提供源材料。螺旋疏螺旋体和螺旋疏螺旋体挑剔且生长缓慢，因此通常不用于临床目的培养;然而，文化对于研究是必要的。该协议展示了成功培养LB和RF螺旋体所需的方法和配方，包括来自伯氏螺旋体的所有公认物种，包括B. afzelii，B. americana，B. andersonii，B. bavariensis，B. bissettii/bissettiae，B. burgdorferi sensu stricto （s.s.），加利福尼亚双歧杆菌，卡罗利宁双歧杆菌，智利双歧杆菌，芬兰芽孢杆菌，加里尼双歧杆菌，日本双歧杆菌，库尔滕巴奇双歧杆菌，双歧杆菌， 卢西塔尼双歧杆菌、马里蒂玛双歧杆菌、蛋黄双歧杆菌、斯皮尔曼双歧杆菌、狸猫双歧杆菌、图尔迪双歧杆菌、中华双歧杆菌、瓦莱西亚双歧杆菌、长江双歧杆菌和射频螺旋体、安氏双歧杆菌、苜蓿芽孢杆菌、苜蓿科、鳄鱼双歧杆菌、杜托尼双歧杆菌、西班牙双歧杆菌、波斯双歧杆菌、复发双歧杆菌和宫本双歧杆菌。生长LB和RF螺旋体的基本培养基是Barbour-Stoenner-Kelly（BSK-II或BSK-H）培养基，它可靠地支持螺旋体在已建立的培养物中的生长。为了能够从蜱或宿主来源的样品中培养出新分离的疏螺旋体分离株，其中接种物中的初始螺旋体数量较低，首选改良的Kelly-Pettenkofer（MKP）培养基。这种培养基也支持宫本双歧杆菌的生长。射频螺旋体的培养成功也主要取决于成分的质量。
Introduction
疏螺旋体是螺旋体细菌的一个属，包括三个主要分支：莱姆疏螺旋体病（LB）组，回归热（RF）组，以及似乎仅限于爬行动物的特征不太好的组。随着允许基因组和蛋白质组比较的分子方法的出现，疏螺旋体分类法也在不断变化，就像大多数其他分类组1，2，3，4，5，6，7一样。LB组（也称为莱姆病组）传统上被称为伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sensu lato），以其特征最好的成员伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sensu stricto）命名。本文使用目前使用最广泛的术语：LB、RF 和爬行动物相关组，并描述了 LB 和 RF 组的培养协议。
正如螺旋体科成员所预期的那样，疏螺旋体可以采用独特的长而薄的螺旋形状，通常长20-30μm，宽0.2-0.3μm。然而，疏螺旋体细胞具有高度多形性，由于其复杂的细胞和遗传结构，可以在培养物和体内1，8中采用许多其他形状。在其螺旋体形式中，平面正弦波形态是由其轴向内鞭毛在内膜和外膜之间的周质空间中旋转引起的。这种结构使细胞具有高度运动性，外膜含有蛋白质，使细胞能够与宿主组织相互作用9，10。外膜蛋白的表达受到严格调控，不仅影响宿主组织侵袭，还影响与宿主免疫系统的相互作用11。这种复杂的基因表达使疏螺旋体细胞能够在脊椎动物宿主和无脊椎动物载体的不同环境之间穿梭。疏螺旋体的基因组在原核生物中是不寻常的，由线性而不是圆形染色体组成。除线性染色体外，疏螺旋体物种还含有7-21个质粒，有些是线性的，有些是圆形的。质粒含有宿主适应和毒力所需的大部分基因，来自噬菌体的环状质粒被认为是螺旋体细胞之间大部分水平基因流动的原因12，13。与宿主适应中的作用一致，莱姆疏螺旋体病组的一些（可能许多或全部）成员在培养物中丢失质粒14。研究得最好的“实验室适应”伯氏疏螺旋体B. burgdorferi菌株B31在该物种的野生分离株中发现的9个质粒中只有7个15。同样，加里尼双歧杆菌在培养物中丢失质粒16。一些研究表明，RF物种和宫本双歧杆菌在培养时保留质粒14，17，但最近的研究表明，长期体外培养18改变了质粒和感染性。
基于培养的方法仍然是实验室检测细菌感染的金标准，无论是研究和临床工作14，17。从体液或组织中培养病原体可直接检测复制病原体，并为研究提供源材料14，17。该协议展示了成功培养LB组螺旋体以及RF疏螺旋体和宫本芽孢杆菌所需的方法和配方。生长螺旋体疏螺旋体的基本培养基是Barbour-Stoenner-Kelly培养基（BSK-II或市售的BSK-H），有或没有抗生素以减少污染原核生物的生长。该介质改编自最初用于支持RF Borrelia19的介质，由Stoenner20和Barbour21进一步修改。此后开发了许多修饰，每种修饰都对细菌生理学产生影响，可影响生长，感染性和致病性22。该培养基可靠地支持已建立培养物中螺旋体的生长，并已用于从蜱、哺乳动物和临床样品中分离螺旋体23。最近开发的变体，改良的Kelly-Pettenkofer（MKP）培养基，当从环境样品中分离新的疏螺旋体分离物时，当可用于播种培养物的样品中存在的螺旋体数量低时，可以提供更好的分离成功率，形态和运动性23，24。在所有情况下，种植的成功都主要取决于新鲜制备的培养基和适当成分的使用;并非所有商业成分都能生产高质量的培养基。接种的培养物可以方便地在传统的32-34°C培养箱中在少量残留环境氧气存在的情况下孵育，而无需摇动。螺旋疏螺旋体是厌氧菌，但在自然界中暴露于氧气和二氧化碳浓度的波动中，并对基因表达的变化做出反应26，27，28，29。因此，基因表达、生长和其他代谢研究应使用氧控培养箱或厌氧室来控制氧气和二氧化碳水平。在培养中，每周或更频繁地使用暗场显微镜或相差显微镜检查培养物是否存在螺旋体。培养涂片可以用银染、免疫组化或通过使用荧光标记菌株29，30 染色。PCR和DNA测序是一种灵敏和特异性的方法，用于检测和遗传鉴定或确认疏螺旋体物种30，31，32，33。
BSK-II存在许多小的变体，有些是商业上可获得的。第1节中描述的协议改编自Barbour（1984）21。液体MKP培养基是最近开发的培养基，在第2节中描述。它是根据先前报道的方案33，34制备的，该方案与BSK培养基类似，由两个步骤组成：碱性培养基的制备和完整培养基的制备。疏螺旋体培养基可以制备有或没有抗生素，如第3节所述;抗生素的作用是减少接种临床或环境样本时引入的污染细菌，如第4节所述;如果接种纯疏螺旋体培养物，则可能不需要抗生素。制作长期疏螺旋体库存通常很重要，第 5 节描述了这样做的方案。第6节描述了使用这些培养基从临床或环境样品中分离纯感性疏螺旋体克隆。有许多可能的方法36;下面是一个发现有效的。本协议中使用的电镀介质是BSK-II电镀介质37和MKP培养基34的修改（兔血清增加到10%38）。
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Protocol
所有涉及从人类受试者获得的样本的研究均已获得相关大学和/或医疗机构的机构审查委员会的批准，并在收集样本之前获得参与者的书面知情同意。所有涉及从动物身上获得的样本的研究均在机构动物伦理委员会的指导下获得批准和进行。在相关情况下，已获得环境取样的批准。
注意：培养的成功在很大程度上取决于成分的质量。商业BSK培养基可用，可有力地支持实验室适应的纯 伯氏疏螺旋体 和相关物种的生长，其中高剂量接种物可用于播种培养物。对于从初级生物材料中分离出菌株，新鲜制备的培养基是首选，并且通常是必需的。
疏螺旋体 是已知或可疑的病原体，未经筛查的人类或动物组织也可能是一种生物危害。处理潜在传染性物质需要个人防护设备和无菌技术以确保研究者的安全。此外，培养基营养丰富，培养物很容易被污染。这项工作通常需要生物安全2级遏制，所有与 疏螺旋体 或样品的工作都应在生物安全柜中进行。
1. BSK-II培养基的制作说明
- 制备完整的BSK-II培养基
- 获得试剂以制备1L培养基，如 表1所示。
注意：BSA纯度（或纯度不足）对于最佳生长至关重要。特别是，BSA纯度在制造商和批次之间有所不同。请参阅 表 2 ，了解成功与不太成功的产品列表。从不同的供应商处获取多个样品，测试它们的最佳生长，然后购买大量最好的批次是缓解此问题并生产良好培养基的有效策略。 - 首先通过在水中搅拌将BSA溶解在烧杯中，这至少需要半小时。
- 加入所有干化学品，让它们溶解。然后添加 CMRL。
- 如有必要，用 1 M NaOH 将 BSK-II 培养基的 pH 值调节至 7.6。
- 将兔血清加入BSK-II培养基中，浓度为6%-10%。过滤灭菌（0.22μm孔径）BSK-II培养基。所需的血清量取决于 疏螺旋体 属。对 RF 种类和菌株以及 Borrelia burgdorferi lato 使用 6%-7%。如果生长不强烈，请在培养基中再加入1%-2%的无菌兔血清。
- 将 BSK-II 培养基的原液冷冻为 100 mL 或 400 mL 等分试样。
- 对于射频菌株，需要明胶。将 100 mL 7% 无菌明胶（稍微加热以放入溶液中）加入 400 mL BSK-II 培养基中。在接种培养物之前，用明胶加热BSK-II，使明胶融化。
注意：在过滤器灭菌和添加兔血清和明胶（用于RF螺旋体）之前或过滤器灭菌和血清（和明胶）添加后，可以冷冻培养基（-20°C）。培养基长时间冷冻时稳定。存放在冰箱中时，请在 1 个月内使用该培养基。RF物种在新鲜培养基下生长最好，通常不超过1周龄。如果未冷冻，请目视检查培养基的质量是否有浊度。丢弃似乎被污染、沉淀成分或其他可疑的培养基。 - 如果要将抗生素添加到培养基中，请将其添加到新鲜制备的培养基或先前冷冻的等分试样中;后者是更灵活的方法。使用Oliver等人描述的抗生素浓度39。
- 解冻培养基管时，使用精密天平将抗生素称量到无菌（高压灭菌）1.7 mL管或无菌15 mL锥形管中。准备储备溶液如下：将 25 mg 两性霉素 B 溶解在 10 mL DMSO 中，将 20 mg 磷霉素溶解在 1 mL 高压灭菌蒸馏水中，将 50 mg 利福平溶解在 1 mL DMSO 中。
- 过滤灭菌（0.2μm注射器过滤器）抗生素并将它们转移到适当尺寸的新管中。
- 以培养基的1：1000比例稀释抗生素以达到其最终浓度。对于 500 mL BSK，加入 0.5 mL 两性霉素 B 储备溶液（2.5 mg/mL DMSO 溶液）、0.5 mL 磷霉素储备溶液（20 mg/mL 无菌 H2O 溶液）和 0.5 mL 利福平（美国：利福平）储备溶液（50 mg/mL DMSO 溶液）。
- 使用补充抗生素的培养基或等分试样，并在-20°C下冷冻。
- 获得试剂以制备1L培养基，如 表1所示。
| 成分 | 金额（/升） |
| BSA 分数 V | 50 克 |
| CMRL-1066 （10x） | 100毫升 |
| 新吡咯酮 | 5 克 |
| 赫佩斯 | 6 克 |
| 柠檬酸三钠盐二水合物 | 0.7 克 |
| 葡萄糖 | 5 克 |
| 叶斯托拉特 | 2 克 |
| 丙酮酸（钠盐） | 0.8 克 |
| N-乙酰基-D-葡萄糖胺 | 0.4 克 |
| 碳酸氢钠 | 2.2 克 |
| 水（高纯度） | 900毫升 |
表1：1 L BSK-II培养基的组成。
| 源 | 适用性 |
| 塞尔瓦有限公司，德国海德堡 | 是的 |
| Proliant Biologicals， Boone IA， USA | 是的 |
| Sigma （Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich）， 圣路易斯， 密苏里州， 美国 | 不 |
表2：BSA的来源和对BSK-II培养基的适用性。
2. 制作MKP的说明
- 碱性培养基的制备
- 仔细称取并溶解下表3中列出的所有粉末组分，搅拌直至完全溶解，这需要~1小时。
- 完全溶解后，用NaOH调节pH至7.6，体积至1000mL，然后通过过滤（0.22μm过滤器）灭菌。
注意：碱性培养基可在-20°C下储存长达3个月。
- MKP完全培养基的制备
- 以无菌方式混合 表4 中列出的所有组分;通过高压灭菌对明胶进行灭菌，并以无菌方式处理。在无菌生物安全柜中工作，并使用无菌过滤血清。
- 在 50 mL 管中等分 MKP。将一个小等分试样在33°C下放置几天，然后在暗场显微镜下检查是否有污染。
注意：将MKP完全培养基在+ 4°C下保存不超过1个月，并且不要冷冻。完整的培养基可以通过使用0.22μm过滤器过滤进行额外灭菌。
| 成分 | 金额（/升） |
| CMRL-1066 （10x 不含谷氨酰胺） | 100 mL（如果是液体）/9.7 g/L（如果是粉末） |
| 新吡咯酮 | 3 克 |
| 赫佩斯 | 6 克 |
| 柠檬酸 | 0.7 克 |
| 葡萄糖 | 3 克 |
| 丙酮酸 | 0.8 克 |
| N-乙酰葡糖胺 | 0.4 克 |
| 碳酸氢钠 | 2 克 |
表3：1L碱性MKP（改良的凯利-佩滕科弗）培养基的组成。
| 成分 | 量（毫升） |
| 碱性培养基 | 500 |
| 7%明胶（H 2 O）（新鲜高压灭菌但不热） | 100 |
| 兔血清 | 36 |
| 35% 糖醇酸 | 17.5 |
表4：MKP（改良的凯利-佩滕科弗）完全培养基的组成。
3. 疏螺旋体培养，有或没有抗生素
- 在生物安全柜的无菌工作条件下执行所有实验步骤。用70%乙醇对表面和所有材料进行消毒，并立即将其转移到生物安全柜中。在开始工作之前，对生物安全柜中的所有非生物材料进行紫外线消毒5分钟。
- 尽可能使用最新鲜的培养基。
- 要开始培养，请在培养箱中预热培养基（33°C - 37°C）。如果需要，请摇匀。
注意：根据介质的体积，此步骤可能需要几个小时。 - 将来自甘油或类似储备液的 ~1 mL 解冻 疏螺旋体 培养物（先前储存在 -80 °C 并在室温 （RT） 下解冻）中加入 5-15 mL 预热的 BSK 培养基中。使用市售的带螺旋盖的玻璃或塑料小瓶将培养物接种到小体积（5-15 mL BSK）中。将管子几乎填满以形成微氧或厌氧气氛。紧紧关闭管子;如果以这种方式培养，则不需要CO2 。
- 在培养箱中以37°C生长RF物种（和 B. persica），无需搅拌或搅拌。在33-34°C下生长B . burgdorferi sensu lato物种。
- 使用相衬或暗场显微镜在200x-400x放大倍率下监测疏 螺旋体 培养物的生长（图3）。为确保细胞均匀分布，请用血清移液管混合培养物，或在上下移液时与 3 mL 移液器混合更多。
注意： 疏螺旋体 在较高放大倍率（200X-400X）下最明显，但在血细胞计数器40上以200X放大倍率下可计数最佳。 疏螺旋体 的运动和形态表明存在这些细菌。 - 为了量化细菌生长，在血细胞计数器两侧计数区域的十六场网格模式中计数几（10）个单独的小方块和平均值。将每个小方块的平均细胞数乘以适合用于确定每毫升细胞计数的血细胞计数器的转换因子。
- 每隔1-2天监测细菌生长。 疏螺旋体 的指数增长取决于活力和细胞密度，在34°C下可能需要1周或更长时间。 在上样到血细胞计数器之前，将指数期培养物与培养基在 1.7 mL 管中以 1：2 或 1：4 的比例稀释。在确定细胞计数时，包括适当考虑稀释因子。使用后，用稀释的漂白剂（10%）和/或70%乙醇喷洒表面和血细胞计数器。
注意：当细胞浓度为 1-5 x 107 个细胞/mL 时，疏螺旋体呈指数增长。在这个范围内，细胞生长良好。 - 扩展培养会消耗营养物质并改变培养基pH值，因此需要进行传代培养。在生物安全柜中的无菌条件下，将培养体积的1/10转移到新管中，并用新培养基（用于生长前一次传代的相同培养基的新鲜等分试样）填充。1：10 的稀释度是最佳选择。如果要改变培养体积，请相应地调整接种量，并继续孵育。传代次数随着每次介质的变化而增加。
- 为了提取DNA或分离疏螺旋 体 细胞，将指数期 疏螺旋 体以4000× g 离心10分钟以沉淀细菌。将上清液丢弃在合适的生物危害废物中。使用商业DNA提取试剂盒处理沉淀的细菌，或将细菌重悬于适当的培养基中以进行预期的实验。
- 在每次操作结束时，根据设备的情况，用乙醇和紫外线辐射对所有设备进行消毒。将液体废物（包括多余的培养物）收集在废瓶中，并加入漂白剂至终浓度为10%。在丢弃之前将此瓶子放在-80°C。或者，通过高压灭菌对液体废物和培养物进行灭菌，而无需漂白剂或酒精。
4. 疏螺旋体 培养物的长期储存
- 伯氏疏螺旋体培养甘油原液的制备
- 取~1.8mL等分试样的指数期培养物，细胞浓度~10 7-10 8个细胞/ mL，并加入无菌甘油至终浓度为10%（浓度为5%-20%工作）。
- 放入 2 mL 螺旋盖低温小瓶中。储存在-80°C。
- 在冰箱中保持每种菌株至少 10 个管的库存。
- 生产永久储存的甘油原液的替代储存配方
- 在布鲁氏菌肉汤中将 2/3 的疏螺旋体培养物与 1/3 的 15% 甘油混合。使用溶解在100mL ddH 2 O中的2.8g布鲁氏菌肉汤，无菌过滤（0.22μm）。
- 将样品的甘油原液保持在-70°C至-80°C。
5. 从环境或临床来源分离螺旋体
注意：如果从人类、动物或环境来源分离材料，则必须酌情获得研究伦理、动物护理或生态认证。
- 硬蜱虫疏 螺旋体 的培养
- 收集成年雌性、雄性和/或若虫蜱。
- 将所有蜱虫样品浸入70%乙醇中2分钟并在生物安全柜中风干，对所有蜱虫样品进行表面灭菌。用无菌手术刀单独解剖成几块。将碎片放入含有 1.5 mL 培养基并补充抗生素的 2 mL 管中。
- 在34°C孵育培养物，并通过暗场或相差显微镜检查螺旋体，前2周每周两次，此后每周检查6周（RF螺旋体更常见）。在同一培养基的5 mL中传代培养阳性样品。
注意：可以使用0.2μm过滤器过滤在一定程度上纯化受污染的培养物;可能需要抗生素才能完全解决污染。
- 从血液样本中培养疏螺旋体
注意：血液样本应由合格的医学、兽医或研究专业人员采集，具体取决于材料的来源。样品之间应经过 RT 少于 24 小时
移除并到达实验室。- 获取 10 mL 血液，用酸柠檬酸葡萄糖 （ACD;“黄顶”）作为抗凝剂。在室温下放置。建议在采血和接种之间少于24小时。
- 用抗凝剂以200-400× g 离心血液10分钟，以将血浆与血细胞分离。
- 轻轻地从管中取出血浆，并将 1 mL 血浆接种到 5 mL 预热的 MKP 完全培养基中。MKP可以补充抗生素。在33°C下孵育培养物，每天进行目视检查和每周一次的暗场或相差显微镜检查，直到注意到疏螺旋体生长（更常见于 RF疏螺旋体），这可能需要长达9周的时间。
注意：如果使用更大或更小的接种量，请保持接种剂与培养基的 1：5 比例。使用血清或血浆而不是全血。
- 皮肤活检培养疏螺旋体
- 对皮肤活检进行表面消毒（理想情况下是 3 mm x 3 mm x 3 mm 立方体;即用 70% 乙醇和过氧化氢）。将活检样本置于生理盐水中。
注意：活检样本应由合格的医学、兽医或研究专业人员采集，具体取决于材料的来源。在室温下，从样品取出到到达实验室之间应少于24小时。 - 在无菌玻璃培养皿中浸入生理盐水中时，使用无菌剃须刀片将样品切成两到六个较小的块。将所有样品和~1mL储存皮肤活检的生理盐水转移到补充有抗生素的5mL预热培养基中，并在33°C下孵育。
- 如果污染细菌过度生长，请按照上述步骤1.1.10添加抗生素，或加入两片磺胺甲噁唑（23.75毫克;终浓度5毫克/毫升）+甲氧苄啶（1.25毫克;0.25毫克/毫升）或巴克曲姆（最低抑菌浓度>128微克/毫升），两片阿米卡星（2×30微克;终浓度12微克/毫升）， 和两片磷霉素（2 x 200 μg;终浓度 80 μg/mL）。
注意：在所有情况下，请确保保持在该抗生素的最低抑制浓度以下，用于尝试培养的疏螺旋体物种41，42，43。 - 如果培养物对疏螺旋体呈阳性，则使用40X物镜在显微镜视野中将培养物再保持3-4天或直到伯氏疏螺旋体的量达到10+螺旋体。创建甘油原液以进行永久储存。
- 对皮肤活检进行表面消毒（理想情况下是 3 mm x 3 mm x 3 mm 立方体;即用 70% 乙醇和过氧化氢）。将活检样本置于生理盐水中。
6. 通过在固体培养基上培养从液体培养物中分离伯氏螺旋体和宫本芽孢杆菌的单克隆种群
- 制作板时，加热 300 mL 的 1.5X MKP 完全培养基（不含明胶）。此外，将200mL的1.7%琼脂糖（在去离子水中高压灭菌，储存在室温下，并在使用前微波）至55°C。 混合两种液体。
- 将 15 mL 的这种混合物移液到 16 个深培养皿中的每一个中，以制作底部琼脂造片层。
- 将培养基的其余部分保留在55°C的水浴中。
注意： 将疏螺旋体 混合到顶部琼脂糖层中。 - 首先，使用血细胞计数器定量疏 螺旋体 培养密度，并在液体培养基中稀释至所需密度。
注意：每板 500、200、100 和 50 个螺旋体效果很好。 - 底板凝固后，将 10 mL 剩余的琼脂糖混合物加入含有适当数量的螺旋体的 15 mL 管中。
- 将悬浮液倒在标记的培养皿中的底部琼脂糖上。
注意：由于螺旋 疏螺旋 体对高温敏感，因此应注意确保细菌不会长时间暴露在55°C下;将顶部琼脂添加到培养基中的细菌细胞中后立即倒入。 - 板完全凝固后，关闭培养皿并将其倒置在34-35°C的2.5%CO2中。
注意：如果手术成功，菌落将在接种后 1 周出现。 - 要筛选和扩增单个菌落，请从平板中选择单个菌落，并将其放入无菌 2 mL 培养管中的 1.5 mL 改性液体 MKP 或其他合适的培养基中。
- 将培养物在34°C孵育，并通过暗场或相显微镜检查螺旋体。使用这些培养物进行分析或原液，如上所述。
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Representative Results
疏螺旋体 培养基BSK和MKP及其变体是丰富的培养基，其成分需要按顺序制备和灭菌。正确制备后，BSK培养基应为红橙色和透明（图1）。变暖后持续存在的浊度和沉淀表明成分有问题、培养基生产或污染;这种介质最好丢弃。如果将明胶添加到BSK和MKP中，则冷藏时培养基会呈凝胶状;加热后，它将是液体，尽管略带粘性。
纯 疏螺旋体 培养物的生长不会改变培养基的浊度。然而，细菌培养物， 疏螺旋体以及污染物的生长会因pH指示剂而改变培养基颜色。其他细菌的过度生长会产生浑浊和结块的物质（图2）。
培养物生长可以通过相衬或暗场显微镜监测（图3 和 图4）。指数期的 疏螺旋体 细胞通常细长且扭结，并且在一定程度上是可动的。随着培养物进入固定期，圆形体越来越明显（图5）。临床或环境分离株通常含有多种 疏螺旋体 菌株和/或物种。为了分离纯克隆，可以接种液体培养物以分离单克隆菌落（图6）;有时，可能需要多轮菌落分离。
图1：BSK和MKP培养基 。 （A）BSK（含抗生素）与 伯氏疏螺旋体的纯培养物。有或没有 伯氏疏螺旋体 培养基保持不可见的浑浊，呈橙色琥珀色（颜色因成分而异）。（B）MKP培养基，未接种，解冻。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：受污染的 BSK 和 MKP 培养基，竞争细菌过度生长。 培养基变色，浑浊，随着时间的推移，竞争细菌死亡并沉淀到管底部。（A）过度生长的BSK管。（B）带有沉淀污染细菌的旧BSK管。（C）带（左）和不带（中间）培养物和污染培养物（右）的MKP管。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用血细胞计数器监测疏螺旋体生长。 在200X相衬下在血细胞计数器上观察的伯氏疏螺旋体菌株B31（由箭头指示的子集）（小网格的一行由箭头指示）。这种放大倍数和过程允许监测培养物和估计细胞密度。比例尺为 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：伯氏疏螺旋体的暗场图像。 伯氏疏螺旋体菌株SCW-53的暗场图像，在MKP培养基（400X放大倍率）中培养5-7天后，呈指数期高密度。比例尺为 20 μm。该菌株是从在美国南卡罗来纳州收集的硬蜱硬蜱中分离出来的。请点击此处查看此图的大图。
图5：旧文化中的疏螺旋体。 随着疏螺旋体细胞进入旧培养物中的固定期，越来越多地看到圆形体形式取代螺旋体形式。这些可能是休眠形式或死细胞。左图，迪特尔染色;中图，免疫组织化学染色;右图，用犬尿接种疏螺旋体培养物（根据起源推测为伯氏疏螺旋体，但未分子鉴定物种和菌株）的荧光原位杂交。图5中的数据收集得到了艾里森大学动物护理委员会的批准，批准号为16-1。请点击此处查看此图的大图。
图 6：伯氏疏螺旋体伯氏疏螺旋体的菌落在固体培养基上生长，以分离纯克隆种群。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
细菌的实验室培养是研究的跳板。培养能力所赋予的深远优势体现在一个多世纪以来，直到最近才取得成功的梅毒螺旋体（梅毒螺旋体）的斗争中，44.螺旋疏螺旋体也对培养具有挑战性，但培养是可能的23，24，34，44，45，46，47，48，49。
疏螺旋体细胞是挑剔的，每个物种和菌株，甚至分离物都不同，无论是遗传上还是通过适应它们被分离的宿主51，52，53，54，55。在制作培养基时，使用适当的成分会对疏螺旋体培养的活力甚至培养物的生存能力产生巨大影响。使用新鲜制备、高度富集和正确储存的培养基对于促进细菌生长至关重要，并且是细菌生长的既定要求。对于疏螺旋体，保持厌氧或微需氧条件是良好生长所必需的。这可以通过将试管填充到顶部来实现，因此管中几乎没有空气残留并在不搅拌的情况下培养培养物;基因表达和相关研究可能需要更严格的氧气和二氧化碳控制26，27，28，29，30。在细菌培养基中添加抗生素似乎违反直觉;在疏螺旋体培养基中使用低剂量的抗生素是为了阻止生长较快的细菌的生长。如果培养物接种纯疏螺旋体分离株，则不需要添加抗生素;然而，在接种临床或环境样本时，使用添加的抗生素对于阻止竞争细菌的过度生长至关重要。BSK培养基也可以补充3%-7%的明胶。这是RF疏螺旋体物种21的生长所必需的。使用BSK或MKP生长伯氏疏螺旋体取决于分离株的来源。两种培养基都支持已建立培养物的生长，但已发现MKP在接种具有少量疏螺旋体细胞的新培养物时表现更好，例如临床或环境分离株23，24。该培养基还允许培养宫本双歧杆菌56，57，58。 归根结底，培养挑剔的微生物的科学有艺术元素，但只要小心和坚持，这是可能的。
疏螺旋体的文化是生物医学研究进步的基础。疏螺旋体的培养允许确定许多疏螺旋体物种的全基因组和蛋白质组，这使得研究人员能够开始解开这些螺旋体的进化和生物学54，58，59。同样，获得疏螺旋体的纯培养物可以了解疏螺旋体与哺乳动物宿主和节肢动物载体61，62，63，64，65的许多复杂相互作用，包括与宿主免疫系统的相互作用11，65，可以推断传播机制29，66，并提供了区分可培养细胞（因此必然是活细胞）和细胞碎片的关键研究工具，这一区别对于揭示发病机制以及有效治疗方案至关重要8，67，68，69，70，71。虽然体外疏螺旋体培养可能需要数周时间才能使螺旋体足够丰富以进行检测，但限制了临床诊断应用，但对疏螺旋体生物学、基因组学、宿主-病原体相互作用以及更多应用的基本了解依赖于分离纯疏螺旋体的能力从环境分离株中培养，并通过培养扩增这些分离株，以产生足够的生化和遗传分析材料。社会正在推动对感染做出快速反应，以支持快速诊断和治疗。然而，这种需求的另一个组成部分是生物医学和生物学研究，为适当和成功地治疗和预防疾病奠定坚实的基础。虽然具有挑战性，但螺旋体的体外培养是可能的，并且可以支持这些需求。
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Disclosures
没有宣布利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究理事会和加拿大莱姆病基金会（AB和VL），瑞典研究理事会（SB，M-LF 和IN），TAČR GAMA 2项目-“支持生物中心CAS的应用潜力验证2.0”（TP01010022）（MG和NR）的部分支持，以及捷克共和国卫生部NV19-05-00191（MG和NR）的赠款。我们感谢 S. Vranjes（2021 年，鲁登科实验室）提供图 4 中的图像，感谢 J. Thomas-Ebbett（2021 年，劳埃德实验室）提供图 5 中的图像。我们感谢所有为该领域做出贡献的研究人员，并向那些由于篇幅限制而无法引用其工作的人道歉。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL tubes | VWR | 87003-294 | Standard item - any supplier will do |
| 0.2 µm Sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | Standard item - any supplier will do |
| 10 µL barrier pipette tip | Neptune | BT10XLS3 | Standard item - any supplier will do |
| 10 mL Serological pipettes | Celltreat | 229011B | Standard item - any supplier will do |
| 1000 µL barrier pipette tip | Neptune | BT1000.96 | Standard item - any supplier will do |
| 15 mL tube | Celltreat | 188261 | Standard item - any supplier will do |
| 20 µL barrier pipette tip | Neptune | BT20 | Standard item - any supplier will do |
| 20 mL Sterile syringe | BD | 309661 | Standard item - any supplier will do |
| 200 µL barrier pipette tip | Neptune | BT200 | Standard item - any supplier will do |
| 25 mL Screw Cap Culture Tubes | Fisher Scientific | 14-933C | Standard item - any supplier will do |
| 25 mL Serological pipettes | Celltreat | 229025B | Standard item - any supplier will do |
| 3 mL Sterile syringe | BD | 309657 | Standard item - any supplier will do |
| 35% BSA | Sigma | A-7409 | Source is important - see note |
| 5 mL Serological pipettes | Celltreat | 229006B | Standard item - any supplier will do |
| 50 mL tube | Celltreat | 229421 | Standard item - any supplier will do |
| 6.5 ml MKP glass tubes | Schott | Schott Nr. 26 135 115 | Standard item - any supplier will do |
| Amikacine | Sigma | PHR1654 | Standard item - any supplier will do |
| Amphotericin B | Sigma | A9528-100MG | Standard item - any supplier will do |
| Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole | Sigma | PHR1126-1G | Standard item - any supplier will do |
| BBL Brucella broth | BD | 211088 | Standard item - any supplier will do |
| Biosafety Cabinet | Labconco | 302419100 | Standard item - any supplier will do |
| Blood collection tubes (yellow top - ACD) | Fisher Scientific | BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) | Standard item - any supplier will do |
| BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum] | Darlynn biologicals | BB83-500 | Standard item - any supplier will do |
| centrifuge | Eppendorf | model 5430 | Standard item - any supplier will do |
| Citric acid TrisodiumSaltDihydrate | Sigma | C-8532 100 g | Standard item - any supplier will do |
| CMRL | Gibco BRL | 21540 500 mL | Standard item - any supplier will do |
| CMRL-1066 | Gibco | 21-510-018 | Standard item - any supplier will do |
| Cryogenic Tubes (Nalgene) | Fisher Scientific | 5000-0020 | Standard item - any supplier will do |
| Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm | Sigma | P7741 | Standard item - any supplier will do |
| Digital Incubator | VWR | model 1545 | Standard item - any supplier will do |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | Standard item - any supplier will do |
| Filters for filter sterilization | Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane | SCGPU05RE | Standard item - any supplier will do |
| Gelatin | Difco BD | 214340 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | 99449-20 | Standard item - any supplier will do |
| Glucose | Sigma | G-7021 1 kg | Standard item - any supplier will do |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Standard item - any supplier will do |
| Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) | Labwissen | Model 3220 | Standard item - any supplier will do |
| HEPES | Sigma | H-3784 100 g | Standard item - any supplier will do |
| N-acetylglucoseamine | Sigma | A-3286 25 g | Standard item - any supplier will do |
| Neopeptone | Difco BD | 211681 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Neubauer Hematocytometer | Sigma | Z359629 | Standard item - any supplier will do |
| Phase contrast microscope | Leitz | Standard item - any supplier will do | |
| Phosphomycin | Sigma | P5396-1G | Standard item - any supplier will do |
| Phosphomycine | Sigma | P5396 | Standard item - any supplier will do |
| Pipetboy | Integra | Standard item - any supplier will do | |
| Precision Standard Balance | OHAUS | model TS200S | Standard item - any supplier will do |
| Pyruvic acid (Na salt) | Sigma | P-8574 25 g | Standard item - any supplier will do |
| Rabbit Serum | Gibco | 16-120-032 | Source is important |
| Rabbit Serum | Sigma | R-4505 100 mL | Source is important |
| Rifampicin | Sigma | R3501-1G | Standard item - any supplier will do |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-5761 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Sufametaxazole | Sigma | PHR1126 | Standard item - any supplier will do |
| TC Yeastolate | Difco BD | 255752 100 g | Standard item - any supplier will do |
| Transfer Pipettes | VWR | 470225-044 | Standard item - any supplier will do |
| Trimethoprim | Sigma | PHR1056 | Standard item - any supplier will do |
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