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Immunology and Infection

Méthodes de culture des spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi Sensu Lato et de la fièvre récurrente Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

La culture in vitro est une méthode de détection directe de la présence de bactéries vivantes. Ce protocole décrit les méthodes de culture de divers spirochètes de Borrelia, y compris ceux du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato, de la fièvre récurrente des espèces de Borrelia et de Borrelia miyamotoi. Ces espèces sont méticuleuses et à croissance lente, mais peuvent être cultivées.

Abstract

La Borrelia se compose de trois groupes d’espèces, celles du groupe de la borréliose de Lyme (LB), également connu sous le nom de B. burgdorferi sensu lato (s.l.) et récemment reclassé en Borreliella, le groupe de fièvre récurrente (RF) Borrelia, et un troisième groupe de spirochètes associés aux reptiles. Les méthodes basées sur la culture demeurent l’étalon-or pour la détection en laboratoire des infections bactériennes pour la recherche et le travail clinique, car la culture d’agents pathogènes à partir de fluides corporels ou de tissus détecte directement les agents pathogènes réplicatifs et fournit du matériel source pour la recherche. Borrelia et les spirochètes de Borreliella sont fastidieux et à croissance lente, et ne sont donc pas couramment cultivés à des fins cliniques; Cependant, la culture est nécessaire pour la recherche. Ce protocole démontre la méthodologie et les recettes nécessaires pour cultiver avec succès des spirochètes LB et RF, y compris toutes les espèces reconnues du complexe de B. burgdorferi s.l., y compris B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis etspirochètes RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis et B. miyamotoi. Le milieu de base pour la culture des spirochètes LB et RF est le milieu Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H), qui soutient de manière fiable la croissance des spirochètes dans les cultures établies. Pour pouvoir cultiver des isolats de Borrelia nouvellement isolés à partir d’échantillons dérivés de tiques ou d’hôtes où le nombre initial de spirochètes est faible dans l’inoculum, il est préférable de modifier le milieu Kelly-Pettenkofer (MKP). Ce milieu soutient également la croissance de B. miyamotoi. Le succès de la culture des spirochètes RF dépend également de manière critique de la qualité des ingrédients.

Introduction

Borrelia est un genre de bactéries spirochètes qui englobe trois clades principaux: le groupe de la borréliose de Lyme (LB), le groupe de la fièvre récurrente (RF) et un groupe moins bien caractérisé apparemment limité aux reptiles. La taxonomie de Borrelia est en mutation avec l’avènement des méthodologies moléculaires qui permettent de comparer le génome et le protéome, comme c’est le cas pour la plupart des autres groupes taxonomiques 1,2,3,4,5,6,7. Le groupe LB (également appelé groupe de la maladie de Lyme) a traditionnellement été appelé Borrelia burgdorferi sensu lato d’après son membre le mieux caractérisé Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Cet article utilise la terminologie actuellement la plus largement utilisée: le LB, le RF et le groupe associé aux reptiles, et décrit les protocoles de culture pour les groupes LB et RF.

Comme on peut s’y attendre pour un membre de la famille des Spirochaetaceae, Borrelia peut adopter la forme en spirale distinctement longue et mince, généralement de 20 à 30 μm de long et de 0,2 à 0,3 μm de large. Cependant, les cellules de Borrelia sont très pléomorphes et peuvent adopter de nombreuses autres formes en culture et in vivo 1,8 en raison de leur structure cellulaire et génétique complexe. Dans sa forme spirochétale, la morphologie planaire sinusoïdale résulte de la rotation de ses endoflagelles axiaux dans l’espace périplasmique entre les membranes interne et externe. Cette structure permet aux cellules d’être très mobiles, la membrane externe contenant des protéines qui permettent à la cellule d’interagir avec les tissus hôtes 9,10. L’expression des protéines de la membrane externe est étroitement régulée et affecte non seulement l’invasion du tissu de l’hôte, mais aussi l’interaction avec le système immunitaire de l’hôte11. Cette expression génique complexe permet aux cellules de Borrelia de faire la navette entre les environnements très différents des hôtes vertébrés et des vecteurs invertébrés. Le génome de Borrelia est inhabituel chez les procaryotes, constitué d’un chromosome linéaire plutôt que circulaire. En plus du chromosome linéaire, les espèces de Borrelia contiennent 7 à 21 plasmides, certains linéaires et d’autres circulaires. Les plasmides abritent la majorité des gènes nécessaires à l’adaptation et à la virulence de l’hôte, et les plasmides circulaires dérivés des prophages seraient responsables de la majorité du flux horizontal de gènes entre les cellules spirochétales12,13. Conformément à un rôle dans l’adaptation de l’hôte, certains, peut-être plusieurs ou tous, membres du groupe de la borréliose de Lyme perdent des plasmides en culture14. La souche « adaptée en laboratoire » de B. burgdorferi, B31, la mieux étudiée, ne contient que sept des neuf plasmides trouvés dans les isolats sauvages de cetteespèce15. De même, B. garinii perd des plasmides en culture16. Certaines études ont montré que les espèces RF et B. miyamotoi conservent les plasmides lorsqu’ils sont cultivés14,17, mais des travaux récents démontrent des plasmides altérés et une infectiosité avec une culture in vitro à long terme 18.

Les méthodes basées sur la culture restent l’étalon-or pour la détection en laboratoire des infections bactériennes, tant pour la recherche que pour les travaux cliniques14,17. La culture d’agents pathogènes à partir de fluides corporels ou de tissus détecte directement les agents pathogènes réplicatifs et fournit du matériel de base pour la recherche14,17. Ce protocole démontre la méthodologie et les recettes nécessaires pour cultiver avec succès les spirochètes du groupe LB ainsi que RF Borrelia et B. miyamotoi. Le milieu de base pour la culture des spirochètes de Borrelia est le milieu Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II ou BSK-H disponible dans le commerce), avec ou sans antibiotiques pour réduire la croissance des procaryotes contaminants. Ce support a été adapté d’un support utilisé à l’origine pour supporter RF Borrelia19, modifié par Stoenner20 puis par Barbour21. De nombreuses modifications ont depuis été développées, chacune ayant des effets sur la physiologie bactérienne qui peuvent affecter la croissance, l’infectiosité et la pathogénicité22. Ce milieu favorise de manière fiable la croissance des spirochètes dans des cultures établies et a été utilisé pour isoler des spirochètes à partir d’échantillons de tiques, de mammifères et cliniques23. La variante plus récente, le milieu Kelly-Pettenkofer modifié (MKP), peut améliorer le succès de l’isolement, la morphologie et la motilité lors de l’isolement de nouveaux isolats de Borrelia à partir d’échantillons environnementaux, lorsque le nombre de spirochètes présents dans l’échantillon disponible pour ensemencer la culture est faible23,24. Dans tous les cas, le succès de la culture dépend essentiellement du milieu fraîchement préparé et de l’utilisation d’ingrédients appropriés; Tous les ingrédients commerciaux ne produisent pas un milieu de haute qualité. Les cultures inoculées peuvent être facilement incubées sans agitation dans un incubateur conventionnel à 32-34 °C en présence d’une petite quantité d’oxygène ambiant résiduel. Les spirochètes de Borrelia sont anaérobies mais sont exposés dans la nature aux fluctuations des concentrations d’oxygène et de dioxyde de carbone et réagissent avec des changements dans l’expression des gènes26,27,28,29. Ainsi, l’expression génique, la croissance et d’autres études métaboliques devraient contrôler les niveaux d’oxygène et de dioxyde de carbone à l’aide d’un incubateur contrôlé par oxygène ou d’une chambre anaérobie. En culture, les cultures sont vérifiées chaque semaine, ou plus souvent, pour la présence de spirochètes avec la microscopie à fond noir ou la microscopie à contraste de phase. Les frottis de culture peuvent être colorés avec des taches d’argent, l’immunohistochimie ou l’utilisation de souches marquées par fluorescence29,30. La PCR suivie du séquençage de l’ADN est une méthode sensible et spécifique pour détecter et identifier génétiquement ou confirmer l’espèce Borrelia 30,31,32,33.

Il existe de nombreuses variantes mineures de BSK-II, et certaines sont disponibles dans le commerce. Le protocole décrit ici à la section 1 a été adapté de Barbour (1984)21. Le milieu MKP liquide est un milieu développé plus récemment et est décrit à la section 2. Il est préparé selon un protocole33,34 précédemment rapporté qui, à l’instar du milieu BSK, comporte deux étapes: la préparation du milieu de base et la préparation du milieu complet. Le milieu de culture Borrelia peut être préparé avec ou sans antibiotiques, comme décrit à la rubrique 3 ; la Loi sur les antibiotiques visant à réduire les bactéries contaminantes introduites lors de l’inoculation d’échantillons cliniques ou environnementaux, tel que décrit à la section 4; si inoculer avec Borrelia sp. culture pure, les antibiotiques peuvent ne pas être nécessaires. La constitution de stocks Borrelia à long terme est souvent importante, et un protocole pour ce faire est décrit à la section 5. La section 6 décrit l’utilisation de ces milieux pour isoler des clones purs de Borrelia sensu lato à partir d’échantillons cliniques ou environnementaux. Il existe un certain nombre d’approches possibles36; Vous trouverez ci-dessous une solution qui s’est avérée efficace. Le milieu de placage utilisé dans ce protocole est une modification du milieu de placage BSK-II37 et du milieu MKP 34 (avec du sérum de lapin augmenté à 10%38).

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Protocol

Toutes les études impliquant des échantillons obtenus sur des sujets humains ont été approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’université et/ou de l’établissement médical concerné, et le consentement éclairé écrit des participants a été obtenu avant le prélèvement des échantillons. Toutes les études portant sur des échantillons prélevés sur des animaux ont été approuvées et menées conformément aux lignes directrices du Comité d’éthique animale de l’établissement. Le cas échéant, des autorisations ont été obtenues pour l’échantillonnage environnemental.

NOTE: Le succès de la culture dépend essentiellement de la qualité des ingrédients. Le milieu commercial BSK est disponible et soutient de manière robuste la croissance de B. burgdorferi pur adapté au laboratoire et d’espèces apparentées où l’inoculum à forte dose peut être utilisé pour ensemencer la culture. Pour les isolats de souches provenant de matières biologiques primaires, un milieu fraîchement préparé est préférable et souvent nécessaire.

Borrelia sp. sont des agents pathogènes connus ou soupçonnés, et les tissus humains ou animaux non criblés peuvent également constituer un risque biologique. La manipulation de matières potentiellement infectieuses nécessite un équipement de protection individuelle et une technique stérile pour assurer la sécurité des enquêteurs. De plus, le milieu est si riche en nutriments que la culture est facilement contaminée. Le niveau de confinement de biosécurité 2 est généralement requis pour ce travail et tous les travaux avec Borrelia sp. ou des échantillons doivent être effectués dans une enceinte de sécurité biologique.

1. Instructions pour la fabrication du support BSK-II

  1. Préparation du milieu BSK-II complet
    1. Obtenir des réactifs pour préparer 1 L du milieu, comme indiqué dans le tableau 1.
      REMARQUE: La pureté BSA (ou le manque de pureté) est essentielle pour une croissance optimale. En particulier, la pureté BSA diffère entre le fabricant et le lot. Veuillez consulter le tableau 2 pour une liste des produits plus efficaces par rapport aux produits moins réussis. Obtenir plusieurs échantillons de différents fournisseurs, les tester pour une croissance optimale, puis acheter une grande quantité du meilleur lot est une stratégie efficace pour atténuer ce problème et produire un bon milieu.
    2. Commencez par dissoudre le BSA dans un bécher en remuant dans l’eau, ce qui prendra au moins une demi-heure.
    3. Ajouter tous les produits chimiques secs et les laisser se dissoudre. Ajoutez ensuite le CMRL.
    4. Ajuster le pH du milieu BSK-II à 7,6, si nécessaire, avec 1 M de NaOH.
    5. Ajouter du sérum de lapin au milieu BSK-II à une concentration de 6% à 10%. Filtrer stériliser (taille des pores de 0,22 μm) le milieu BSK-II. La quantité de sérum requise dépend de l’espèce Borrelia . Utilisez 6%-7% pour les espèces et souches RF, et pour Borrelia burgdorferi sensu lato. Si la croissance n’est pas forte, ajoutez un autre sérum de lapin stérile de 1% à 2% au milieu.
    6. Congeler le stock de milieu BSK-II dans des aliquotes de 100 mL ou 400 mL.
    7. Pour les souches RF, la gélatine est nécessaire. Ajouter 100 mL de gélatine stérile à 7 % (légèrement chauffée pour la mettre dans une solution) à 400 ml de milieu bsk-ii. Réchauffer le BSK-II avec de la gélatine à 37 °C pour faire fondre la gélatine avant d’inoculer la culture.
      NOTE: Le milieu peut être congelé (-20 ° C) avant la stérilisation du filtre et l’ajout de sérum de lapin et de gélatine (pour les spirochètes RF) ou après la stérilisation du filtre et l’ajout de sérum (et de gélatine). Le milieu est stable lorsqu’il est congelé pendant une longue période. Lorsqu’il est conservé au réfrigérateur, utilisez le milieu dans un délai de 1 mois. Les espèces RF poussent mieux avec un milieu frais, généralement pas plus de 1 semaine. S’il n’est pas congelé, inspecter visuellement la qualité du milieu pour vérifier la turbidité. Jetez le milieu qui semble contaminé, précipitant les ingrédients ou autrement douteux.
    8. Si des antibiotiques doivent être ajoutés au milieu, les ajouter au milieu fraîchement fabriqué ou aux aliquotes préalablement congelées; Cette dernière approche est la plus flexible. Utiliser les concentrations d’antibiotiques décrites par Oliver et coll.39.
    9. Lors de la décongélation d’un tube du milieu, peser les antibiotiques dans des tubes stériles (autoclavés) de 1,7 ml ou des tubes coniques stériles de 15 ml, à l’aide d’une balance de précision. Préparer les solutions mères comme suit : Dissoudre 25 mg d’amphotéricine B dans 10 mL de DMSO, 20 mg de phosphomycine dans 1 mL d’eau distillée autoclavée et 50 mg de rifampicine dans 1 mL de DMSO.
    10. Filtrer stériliser (filtres à seringue de 0,2 μm) les antibiotiques et les transférer dans un nouveau tube de taille appropriée.
    11. Diluer les antibiotiques dans un rapport de 1:1000 du milieu pour atteindre leur concentration finale. Pour 500 mL de BSK, ajouter 0,5 mL de solution mère d’amphotéricine B (2,5 mg/mL dans du DMSO), 0,5 mL de solution mère de phosphomycine (20 mg/mL dans duH2Ostérile) et 0,5 mL de solution mère de rifampicine (É.-U. : rifampicine) (50 mg/mL dans du DMSO).
    12. Utilisez le milieu supplémenté en antibiotiques ou aliquote et congelez à -20 °C.
Constituants Montant (/L)
BSA fraction V 50 g
CMRL-1066 (10x) 100 mL
Néopeptone 5 g
Hepes 6 g
Acide citrique sel trisodique dihydraté 0,7 g
Glucose 5 g
TC Yeastolate 2 g
Acide pyruvique (sel Na) 0,8 g
N-acétyl-D-glucoseamine 0,4 g
Bicarbonate de sodium 2,2 g
Eau (haute pureté) 900 mL

Tableau 1 : Composition de 1 L de milieu BSK-II.

Source Aptitude
Serva GmbH, Heidelberg, Allemagne Oui
Proliant Biologicals, Boone IA, États-Unis Oui
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, États-Unis Non

Tableau 2 : Sources de BSA et pertinence pour le milieu BSK-II.

2. Instructions pour faire MKP

  1. Préparation du milieu de base
    1. Peser et dissoudre soigneusement tous les composants en poudre énumérés ci-dessous dans le tableau 3 aux 3/4 du volume final de ddH2O (environ 750 mL) en agitant jusqu’à dissolution complète, ce qui prend ~1 h.
    2. Après dissolution complète, ajuster le pH avec NaOH à 7,6 et le volume à 1000 mL, puis stériliser par filtration (filtre de 0,22 μm).
      REMARQUE: Le milieu de base peut être conservé à -20 ° C jusqu’à 3 mois.
  2. Préparation du support complet MKP
    1. Mélanger tous les composants énumérés dans le tableau 4 de manière stérile; Stériliser la gélatine à l’autoclave et la manipuler de manière stérile. Travaillez dans une enceinte de sécurité biologique stérile et utilisez un sérum filtré stérile.
    2. Aliquote MKP dans des tubes de 50 mL. Mettez une petite partie aliquote à 33 °C pendant plusieurs jours, puis vérifiez au microscope à fond noir l’absence de contamination.
      NOTE: Conserver le milieu complet MKP à +4 °C pendant 1 mois au maximum et ne pas congeler. Le milieu complet peut en outre être stérilisé par filtration à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
Constituants Montant (/L)
CMRL-1066 (10x sans glutamine) 100 mL (si liquide)/9,7 g/L si poudre
Néopeptone 3 g
Hepes 6 g
Acide citrique 0,7 g
Glucose 3 g
Acide pyruvique 0,8 g
N-acétylglucoseamine 0,4 g
Bicarbonate de sodium 2 g

Tableau 3 : Composition de 1 L de milieu MKP (Kelly-Pettenkofer modifié) de base.

Constituants Quantité (mL)
Support de base 500
7% gélatine (en H2O) (fraîchement autoclavée mais pas chaude) 100
Sérum de lapin 36
35% BSA 17.5

Tableau 4 : Composition du milieu complet MKP (Kelly-Pettenkofer modifié).

3. Culture de Borrelia, avec ou sans antibiotiques

  1. Effectuer toutes les étapes expérimentales dans des conditions de travail stériles dans une enceinte de sécurité biologique. Désinfectez la surface et tous les matériaux avec de l’éthanol à 70% et transférez-les immédiatement dans l’enceinte de sécurité biologique. Stériliser aux UV tous les matériaux non biologiques dans l’enceinte de sécurité biologique pendant 5 minutes avant le début des travaux.
  2. Utilisez le milieu le plus frais possible.
  3. Pour démarrer une culture, préchauffer le milieu (33 °C - 37 °C) dans un incubateur. Appliquer en secouant si nécessaire.
    REMARQUE: Selon le volume de support, cette étape peut prendre plusieurs heures.
  4. Ajouter ~1 mL de culture Borrelia décongelée à partir d’un stock de glycérol ou similaire, préalablement conservé à -80 °C et décongelé à température ambiante (RT), dès qu’il est liquide, à 5-15 mL de milieu BSK préchauffé. Inoculer la culture dans un petit volume (5-15 mL de BSK) en utilisant des flacons en verre ou en plastique disponibles dans le commerce avec des bouchons à vis. Remplissez les tubes presque pleins pour créer une atmosphère micro- ou anaérobie. Fermez hermétiquement les tubes; s’il est cultivé de cette manière, le CO2 n’est pas nécessaire.
  5. Cultiver des espèces RF (et B. persica) à 37 °C dans un incubateur sans agitation ni agitation. Cultiver des espèces de B. burgdorferi sensu lato à 33-34 °C.
  6. Surveillez la croissance de la culture Borrelia à l’aide de la microscopie à contraste de phase ou à fond noir à un grossissement de 200x-400x (Figure 3). Pour assurer une répartition uniforme des cellules, mélanger la culture avec une pipette sérologique ou, pour plus de mélange, avec une pipette de transfert de 3 ml tout en pipetant de haut en bas.
    REMARQUE: Les Borrelia sont plus visibles à un grossissement plus élevé (200X-400X), mais sont mieux dénombrables à un grossissement de 200X sur un hémocytomètre40. Le mouvement et la morphologie de Borrelia sont révélateurs de la présence de ces bactéries.
  7. Pour quantifier la croissance bactérienne, comptez plusieurs (10) petits carrés individuels dans le quadrillage à seize champs de la zone de comptage des deux côtés de l’hémocytomètre et de la moyenne. Multipliez le nombre moyen de cellules par petit carré par le facteur de conversion approprié pour l’hémocytomètre utilisé pour déterminer le nombre de cellules par mL.
  8. Surveillez la croissance bactérienne à des intervalles de 1 à 2 jours. La croissance exponentielle de Borrelia dépend de la viabilité et de la densité cellulaire et peut prendre 1 semaine ou plus à 34 °C. Diluer les cultures en phase exponentielle dans un rapport de 1:2 ou 1:4 avec le milieu dans un tube de 1,7 mL avant de charger sur l’hémocytomètre. Tenir dûment compte du facteur de dilution lors de la détermination du nombre de cellules. Après utilisation, vaporiser les surfaces et l’hémocytomètre avec de l’eau de Javel diluée (10%) et/ou de l’éthanol à 70%.
    REMARQUE: Les Borrelia sont en croissance exponentielle lorsque les concentrations cellulaires sont de 1-5 x 107 cellules / mL. Dans cette plage, les cellules se développent bien.
  9. Une culture prolongée épuisera les nutriments et modifiera le pH moyen, de sorte que la sous-culture est nécessaire. Dans des conditions stériles dans une enceinte de sécurité biologique, transférer 1/10 du volume de culture dans un nouveau tube et le remplir avec le nouveau milieu (une nouvelle partie aliquote du même milieu utilisée pour cultiver le passage précédent). Une dilution de 1:10 est optimale. Si le volume de culture doit être modifié, ajuster la quantité d’inoculum en conséquence et poursuivre l’incubation. Le nombre de passages augmente à chaque changement de média.
  10. Pour l’extraction de l’ADN ou l’isolement des cellules Borrelia, centrifuger la phase exponentielle Borrelia pendant 10 min à 4000 x g pour granuler la bactérie. Jeter le surnageant dans les déchets biodangereux appropriés. Traiter les bactéries granulées avec un kit d’extraction d’ADN commercial ou remettre les bactéries en suspension dans un milieu approprié pour l’expérience prévue.
  11. À la fin de chaque manipulation, stériliser tout l’équipement avec de l’éthanol et des rayons UV, selon les besoins. Recueillir les déchets liquides, y compris l’excès de culture, dans une bouteille à déchets et ajouter de l’eau de Javel à une concentration finale de 10%. Placez ce flacon à -80 °C avant de le jeter. Alternativement, stériliser les déchets liquides et la culture sans eau de Javel ni alcool par autoclavage.

4. Stockage à long terme des cultures Borrelia

  1. Préparation du stock de glycérol de la culture Borrelia
    1. Prendre ~1,8 mL d’aliquotes de cultures en phase exponentielle, concentrations cellulaires ~10 7-108 cellules/mL, et ajouter du glycérol stérile à une concentration finale de 10% (concentrations de 5% à 20% de travail).
    2. Placer dans des flacons cryogéniques à bouchon à vis de 2 mL. Conserver à -80 °C.
    3. Conserver un stock contenant au moins 10 tubes de chaque souche au congélateur.
  2. Une autre recette de stockage pour produire un stock de glycérol pour un stockage permanent
    1. Mélanger les 2/3 de la culture Borrelia avec 1/3 de glycérol à 15% dans le bouillon Brucella . Utilisez 2,8 g de bouillon Brucella dissous dans 100 mL deddH2O, qui a été filtré stérile (0,22 μm).
    2. Maintenir le stock de glycérol des échantillons entre -70 °C et -80 °C.

5. Isolement des spirochètes de sources environnementales ou cliniques

REMARQUE : Si vous isolez du matériel provenant de sources humaines, animales ou environnementales, il faut obtenir une certification en éthique de la recherche, en soins aux animaux ou en écologie, selon le cas.

  1. Culture de Borrelia à partir de tiques dures
    1. Recueillez des femelles adultes, des mâles et/ou des tiques nymphales.
    2. Stériliser en surface tous les échantillons de tiques en les trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant 2 minutes et en les séchant à l’air libre dans une enceinte de sécurité biologique. Disséquer individuellement en plusieurs morceaux avec un scalpel stérile. Placer les morceaux dans un tube de 2 mL contenant 1,5 mL de milieu, complété par des antibiotiques.
    3. Incuber les cultures à 34 °C et vérifier la présence de spirochètes par microscopie à fond foncé ou à contraste de phase deux fois par semaine pendant les 2 premières semaines et chaque semaine par la suite pendant 6 semaines (plus souvent pour les spirochètes RF). Sous-culture d’échantillons positifs à la culture dans 5 mL du même milieu.
      REMARQUE : Les cultures contaminées peuvent être purifiées dans une certaine mesure par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 μm; Des antibiotiques peuvent être nécessaires pour résoudre complètement la contamination.
  2. Culture de Borrelia à partir d’échantillons de sang
    REMARQUE: L’échantillon de sang doit être prélevé par un professionnel médical, vétérinaire ou de recherche qualifié, selon la source du matériel. Moins de 24 heures à RT devraient s’écouler entre les échantillons
    retrait et arrivée au laboratoire.
    1. Obtenir 10 mL de sang, recueilli dans des tubes de prélèvement sanguin en verre avec du dextrose au citrate acide (DCA; « sommet jaune ») comme anticoagulant. Laisser à température ambiante. Il est recommandé que moins de 24 heures s’écoulent entre le prélèvement sanguin et l’inoculation.
    2. Centrifuger le sang avec un anticoagulant pendant 10 min à 200-400 x g pour séparer le plasma des cellules sanguines.
    3. Retirer délicatement le plasma du tube et inoculer 1 mL de plasma dans 5 mL de milieu complet MKP préchauffé. MKP peut être complété par des antibiotiques. Incuber les cultures à 33 °C avec une inspection visuelle quotidienne et une microscopie hebdomadaire à fond noir ou à contraste de phase jusqu’à ce que la croissance borreliale soit remarquée (plus souvent pour RF Borrelia), ce qui peut prendre jusqu’à 9 semaines.
      REMARQUE : Si vous utilisez des volumes d’inoculation plus grands ou plus petits, maintenez le rapport de 1:5 entre l’inoculant et le moyen. Utilisez des sérums ou du plasma plutôt que du sang total.
  3. Culture de Borrelia à partir d’une biopsie cutanée
    1. Stériliser en surface la biopsie cutanée (idéalement un cube de 3 mm x 3 mm x 3 mm, c.-à-d. avec de l’éthanol à 70 % et du peroxyde d’hydrogène). Placez l’échantillon de biopsie dans une solution saline physiologique.
      REMARQUE : Un échantillon de biopsie doit être prélevé par un professionnel médical, vétérinaire ou de recherche qualifié, selon la source du matériel. Moins de 24 heures à RT devraient s’écouler entre le prélèvement de l’échantillon et l’arrivée au laboratoire.
    2. Couper l’échantillon en deux à six petits morceaux à l’aide d’une lame de rasoir stérile dans une boîte de Petri en verre stérile tout en étant immergé dans la solution saline physiologique. Transférer tous les échantillons et ~1 mL de la solution saline physiologique dans laquelle la biopsie cutanée a été conservée dans 5 mL de milieu préchauffé complété par des antibiotiques et incuber à 33 °C.
    3. En cas de prolifération de bactéries contaminantes, ajouter des antibiotiques comme à l’étape 1.1.10 ci-dessus, ou en ajoutant deux comprimés de sulfaméthoxazole (23,75 mg ; concentration finale 5 mg/mL) + triméthoprime (1,25 mg ; 0,25 mg/mL) ou Bactrim (concentration minimale inhibitrice >128 μg/mL), deux comprimés d’Amikacine (2 x 30 μg ; concentration finale 12 μg/mL), et deux comprimés de phosfomycine (2 x 200 μg; concentration finale 80 μg/mL).
      NOTE: Dans tous les cas, assurez-vous de rester en dessous de la concentration minimale inhibitrice de cet antibiotique pour les espèces de Borrelia pour lesquelles la culture est tentée41,42,43.
    4. Si la culture est positive pour Borrelia, conservez la culture pendant 3-4 jours supplémentaires ou jusqu’à ce que la quantité de Borrelia atteigne 10+ spirochètes dans un champ de microscope en utilisant un objectif 40X. Créez un stock de glycérol pour un stockage permanent.

6. Isolement de populations monoclonales de spirochètes de B. burgdorferi sensu lato et de B. miyamotoi à partir de cultures liquides par culture sur milieu solide

  1. Pour la fabrication des plaques, chauffer 300 mL de milieu complet MKP 1,5X (sans gélatine). De plus, réchauffer 200 mL d’agarose à 1,7 % (autoclavée dans de l’eau désionisée, conservée à TA et passée au micro-ondes avant utilisation) à 55 °C. Mélanger les deux liquides.
  2. Pipeter 15 ml de ce mélange dans chacune des 16 boîtes de Petri profondes pour faire la gélose inférieure oselayer.
  3. Retenir le reste du milieu à 55 °C au bain-marie.
    NOTE: Les Borrelia sont mélangés dans la couche supérieure d’agarose.
  4. Tout d’abord, quantifier la densité de culture de Borrelia à l’aide d’un hémocytomètre et diluer à la densité souhaitée dans un milieu liquide.
    REMARQUE: 500, 200, 100 et 50 spirochètes par plaque fonctionnent bien.
  5. Une fois que les plaques inférieures se sont solidifiées, ajouter 10 mL du mélange d’agarose restant dans un tube de 15 mL contenant le nombre approprié de spirochètes.
  6. Versez la suspension sur l’agarose inférieure dans la boîte de Petri étiquetée.
    NOTE: Étant donné que les spirochètes de Borrelia sont sensibles aux températures élevées, il faut veiller à ce que les bactéries ne soient pas exposées à 55 ° C pendant une période prolongée; Versez la gélose supérieure immédiatement après l’avoir ajoutée aux cellules bactériennes dans le milieu.
  7. Une fois les assiettes complètement solidifiées, fermez les boîtes de Petri et placez-les à l’envers à 34-35 °C dans 2,5% de CO2.
    NOTE: Les colonies apparaîtront 1 semaine après le placage si la procédure réussit.
  8. Pour cribler et agrandir les colonies individuelles, sélectionner des colonies individuelles dans les plaques et les placer dans 1,5 mL de MKP liquide modifié, ou d’autres milieux appropriés, dans des tubes de culture stériles de 2 mL.
  9. Incuber les cultures à 34 °C et rechercher des spirochètes par microscopie à fond noir ou en phase. Utilisez ces cultures pour l’analyse ou les stocks, réalisés comme décrit ci-dessus.

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Representative Results

Les milieux de culture Borrelia BSK et MKP, et leurs variantes, sont des milieux de culture riches avec des ingrédients qui doivent être préparés et stérilisés séquentiellement. Lorsqu’il est correctement préparé, le milieu BSK doit être rouge-orange et clair (Figure 1). La turbidité et les précipitations qui persistent après le réchauffement indiquent des ingrédients problématiques, une production moyenne ou une contamination; Un tel support est mieux jeté. Si de la gélatine est ajoutée à BSK et avec MKP, le milieu sera gélatineux lorsqu’il sera réfrigéré; Au réchauffement, il sera liquide, bien que légèrement visqueux.

La croissance des cultures Borrelia pures ne changera pas la turbidité du milieu. Cependant, la croissance des cultures bactériennes, Borrelia, ainsi que des contaminants, changera de couleur moyenne en raison de l’indicateur de pH. La prolifération par d’autres bactéries produira de la turbidité et des matériaux agglomérés (figure 2).

La croissance de la culture peut être surveillée par contraste de phase ou microscopie à fond noir (Figure 3 et Figure 4). Les cellules de Borrelia dans la phase exponentielle sont généralement minces et pliées, et mobiles dans une certaine mesure. Au fur et à mesure que les cultures entrent dans la phase stationnaire, les corps ronds sont de plus en plus évidents (Figure 5). Les isolats cliniques ou environnementaux contiennent souvent plusieurs souches et/ou espèces de Borrelia . Pour isoler des clones purs, des cultures liquides peuvent être plaquées pour isoler les colonies monoclonales (Figure 6); Parfois, plusieurs cycles d’isolement des colonies peuvent être nécessaires.

Figure 1
Figure 1: BSK et milieu MKP. (A) BSK (avec antibiotiques) avec une culture pure de Borrelia burgdorferi. Avec ou sans B. burgdorferi, le milieu reste sans turbidité visible et est orange-ambre (la couleur varie légèrement selon les ingrédients). (B) MKP milieu, non inoculé, décongélant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Milieu contaminé BSK et MKP avec prolifération de bactéries concurrentes. Le milieu est décoloré, trouble et, au fil du temps, les bactéries concurrentes meurent et précipitent au fond du tube. (A) Tube BSK envahi par la végétation. (B) Vieux tube BSK contenant des bactéries contaminantes précipitées. (C) Tube MKP avec (gauche) et sans culture (au milieu) et culture contaminée (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Utilisation d’un hémocytomètre pour surveiller la croissance de Borrelia. Borrelia burgdorferi souche B31 (un sous-ensemble indiqué par des flèches) vue sur un hémocytomètre (une ligne de la petite grille est indiquée par la pointe de flèche) sous contraste de phase 200X. Ce grossissement et ce processus permettent de surveiller les cultures et d’estimer la densité cellulaire. La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Image en fond noir de Borrelia burgdorferi. Image en fond noir de la souche SCW-53 de Borrelia burgdorferi, à haute densité en phase exponentielle après 5-7 jours de culture en milieu MKP (grossissement 400X). La barre d’échelle est de 20 μm. Cette souche a été isolée à partir de la tique dure Ixodes affinis, collectée en Caroline du Sud, aux États-Unis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Borrelia dans les cultures anciennes. Au fur et à mesure que les cellules de Borrelia entrent dans la phase stationnaire dans les cultures anciennes, les formes rondes du corps sont de plus en plus considérées comme remplaçant la forme spirochétale. Il peut s’agir de formes dormantes ou de cellules mortes. Panneau de gauche, teinture de Dieterle; panneau central, coloration immunohistochimique; et panneau droit, hybridation fluorescente in situ d’une culture Borrelia (présumée être B. burgdorferi d’après l’origine, mais l’espèce et la souche n’ont pas été identifiées moléculairement) inoculée avec de l’urine canine. La collecte des données de la figure 5 a été approuvée par le Comité de protection des animaux de l’Université Mrt. Allison, numéro d’approbation 16-1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato. Colonies de spirochètes complexes Borrelia burgdorferi sensu lato cultivées en milieu solide afin d’isoler des populations clonales pures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La culture de bactéries en laboratoire est le tremplin de la recherche. L’avantage profond conféré par la capacité de culture est illustré par la lutte, pendant plus d’un siècle qui n’a abouti que récemment au succès, pour la culture Treponema pallidum, le spirochète qui est l’agent étiologique de la syphilis44. Les spirochètes de Borrelia sont également difficiles à cultiver, mais la culture est possible 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Les cellules de Borrelia sont fastidieuses et chaque espèce et souche, et même isolant diffèrent, à la fois génétiquement et par adaptation à l’hôte à partir duquel elles ont été isolées 51,52,53,54,55. Lors de la fabrication de médias, l’utilisation d’ingrédients appropriés fait une énorme différence dans la vigueur de la culture Borrelia ou même la viabilité de la culture. L’utilisation d’un milieu fraîchement préparé, hautement enrichi et correctement stocké est essentielle pour favoriser la croissance bactérienne et constitue une exigence bien établie pour la croissance bactérienne. Pour Borrelia, le maintien de conditions anaérobies ou microaérobies est nécessaire à une bonne croissance. Cela peut être réalisé plus simplement en remplissant les tubes vers le haut, de sorte qu’il reste peu ou pas d’air dans le tube et en cultivant les cultures sans agitation; Un contrôle plus rigoureux de l’oxygène et du dioxyde de carbone peut être nécessaire pour l’expression génique et les études connexes 26,27,28,29,30. L’ajout d’antibiotiques au milieu de culture bactérien peut sembler contre-intuitif; l’utilisation de faibles doses d’antibiotiques dans le milieu Borrelia vise à décourager la croissance de bactéries à croissance plus rapide. Si la culture est inoculée avec un isolat de Borrelia pur, l’ajout d’antibiotiques n’est pas nécessaire; Cependant, l’utilisation d’antibiotiques ajoutés est essentielle pour décourager la prolifération de bactéries concurrentes lors de l’inoculation avec des échantillons cliniques ou environnementaux. Le milieu BSK peut également être complété par de la gélatine à 3%-7%. Ceci est nécessaire pour la croissance de l’espèce RF Borrelia 21. L’utilisation de BSK ou MKP pour la croissance des espèces de Borrelia burgdorferi sensu lato dépend de la source de l’isolat. Les deux milieux soutiennent la croissance des cultures établies, mais MKP s’est avéré plus performant lors de l’ensemencement de nouvelles cultures avec un faible nombre de cellules Borrelia, comme cela se produit avec les isolats cliniques ou environnementaux23,24. Ce milieu permet également la culture de B. miyamotoi56,57,58. En fin de compte, il y a un élément d’art dans la science de la croissance de microbes fastidieux, mais c’est possible avec soin et persévérance.

La culture de Borrelia sous-tend les progrès de la recherche biomédicale. La culture de Borrelia a permis de déterminer le génome complet et le protéome de nombreuses espèces de Borrelia, ce qui a permis aux chercheurs de commencer à démêler l’évolution et la biologie de ces spirochètes54,58,59. De même, l’accès aux cultures pures de Borrelia permet de comprendre les nombreuses interactions complexes de Borrelia avec l’hôte mammifère et le vecteur arthropode 61,62,63,64,65, y compris les interactions avec le système immunitaire de l’hôte11,65, permet d’en déduire les mécanismes de transmission 29,66, et fournit l’outil de recherche clé pour distinguer les cellules cultivables, donc nécessairement vivantes, des débris cellulaires, une distinction qui est essentielle pour démêler les mécanismes de la pathogenèse ainsi que les schémas thérapeutiques efficaces 8,67,68,69,70,71. Alors que la culture in vitro de Borrelia peut prendre plusieurs semaines avant que les spirochètes soient suffisamment abondants pour être détectés, la limitation des applications de diagnostic clinique, la compréhension fondamentale de la biologie de Borrelia, de la génomique, des interactions hôte-pathogène et de nombreuses autres applications ont reposé sur la capacité d’isoler Borrelia pur. cultures à partir d’isolats environnementaux, et d’amplifier ces isolats par culture afin de produire suffisamment de matériel pour l’analyse biochimique et génétique. Il existe une pression sociétale en faveur d’une réponse rapide aux infections afin de soutenir un diagnostic et un traitement rapides. L’autre composante de ce besoin, cependant, est la recherche biomédicale et biologique nécessaire pour établir une base solide sur laquelle traiter et prévenir les maladies de manière appropriée et réussie. Bien que difficile, la culture in vitro de spirochètes Borrelia est possible et peut répondre à ces besoins.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Acknowledgments

Ces travaux ont été partiellement financés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada et la Fondation canadienne de la maladie de Lyme (AB et VL), le Conseil suédois de la recherche (SB, M-LF et IN), LE PROJET TAČR GAMA 2 - « Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS » (TP01010022) (MG et NR), et par une subvention du ministère de la Santé de la République tchèque NV19-05-00191 (MG et NR). Nous remercions S. Vranjes (2021, laboratoire Rudenko) pour l’image de la figure 4 et J. Thomas-Ebbett (2021, laboratoire Lloyd) pour les images de la figure 5. Nous remercions tous les chercheurs qui ont contribué au domaine et nous nous excusons auprès de ceux dont nous n’avons pas pu citer le travail en raison de contraintes d’espace.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

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Immunologie et infection numéro 189
Méthodes de culture des spirochètes du complexe Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato et de la fièvre récurrente <em>Borrelia</em>
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Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

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