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Immunology and Infection

Métodos de Cultivo de Espiroquetas do Complexo Borrelia burgdorferi Sensu Lato e Borrelia de Febre Recidivante

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

O cultivo in vitro é um método de detecção direta da presença de bactérias vivas. Este protocolo descreve métodos para o cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluindo as do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato, espécies de Borrelia de febre recidivante e Borrelia miyamotoi. Estas espécies são fastidiosas e de crescimento lento, mas podem ser cultivadas.

Abstract

A Borrelia é composta por três grupos de espécies, as do grupo Borreliose de Lyme (LB), também conhecidas como B. burgdorferi sensu lato (s.l.) e recentemente reclassificadas em Borreliella, o grupo da febre recidivante (FR) Borrelia, e um terceiro grupo de espiroquetas associado a répteis. Os métodos baseados em cultura continuam sendo o padrão-ouro para a detecção laboratorial de infecções bacterianas tanto para pesquisa quanto para trabalhos clínicos, pois a cultura de patógenos a partir de fluidos corporais ou tecidos detecta diretamente patógenos replicantes e fornece material de origem para pesquisa. As espiroquetas de Borrelia e Borreliella são fastidiosas e de crescimento lento e, portanto, não são comumente cultivadas para fins clínicos; no entanto, a cultura é necessária para a pesquisa. Este protocolo demonstra a metodologia e as receitas necessárias para cultivar com sucesso espiroquetas LB e RF, incluindo todas as espécies reconhecidas do complexo B. burgdorferi s.l., incluindo B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis eespiroquetas RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis e B. miyamotoi. O meio básico para o cultivo de espiroquetas LB e RF é o meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H), que suporta de forma confiável o crescimento de espiroquetas em culturas estabelecidas. Para poder cultivar isolados de Borrelia recém-isolados a partir de amostras derivadas de carrapatos ou hospedeiros onde o número inicial de espiroquetas é baixo no inóculo, o meio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado é preferido. Este meio também suporta o crescimento de B. miyamotoi. O sucesso do cultivo de espiroquetas de RF também depende criticamente da qualidade dos ingredientes.

Introduction

Borrelia é um gênero de bactérias espiroquetas que engloba três clados principais: o grupo da borreliose de Lyme (LB), o grupo da febre recidivante (FR) e um grupo menos bem caracterizado, aparentemente restrito aos répteis. A taxonomia da borrelia está em mutação com o advento de metodologias moleculares que permitem comparações genômicas e proteômicas, como ocorre com a maioria dos outros grupos taxonômicos1,2,3,4,5,6,7. O grupo LB (também chamado de grupo da doença de Lyme) tem sido tradicionalmente denominado Borrelia burgdorferi sensu lato em homenagem ao seu membro mais bem caracterizado Borrelia burgdorferi sensu stricto. Este trabalho utiliza a terminologia mais utilizada atualmente: NV, FR e grupo associado a répteis, e descreve os protocolos de cultura para os grupos LB e RF.

Como seria esperado para um membro da família Spirochaetaceae, Borrelia pode adotar a forma espiral distintamente longa e fina, tipicamente 20-30 μm de comprimento e 0,2-0,3 μm de largura. No entanto, as células de Borrelia são altamente pleomórficas e podem adotar muitas outras formas tanto em cultura quanto in vivo 1,8 como resultado de sua complexa estrutura celular e genética. Em sua forma espiroquetada, a morfologia planar da onda senoidal resulta da rotação de seus endoflagelos axiais no espaço periplasmático entre as membranas interna e externa. Essa estrutura permite que as células sejam altamente móveis, com a membrana externa contendo proteínas que permitem que a célula interaja com os tecidos do hospedeiro 9,10. A expressão das proteínas da membrana externa é fortemente regulada e afeta não só a invasão do tecido do hospedeiro, mas também a interação com o sistema imune do hospedeiro11. Esta expressão gênica complexa permite que as células de Borrelia transitem entre os ambientes muito diferentes de hospedeiros vertebrados e vetores invertebrados. O genoma da Borrelia é incomum entre os procariontes, consistindo de um cromossomo linear em vez de circular. Além do cromossomo linear, as espécies de Borrelia contêm 7-21 plasmídeos, alguns lineares e outros circulares. Os plasmídeos abrigam a maioria dos genes necessários para a adaptação e virulência do hospedeiro, e acredita-se que os plasmídeos circulares derivados de prófagos sejam responsáveis pela maior parte do fluxo gênico horizontal entre as células espiroquetas12,13. Consistente com um papel na adaptação do hospedeiro, alguns, possivelmente muitos ou todos, membros do grupo da borreliose de Lyme perdem plasmídeos em cultura14. A cepa "adaptada em laboratório" de B. burgdorferi, B31, mais bem estudada, possui apenas sete dos nove plasmídeos encontrados em isolados silvestres dessaespécie15. Da mesma forma, B. garinii perde plasmídeos em cultura16. Alguns estudos têm demonstrado que espécies de RF e B. miyamotoi retêm plasmídeos quando cultivados14,17, mas trabalhos recentes demonstram plasmídeos alterados e infectividade com cultivo in vitro de longa duração18.

Os métodos baseados em cultura continuam sendo o padrão-ouro para a detecção laboratorial de infecções bacterianas, tanto para pesquisa quanto para o trabalho clínico14,17. A cultura de patógenos a partir de fluidos corporais ou tecidos detecta diretamente patógenos replicantes e fornece material de origem para pesquisa14,17. Este protocolo demonstra a metodologia e as receitas necessárias para o cultivo com sucesso das espiroquetas do grupo LB, bem como da RF Borrelia e B. miyamotoi. O meio básico para o cultivo de espiroquetas de Borrelia é o meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H comercialmente disponível), com ou sem antibióticos para reduzir o crescimento de procariontes contaminantes. Este meio foi adaptado de um meio originalmente usado para suportar RF Borrelia19, posteriormente modificado por Stoenner20 e depois por Barbour21. Desde então, muitas modificações foram desenvolvidas, cada uma com efeitos sobre a fisiologia bacteriana que podem afetar o crescimento, a infectividade e a patogenicidade22. Esse meio suporta de forma confiável o crescimento de espiroquetas em culturas estabelecidas e tem sido usado para isolar espiroquetas de amostras clínicas de carrapatos, mamíferos e23. A variação mais recentemente desenvolvida, meio Kelly-Pettenkofer modificado (MKP), pode proporcionar melhor sucesso de isolamento, morfologia e motilidade ao isolar novos isolados de Borrelia de amostras ambientais, quando o número de espiroquetas presentes na amostra disponível para semear a cultura é baixo23,24. Em todos os casos, o sucesso do cultivo depende criticamente do meio recém-preparado e do uso de ingredientes apropriados; Nem todos os ingredientes comerciais produzem meios de alta qualidade. As culturas inoculadas podem ser convenientemente incubadas sem agitação em uma incubadora convencional de 32-34 °C na presença de uma pequena quantidade de oxigênio ambiente residual. As espiroquetas de Borrelia são anaeróbias, mas estão expostas na natureza a flutuações nas concentrações de oxigênio e dióxido de carbono e respondem com alterações na expressão gênica26,27,28,29. Assim, a expressão gênica, o crescimento e outros estudos metabólicos devem controlar os níveis de oxigênio e dióxido de carbono com o uso de uma incubadora ou câmara anaeróbia controlada por oxigênio. Em cultura, as culturas são verificadas semanalmente, ou mais frequentemente, para a presença de espiroquetas com microscopia de campo escuro ou microscopia de contraste de fase. Os esfregaços de cultura podem ser corados com coloração de prata, imunohistoquímica ou pelo uso de cepas fluorescentemente marcadas29,30. A PCR seguida de sequenciamento de DNA é um método sensível e específico para detectar e identificar geneticamente ou confirmar a espécie de Borrelia 30,31,32,33.

Muitas pequenas variações no BSK-II existem, e algumas estão disponíveis comercialmente. O protocolo aqui descrito na seção 1 foi adaptado de Barbour (1984)21. O meio MKP líquido é um meio desenvolvido mais recentemente e é descrito na seção 2. É preparado de acordo com um protocolo previamenterelatado33,34, que, à semelhança do meio BSK, consiste em duas etapas: preparação do meio básico e preparação do meio completo. O meio de cultura de borrelia pode ser preparado com ou sem antibióticos, conforme descrito na seção 3; os antibióticos atuam para reduzir as bactérias contaminantes introduzidas ao inocular com amostras clínicas ou ambientais, conforme descrito na seção 4; se inocular com cultura pura de Borrelia sp., antibióticos podem não ser necessários. A criação de existências de Borrelia a longo prazo é frequentemente importante, e um protocolo para o fazer é descrito na secção 5. A seção 6 descreve o uso desses meios para isolar clones puros de Borrelia sensu lato de amostras clínicas ou ambientais. Há uma série de abordagens possíveis36; abaixo está um encontrado para ser eficaz. O meio de plaqueamento utilizado neste protocolo é uma modificação do meio de plaqueamento BSK-II37 e do meio MKP34 (com soro de coelho aumentado para 10%38).

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Protocol

Todos os estudos envolvendo amostras obtidas de seres humanos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da universidade e/ou centro médico relevante, e o consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes antes que as amostras fossem coletadas. Todos os estudos envolvendo amostras obtidas de animais foram aprovados e conduzidos sob as diretrizes do Comitê de Ética Animal da Instituição. Se for caso disso, foram obtidas aprovações para a amostragem ambiental.

NOTA: O sucesso da cultura depende criticamente da qualidade dos ingredientes. O meio BSK comercial está disponível e suporta robustamente o crescimento de B. burgdorferi puro adaptado em laboratório e espécies relacionadas, onde altas doses de inóculo podem ser usadas para semear a cultura. Para isolados de cepas de material biológico primário, o meio recém-preparado é preferido e muitas vezes necessário.

são patógenos conhecidos ou suspeitos, e tecidos humanos ou animais não rastreados também podem ser um risco biológico. O manuseio de material potencialmente infeccioso requer equipamentos de proteção individual e técnica estéril para a segurança do investigador. Além disso, o meio é tão rico em nutrientes que a cultura é facilmente contaminada. A contenção de nível 2 de biossegurança é geralmente necessária para este trabalho e todo o trabalho com Borrelia sp ou amostras deve ser realizado em um gabinete de segurança biológica.

1. Instruções para fazer o meio BSK-II

  1. Preparo de meio BSK-II completo
    1. Obter reagentes para preparar 1 L do meio, como mostra a Tabela 1.
      NOTA: A pureza BSA (ou falta de pureza) é crítica para o crescimento ideal. Em particular, a pureza BSA difere entre o fabricante e o lote. Consulte a Tabela 2 para obter uma lista de produtos mais ou menos bem-sucedidos. Obter várias amostras de diferentes fornecedores, testá-las para um crescimento ideal, em seguida, comprar uma grande quantidade do melhor lote é uma estratégia eficaz para mitigar este problema e produzir um bom meio.
    2. Comece dissolvendo o BSA em um copo, mexendo na água, o que levará pelo menos meia hora.
    3. Adicione todos os produtos químicos secos e deixe-os dissolver. Em seguida, adicione o CMRL.
    4. Ajustar o pH do meio BSK-II para 7,6, se necessário, com NaOH 1 M.
    5. Adicionar soro de coelho ao meio BSK-II para uma concentração de 6%-10%. Filtrar esterilizar (tamanho de poro de 0,22 μm) o meio BSK-II. A quantidade necessária de soro depende da espécie de Borrelia . Utilizar 6%-7% para as espécies e cepas de RF e para Borrelia burgdorferi sensu lato. Se o crescimento não for forte, adicione mais 1%-2% de soro estéril de coelho ao meio.
    6. Congelar o estoque do meio BSK-II em alíquotas de 100 mL ou 400 mL.
    7. Para cepas de RF, a gelatina é necessária. Adicionar 100 mL de gelatina estéril a 7% (levemente aquecida para colocar em solução) a 400 mL BSK-II médio. Aquecer o BSK-II com gelatina a 37 °C para fazer a gelatina derreter antes de inocular a cultura.
      NOTA: O meio pode ser congelado (-20 °C) antes da esterilização do filtro e da adição de soro e gelatina de coelho (para espiroquetas de RF) ou após a esterilização do filtro e adição de soro (e gelatina). O meio é estável quando congelado por um longo tempo. Quando armazenado em geladeira, use o meio dentro de 1 mês. As espécies de RF crescem melhor com meio fresco, geralmente não mais do que 1 semana de idade. Se não estiver congelado, inspecione visualmente a qualidade do meio quanto à turbidez. Descarte o meio que parece estar contaminado, precipitando ingredientes ou de outra forma duvidoso.
    8. Se for necessário adicionar antibióticos ao meio, adicioná-los a alíquotas médias recém-fabricadas ou previamente congeladas; esta última é a abordagem mais flexível. Utilizar concentrações de antibióticos conforme descrito por Oliver et al.39.
    9. Ao descongelar um tubo do meio, pesar antibióticos em tubos estéreis (autoclavados) de 1,7 mL ou tubos cônicos estéreis de 15 mL, usando uma balança de precisão. Preparar as soluções-mãe da seguinte forma: Dissolver 25 mg de anfotericina B em 10 mL de DMSO, 20 mg de fosfomicina em 1 mL de água destilada autoclavada e 50 mg de rifampicina em 1 mL de DMSO.
    10. Filtrar, esterilizar (filtros de seringa de 0,2 μm) os antibióticos e transferi-los para um novo tubo de tamanho apropriado.
    11. Diluir os antibióticos na proporção de 1:1000 do meio para atingir sua concentração final. Para 500 mL de BSK, adicionar 0,5 mL de solução estoque de anfotericina B (2,5 mg/mL em DMSO), 0,5 mL de solução-estoque de fosfomicina (20 mg/mL em H2O estéril) e 0,5 mL de solução-estoque de rifampicina (US: rifampicina) (50 mg/mL em DMSO).
    12. Use o meio ou alíquota suplementada com antibiótico e congele a -20 °C.
Constituintes Quantidade (/L)
BSA fração V 50 gr
CMRL-1066 (10x) 100 mL
Neopeptona 5 gr
Hepes 6 g
Sal trissódico de ácido cítrico di-hidratado 0,7 gr
Glicose 5 gr
TC Yeastolate 2 g
Ácido pirúvico (sal de Na) 0,8 gr
N-acetil-D-glicoseamina 0,4 gr
Bicarbonato de sódio 2,2 gr
Água (alta pureza) 900 mL

Tabela 1: Composição de 1 L do meio BSK-II.

Fonte Adequabilidade
Serva GmbH, Heidelberg, Alemanha Sim
Proliant Biologicals, Boone IA, EUA Sim
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Estados Unidos Não

Tabela 2: Fontes de BSA e adequação para o meio BSK-II.

2. Instruções para fazer MKP

  1. Preparação do meio básico
    1. Pesar e dissolver cuidadosamente todos os componentes em pó, conforme listado abaixo na Tabela 3, em 3 /4 do volume final de ddH2O (ca. 750 mL), agitando até a dissolução completa, que leva ~1 h.
    2. Após a dissolução completa, ajustar o pH com NaOH para 7,6 e o volume para 1000 mL e, em seguida, esterilizar por filtração (filtro de 0,22 μm).
      NOTA: O meio básico pode ser armazenado a -20 °C por até 3 meses.
  2. Preparação do meio completo MKP
    1. Misturar todos os componentes listados na Tabela 4 de forma estéril; esterilizar a gelatina por autoclavagem e manusear de forma estéril. Trabalhe em um armário de segurança biológica estéril e use um soro filtrado estéril.
    2. Alíquota MKP em tubos de 50 mL. Coloque uma pequena alíquota a 33 °C durante vários dias e, em seguida, verifique sob um microscópio de campo escuro a ausência de contaminação.
      NOTA: Mantenha o meio MKP completo a +4 °C por no máximo 1 mês e não congele. O meio completo pode ser adicionalmente esterilizado por filtração usando um filtro de 0,22 μm.
Constituintes Quantidade (/L)
CMRL-1066 (10x sem glutamina) 100 mL (se líquido)/9,7 g/L se em pó
Neopeptona 3 g
Hepes 6 g
Ácido cítrico 0,7 gr
Glicose 3 g
Ácido pirúvico 0,8 gr
N-acetilglicosemina 0,4 gr
Bicarbonato de sódio 2 g

Tabela 3: Composição de 1 L do meio MKP (Kelly-Pettenkofer Modificado) básico.

Constituintes Quantidade (mL)
Meio básico 500
gelatina a 7% (em H2O) (recém-autoclavada, mas não quente) 100
Soro de coelho 36
35% BSA 17.5

Tabela 4: Composição do meio completo MKP (Kelly-Pettenkofer Modificado).

3. Cultura de Borrelia, com ou sem antibióticos

  1. Executar todas as etapas experimentais em condições de trabalho estéreis em um gabinete de segurança biológica. Desinfetar a superfície e todos os materiais com etanol 70% e transferi-los imediatamente para o gabinete de segurança biológica. UV esterilizar todos os materiais não biológicos no gabinete de segurança biológica por 5 min antes do início do trabalho.
  2. Use o meio mais fresco possível.
  3. Para iniciar uma cultura, pré-aqueça o meio (33 °C - 37 °C) em uma incubadora. Aplique agitação, se necessário.
    Observação : dependendo do volume do meio, esta etapa pode levar várias horas.
  4. Adicionar ~1 mL de cultura de Borrelia descongelada de um caldo glicerol ou similar, previamente armazenado a -80 °C e descongelado à temperatura ambiente (TR), assim que líquido, a 5-15 mL de meio BSK pré-aquecido. Inocular a cultura em um pequeno volume (5-15 mL de BSK) usando frascos de vidro ou plástico comercialmente disponíveis com tampas de rosca. Encha os tubos quase cheios para fazer uma atmosfera micro ou anaeróbica. Feche bem os tubos; se cultivado dessa maneira, CO2 não é necessário.
  5. Cultivar espécies de RF (e B. persica) a 37 °C em uma incubadora sem agitação ou agitação. Cultivar espécies de B. burgdorferi sensu lato a 33-34 °C.
  6. Monitorar o crescimento da cultura de Borrelia por contraste de fase ou microscopia de campo escuro com aumento de 200x-400x (Figura 3). Para garantir uma distribuição uniforme das células, misture a cultura com uma pipeta sorológica ou para mais mistura com uma pipeta de transferência de 3 mL enquanto pipeta para cima e para baixo.
    NOTA: As borrelias são mais visíveis em aumentos mais altos (200X-400X), mas são mais contáveis em aumentos de 200X em um hemocitômetro40. O movimento e a morfologia da borrelia são indicativos da presença dessas bactérias.
  7. Para quantificar o crescimento bacteriano, conte vários (10) pequenos quadrados individuais no padrão de grade de dezesseis campos de área de contagem em ambos os lados do hemocitômetro e média. Multiplique o número médio de células por quadrado pequeno com o fator de conversão apropriado para o hemocitômetro que está sendo usado para determinar a contagem de células por mL.
  8. Monitorar o crescimento bacteriano em intervalos de 1-2 dias. O crescimento exponencial da Borrelia é dependente da viabilidade e densidade celular e pode levar 1 semana ou mais a 34 °C. Diluir as culturas de fase exponencial na proporção de 1:2 ou 1:4 com o meio em um tubo de 1,7 mL antes de carregar no hemocitômetro. Incluir a consideração adequada do fator de diluição ao determinar a contagem celular. Após o uso, borrifar as superfícies e o hemocitômetro com água sanitária diluída (10%) e/ou etanol 70%.
    NOTA: Borrelia estão em crescimento exponencial quando as concentrações celulares são 1-5 x 107 células/mL. Dentro dessa faixa, as células crescem bem.
  9. A cultura estendida esgotará os nutrientes e alterará o pH do meio, de modo que o subcultivo seja necessário. Em condições estéreis em um gabinete de segurança biológica, transfira 1/10 do volume de cultura para um novo tubo e preencha-o com o novo meio (uma alíquota fresca do mesmo meio usado para cultivar a passagem anterior). Uma diluição de 1:10 é ideal. Se o volume da cultura for alterado, ajuste a quantidade de inóculo de acordo e continue a incubação. O número de passagens aumenta a cada mudança de meio.
  10. Para extração de DNA ou isolamento de células de Borrelia, centrifugar a fase exponencial de Borrelia por 10 min a 4000 x g para peletizar as bactérias. Descarte o sobrenadante em resíduos de risco biológico adequados. Processar as bactérias peletizadas com um kit comercial de extração de DNA ou ressuspender as bactérias em um meio apropriado para o experimento pretendido.
  11. Ao final de cada manipulação, esterilizar todos os equipamentos com etanol e radiação UV, conforme apropriado para o equipamento. Recolher os resíduos líquidos, incluindo o excesso de cultura, numa garrafa de resíduos e adicionar água sanitária a uma concentração final de 10%. Coloque este frasco a -80 °C antes de o descartar. Alternativamente, esterilizar o resíduo líquido e a cultura sem água sanitária ou álcool por autoclavagem.

4. Armazenamento a longo prazo de culturas de Borrelia

  1. Preparo do estoque de glicerol da cultura de Borrelia
    1. Tome ~1,8 mL alíquotas de culturas de fase exponencial, concentrações celulares ~10 7-10 8 células/mL, e adicione glicerol estéril a uma concentração final de 10% (concentrações de 5%-20% de trabalho).
    2. Colocar em frascos criogênicos com tampa de rosca de 2 mL. Conservar a -80 °C.
    3. Mantenha um estoque com pelo menos 10 tubos de cada cepa no freezer.
  2. Uma receita alternativa de armazenamento para produzir um estoque de glicerol para armazenamento permanente
    1. Misturar 2/3 da cultura de Borrelia com 1/3 de glicerol a 15% em caldo de Brucella . Utilizar 2,8 g de caldo Brucella dissolvido em 100 mL de ddH2O, que foi filtrado estéril (0,22 μm).
    2. Manter o estoque de glicerol das amostras entre -70 °C e -80 °C.

5. Isolamento de espiroquetas de fontes ambientais ou clínicas

NOTA: Se isolar material de fontes humanas, animais ou ambientais, deve-se obter ética em pesquisa, cuidados com animais ou certificação ecológica, conforme o caso.

  1. Cultivo de Borrelia a partir de carrapatos duros
    1. Coletar fêmeas adultas, machos e/ou carrapatos ninfais.
    2. Esterilize superficialmente todas as amostras de carrapatos mergulhando-as em etanol 70% por 2 min e seque ao ar em um gabinete de segurança biológica. Dissecar individualmente em vários pedaços com um bisturi estéril. Colocar as peças em um tubo de 2 mL contendo 1,5 mL de meio, suplementado com antibióticos.
    3. Incubar as culturas a 34 °C e verificar a presença de espiroquetas por microscopia de campo escuro ou contraste de fase duas vezes por semana durante as primeiras 2 semanas e, posteriormente, semanalmente durante 6 semanas (mais frequentemente para espiroquetas de RF). Amostras positivas para cultura de subcultura em 5 mL do mesmo meio.
      NOTA: As culturas contaminadas podem ser purificadas até certo ponto por filtração usando um filtro de 0,2 μm; Antibióticos podem ser necessários para resolver totalmente a contaminação.
  2. Cultivo de Borrelia a partir de amostras de sangue
    NOTA: A amostra de sangue deve ser colhida por um médico, veterinário ou profissional de pesquisa qualificado, dependendo da fonte do material. Menos de 24 h no TR deve transcorrer entre as amostras
    remoção e chegada ao laboratório.
    1. Obter 10 mL de sangue, coletado em tubos de coleta de sangue de vidro com citrato ácido dextrose (ACD; "yellow top") como anticoagulante. Deixe em temperatura ambiente. Recomenda-se que passem menos de 24 horas entre a coleta de sangue e a inoculação.
    2. Centrifugar o sangue com anticoagulante por 10 min a 200-400 x g para separar o plasma das células sanguíneas.
    3. Retire suavemente o plasma do tubo e inocular 1 ml de plasma em 5 ml de meio completo MKP pré-aquecido. MKP pode ser suplementado com antibióticos. Incubar culturas a 33 °C com inspeção visual diária e microscopia semanal de campo escuro ou contraste de fase até que o crescimento borrelial seja notado (mais frequentemente para RF Borrelia), o que pode levar até 9 semanas.
      NOTA: Se utilizar volumes de inoculação maiores ou menores, manter a proporção de 1:5 de inoculante para meio. Use soros ou plasma em vez de sangue total.
  3. Cultivo de Borrelia a partir de biópsia de pele
    1. Superfície esterilizar a biópsia de pele (idealmente um cubo de 3 mm x 3 mm x 3 mm; ou seja, com etanol 70% e peróxido de hidrogênio). Colocar a amostra de biópsia em soro fisiológico.
      NOTA: Uma amostra de biópsia deve ser colhida por um profissional médico, veterinário ou de pesquisa qualificado, dependendo da fonte do material. Menos de 24 h no TR devem transcorrer entre a retirada da amostra e a chegada ao laboratório.
    2. Corte a amostra em dois a seis pedaços menores usando uma lâmina de barbear estéril em uma placa de Petri de vidro estéril enquanto imerso no soro fisiológico. Transferir todas as amostras e ~1 mL da solução salina fisiológica na qual a biópsia de pele foi armazenada para 5 mL de meio pré-aquecido suplementado com antibióticos e incubar a 33 °C.
    3. Em caso de crescimento excessivo de bactérias contaminantes, adicionar antibióticos como no passo 1.1.10 acima, ou adicionando dois comprimidos de sulfametoxazol (23,75 mg; concentração final 5 mg/mL) + trimetoprim (1,25 mg; 0,25 mg/mL) ou Bactrim (concentração inibitória mínima >128 μg/mL), dois comprimidos de amicacina (2 x 30 μg; concentração final 12 μg/mL), e dois comprimidos de Phosfomycine (2 x 200 μg; concentração final 80 μg/mL).
      OBS: Em todos os casos, certifique-se de permanecer abaixo da concentração inibitória mínima desse antibiótico para as espécies de Borrelia para as quais a cultura está sendo tentada41,42,43.
    4. Se a cultura for positiva para Borrelia, manter a cultura por mais 3-4 dias ou até que a quantidade de Borrelia atinja 10+ espiroquetas em um campo de microscópio usando uma objetiva de 40X. Crie um estoque de glicerol para armazenamento permanente.

6. Isolamento de populações monoclonais de espiroquetas sensu lato de B. burgdorferi e B. miyamotoi de culturas líquidas por cultivo em meio sólido

  1. Para confecção de placas, aquecer 300 mL de meio completo 1,5X MKP (sem gelatina). Aquecer 200 mL de agarose a 1,7% (autoclavada em água deionizada, armazenada em TR e levada ao micro-ondas antes do uso) a 55 °C. Misture os dois líquidos.
  2. Pipetar 15 mL desta mistura em cada uma das 16 placas de Petri profundas para fazer o ágar de fundo.
  3. Reter o resto do meio a 55 °C em banho-maria.
    NOTA: Os Borrelia são misturados na camada superior de agarose.
  4. Primeiro, quantificar a densidade de cultura de Borrelia usando um hemocitômetro e diluir para a densidade desejada em um meio líquido.
    NOTA: 500, 200, 100 e 50 espiroquetas por placa funcionam bem.
  5. Após a solidificação das placas de fundo, adicionar 10 mL da mistura restante de agarose a um tubo de 15 mL contendo o número adequado de espiroquetas.
  6. Despeje a suspensão sobre a agarose inferior na placa de Petri rotulada.
    NOTA: Uma vez que as espiroquetas de Borrelia são sensíveis a altas temperaturas, deve-se tomar cuidado para garantir que as bactérias não sejam expostas a 55 °C por um longo período de tempo; Despeje o ágar superior imediatamente após adicioná-lo às células bacterianas no meio.
  7. Depois que as placas estiverem completamente solidificadas, feche as placas de Petri e coloque-as de cabeça para baixo a 34-35 °C em 2,5% de CO2.
    NOTA: As colônias aparecerão 1 semana após o plaqueamento se o procedimento for bem-sucedido.
  8. Para triar e expandir as colônias individuais, selecione colônias únicas das placas e coloque-as em 1,5 mL de MKP líquido modificado, ou outro meio adequado, em tubos de cultura estéreis de 2 mL.
  9. Incubar as culturas a 34 °C e examinar espiroquetas por microscopia de campo escuro ou de fase. Use essas culturas para análise ou estoques, feitos conforme descrito acima.

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Representative Results

Os meios de cultura Borrelia BSK e MKP, e variantes, são meios de cultura ricos com ingredientes que precisam ser preparados e esterilizados sequencialmente. Quando bem preparado, o meio BSK deve ser vermelho-alaranjado e límpido (Figura 1). Turbidez e precipitação que persistem após o aquecimento indicam ingredientes problemáticos, produção média ou contaminação; Esse meio é melhor descartado. Se for adicionada gelatina à BSK e com MKP, o meio será gelatinoso quando refrigerado; Ao aquecer, será líquido, embora ligeiramente viscoso.

O crescimento de culturas de Borrelia pura não mudará a turbidez do meio. No entanto, o crescimento de culturas bacterianas, Borrelia, bem como contaminantes, mudará a cor do meio como resultado do indicador de pH. O crescimento excessivo por outras bactérias produzirá turbidez e materiais aglomerados (Figura 2).

O crescimento da cultura pode ser monitorado por contraste de fase ou microscopia de campo escuro (Figura 3 e Figura 4). As células da borrelia na fase exponencial são tipicamente delgadas e torcidas, e móveis até certo ponto. À medida que as culturas entram na fase estacionária, os corpos redondos são cada vez mais evidentes (Figura 5). Isolados clínicos ou ambientais frequentemente contêm múltiplas cepas e/ou espécies de Borrelia . Para isolar clones puros, culturas líquidas podem ser plaqueadas para isolar colônias monoclonais (Figura 6); Às vezes, várias rodadas de isolamento de colônia podem ser necessárias.

Figure 1
Figura 1: Meio BSK e MKP . (A) BSK (com antibióticos) com cultura pura de Borrelia burgdorferi. Com ou sem B. burgdorferi o meio permanece sem turbidez visível e é laranja-âmbar (a cor varia ligeiramente com os ingredientes). (B) meio MKP, não inoculado, descongelamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Meio BSK e MKP contaminado com crescimento excessivo de bactérias concorrentes. O meio é descolorido, turvo e, com o tempo, as bactérias concorrentes morrem e precipitam para o fundo do tubo. (A) Tubo BSK crescido. (B) Tubo BSK velho com bactérias contaminantes precipitadas. (C) Tubo MKP com cultura (esquerda) e sem cultura (meio) e cultura contaminada (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Uso de hemocitômetro para monitorar o crescimento da Borrelia . Borrelia burgdorferi cepa B31 (um subconjunto indicado por setas) visualizada em um hemocitômetro (uma linha da pequena grade é indicada pela ponta da seta) sob contraste de fase de 200X. Essa ampliação e processo permitem o monitoramento das culturas e a estimativa da densidade celular. A barra de escala é de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagem de campo escuro de Borrelia burgdorferi. Imagem de campo escuro da linhagem SCW-53 de Borrelia burgdorferi , em alta densidade em fase exponencial após 5-7 dias de cultivo em meio MKP (aumento de 400X). A barra de escala é de 20 μm. Esta cepa foi isolada do carrapato duro Ixodes affinis, coletado na Carolina do Sul, EUA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Borrelia em culturas antigas. À medida que as células de Borrelia entram na fase estacionária em culturas antigas, formas de corpo redondo são cada vez mais vistas para substituir a forma espiroqueta. Estas podem ser formas dormentes ou células mortas. Painel esquerdo, coloração de Dieterle; painel médio, coloração imunoistoquímica; e painel direito, hibridização in situ fluorescente de uma cultura de Borrelia (presumida como B. burgdorferi com base na origem, mas a espécie e a cepa não foram identificadas molecularmente) inoculadas com urina canina. A coleta dos dados da Figura 5 foi aprovada pelo Comitê de Cuidados com Animais da Mrt. Allison University, aprovação número 16-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato. Colônias de espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato cultivadas em meio sólido para isolar populações clonais puras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A cultura laboratorial de bactérias é o trampolim para a pesquisa. A profunda vantagem conferida pela capacidade de cultura é exemplificada pela luta, ao longo de mais de um século culminando apenas recentemente em sucesso, para a cultura do Treponema pallidum, a espiroqueta que é o agente etiológico da sífilis44. As espiroquetas de Borrelia também são desafiadoras para a cultura, mas a cultura é possível 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

As células de Borrelia são fastidiosas e cada espécie e cepa, e mesmo isoladas, diferem, tanto geneticamente quanto por adaptação ao hospedeiro do qual foram isoladas 51,52,53,54,55. Ao fazer mídias, o uso de ingredientes apropriados faz uma enorme diferença no vigor da cultura Borrelia ou mesmo na viabilidade da cultura. O uso de meios recém-preparados, altamente enriquecidos e adequadamente armazenados é essencial para promover o crescimento bacteriano e é um requisito bem estabelecido para o crescimento bacteriano. Para Borrelia, a manutenção de condições anaeróbias ou microaeróbicas é necessária para um bom crescimento. Isso pode ser conseguido mais simplesmente enchendo tubos até o topo, de modo que há pouco ou nenhum ar restante no tubo e cultivando as culturas sem agitação; Controle mais rigoroso de oxigênio e dióxido de carbono pode ser necessário para a expressão gênica e estudos relacionados 26,27,28,29,30. A adição de antibióticos ao meio de cultura bacteriana pode parecer contraintuitiva; o uso de baixas doses de antibióticos no meio de Borrelia é para desencorajar o crescimento de bactérias de crescimento mais rápido. Se a cultura for inoculada com um isolado de Borrelia puro, a adição de antibióticos não é necessária; no entanto, o uso de antibióticos adicionados é essencial para desencorajar o crescimento excessivo de bactérias concorrentes ao inocular com amostras clínicas ou ambientais. O meio BSK também pode ser suplementado com 3%-7% de gelatina. Isso é necessário para o crescimento da espécie de Borrelia RF21. O uso de BSK ou MKP para o crescimento de espécies de Borrelia burgdorferi sensu lato depende da fonte do isolado. Ambos os meios suportam o crescimento de culturas estabelecidas, mas o MKP tem apresentado melhor desempenho na semeadura de novas culturas com baixo número de células de Borrelia, como ocorre com isolados clínicos ou ambientais23,24. Este meio também permite a cultura de B. miyamotoi56,57,58. Em última análise, há um elemento de arte na ciência do crescimento de micróbios fastidiosos, mas isso é possível com cuidado e persistência.

A cultura da Borrelia está na base dos avanços na pesquisa biomédica. A cultura da Borrelia permitiu a determinação do genoma completo e do proteoma de muitas espécies de Borrelia, o que permitiu aos pesquisadores começar a desvendar a evolução e a biologia dessas espiroquetas54,58,59. Da mesma forma, o acesso a culturas puras de Borrelia permite o entendimento das diversas interações complexas da Borrelia com o hospedeiro mamífero e o vetor artrópodes 61,62,63,64,65, incluindo interações com o sistema imune do hospedeiro11,65, permitindo inferir mecanismos de transmissão 29,66, e fornece a ferramenta investigativa chave para distinguir células cultiváveis, portanto, necessariamente vivas, de debris celulares, uma distinção que é crítica para desvendar os mecanismos de patogênese, bem como regimes de tratamento eficazes8,67,68,69,70,71. Embora a cultura de Borrelia in vitro possa levar várias semanas até que as espiroquetas sejam suficientemente abundantes para detecção, limitando as aplicações de diagnóstico clínico, a compreensão fundamental da biologia da Borrelia, genômica, interações patógeno-hospedeiro e muitas outras aplicações tem confiado na capacidade de isolar Borrelia pura culturas de isolados ambientais, e amplificar esses isolados através de cultura para produzir material suficiente para análises bioquímicas e genéticas. Há um impulso social para uma resposta rápida às infecções para apoiar o diagnóstico e o tratamento rápidos. O outro componente dessa necessidade, no entanto, é a pesquisa biomédica e biológica necessária para uma base sólida sobre a qual tratar e prevenir doenças de forma adequada e bem-sucedida. Embora desafiador, o cultivo in vitro de espiroquetas de Borrelia é possível e pode suportar essas necessidades.

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Disclosures

Não foram declarados conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Natural Science and Engineering Research Council of Canada e pela Canadian Lyme disease Foundation (AB e VL), pelo Swedish Research Council (SB, M-LF e IN), TAČR GAMA 2 project - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG e NR), e por uma bolsa do Ministério da Saúde da República Tcheca NV19-05-00191 (MG e NR). Agradecemos a S. Vranjes (2021, laboratório Rudenko) pela imagem na Figura 4 e a J. Thomas-Ebbett (2021, laboratório Lloyd) pelas imagens na Figura 5. Agradecemos a todos os pesquisadores que contribuíram com a área e pedimos desculpas àqueles cujos trabalhos não pudemos citar por limitações de espaço.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

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Imunologia e Infecção Edição 189
Métodos de Cultivo de Espiroquetas do Complexo Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato e <em>Borrelia</em> de Febre Recidivante
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Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

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