Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Odlingsmetoder för spiroketer från Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex och återfallsfeber Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

In vitro-odling är en direkt detektionsmetod för närvaro av levande bakterier. Detta protokoll beskriver metoder för odling av olika Borrelia spiroketer, inklusive de av Borrelia burgdorferi sensu lato-komplexet, återfallsfeber Borrelia-arter och Borrelia miyamotoi. Dessa arter är kräsna och långsamt växande men kan odlas.

Abstract

Borrelia består av tre grupper av arter, de av Lyme borrelios (LB) gruppen, även känd som B. burgdorferi sensu lato (s.l.) och nyligen omklassificerad till Borreliella, gruppen återfallsfeber (RF) Borrelia, och en tredje reptilassocierad grupp av spiroketer. Odlingsbaserade metoder förblir guldstandarden för laboratoriedetektering av bakterieinfektioner för både forskning och kliniskt arbete, eftersom odling av patogener från kroppsvätskor eller vävnader direkt detekterar replikerande patogener och ger källmaterial för forskning. Borrelia och Borreliella spiroketer är kräsna och långsamt växande och odlas därför inte vanligtvis för kliniska ändamål; Kultur är dock nödvändigt för forskning. Detta protokoll visar den metodik och de recept som krävs för att framgångsrikt odla LB- och RF-spiroketer, inklusive alla erkända arter från B. burgdorferi s.l.-komplexet inklusive B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis och RFspiroketer, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis och B. miyamotoi. Det grundläggande mediet för odling av LB- och RF-spiroketer är Barbour-Stoenner-Kelly-mediet (BSK-II eller BSK-H), som på ett tillförlitligt sätt stöder tillväxten av spiroketer i etablerade kulturer. För att kunna odla nyligen isolerade Borrelia-isolat från fästing- eller värd-härledda prover där det initiala spiroketantalet är lågt i inokulatet föredras modifierat Kelly-Pettenkofer (MKP) medium. Detta medium stöder också tillväxten av B. miyamotoi. Framgången för odlingen av RF-spiroketer beror också kritiskt på ingrediensernas kvalitet.

Introduction

Borrelia är ett släkte av spiroketbakterier som omfattar tre stora klader: Lyme borrelios (LB) -gruppen, gruppen med återfallsfeber (RF) och en mindre välkarakteriserad grupp som till synes är begränsad till reptiler. Borrelia-taxonomin är i förändring med tillkomsten av molekylära metoder som möjliggör jämförelser mellan genom och proteom, vilket är sant för de flesta andra taxonomiska grupper 1,2,3,4,5,6,7. LB-gruppen (även kallad borreliagruppen) har traditionellt kallats Borrelia burgdorferi sensu lato efter sin bäst karakteriserade medlem Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Denna uppsats använder den för närvarande mest använda terminologin: LB, RF och reptilassocierad grupp, och beskriver kulturprotokollen för LB- och RF-grupperna.

Som man kan förvänta sig för en medlem av familjen Spirochaetaceae kan Borrelia anta den distinkt långa och tunna spiralformen, vanligtvis 20-30 μm lång och 0,2-0,3 μm bred. Borreliaceller är dock mycket pleomorfa och kan anta många andra former i både odling och in vivo 1,8 som ett resultat av deras komplexa cellulära och genetiska struktur. I sin spiroketala form är den plana sinusvågmorfologin resultatet av dess axiella endoflagella som roterar i det periplasmatiska utrymmet mellan de inre och yttre membranen. Denna struktur gör att cellerna kan vara mycket rörliga, med det yttre membranet som innehåller proteiner som gör det möjligt för cellen att interagera med värdvävnader 9,10. Uttrycket av de yttre membranproteinerna är tätt reglerat och påverkar inte bara värdvävnadsinvasion utan också interaktion med värdens immunsystem11. Detta komplexa genuttryck gör det möjligt för Borrelia-cellerna att pendla mellan de mycket olika miljöerna hos ryggradsdjur värdar och ryggradslösa djurvektorer. Borrelias genom är ovanligt bland prokaryoter, bestående av en linjär snarare än en cirkulär kromosom. Förutom den linjära kromosomen innehåller Borrelia-arter 7-21 plasmider, några linjära och några cirkulära. Plasmiderna har majoriteten av gener som krävs för värdanpassning och virulens, och de cirkulära plasmiderna som härrör från profetier tros vara ansvariga för majoriteten av horisontellt genflöde mellan spiroketala celler12,13. I överensstämmelse med en roll i värdanpassning, förlorar vissa, möjligen många eller alla, medlemmar av Lyme borrelios-gruppen plasmider i kultur14. Den bäst studerade "laboratorieanpassade" stammen av B. burgdorferi, B31, har bara sju av de nio plasmider som finns i vilda isolat av denna art15. På samma sätt förlorar B. garinii plasmider i kultur16. Vissa studier har visat att RF-arter och B. miyamotoi behåller plasmider när de odlas14,17, men nyligen arbete visar förändrade plasmider och infektivitet med långsiktig in vitro-odling 18.

Odlingsbaserade metoder förblir guldstandarden för laboratoriedetektering av bakteriella infektioner, för både forskning och kliniskt arbete14,17. Kulturen av patogener från kroppsvätskor eller vävnader detekterar direkt replikerande patogener och ger källmaterial för forskning14,17. Detta protokoll demonstrerar den metodik och de recept som krävs för att framgångsrikt odla spiroketerna i LB-gruppen samt RF Borrelia och B. miyamotoi. Det grundläggande mediet för odling av Borrelia-spiroketer är Barbour-Stoenner-Kelly-mediet (BSK-II eller den kommersiellt tillgängliga BSK-H), med eller utan antibiotika för att minska tillväxten av förorenande prokaryoter. Detta medium anpassades från ett medium som ursprungligen användes för att stödja RF Borrelia19, ytterligare modifierat av Stoenner20 och sedan av Barbour21. Många modifieringar har sedan dess utvecklats, var och en har effekter på bakteriefysiologi som kan påverka tillväxt, smittsamhet och patogenicitet22. Detta medium stöder på ett tillförlitligt sätt tillväxten av spiroketer i etablerade kulturer och har använts för att isolera spiroketer från fästing, däggdjur och kliniska prover23. Den nyligen utvecklade variationen, modifierat Kelly-Pettenkofer (MKP) medium, kan ge bättre isoleringsframgång, morfologi och rörlighet vid isolering av nya Borrelia-isolat från miljöprover, när antalet spiroketer som finns i provet som är tillgängliga för sådd av kulturen är låga23,24. I alla fall är odlingens framgång kritiskt beroende av det nyberedda mediet och användningen av lämpliga ingredienser. Inte alla kommersiella ingredienser producerar högkvalitativt medium. Inokulerade kulturer kan enkelt inkuberas utan skakning i en konventionell 32–34 °C-inkubator i närvaro av en liten mängd kvarvarande omgivande syre. Borrelia spiroketer är anaerober men utsätts i naturen för fluktuationer i syre- och koldioxidkoncentrationer och svarar med förändringar i genuttryck26,27,28,29. Således bör genuttryck, tillväxt och andra metaboliska studier kontrollera syre- och koldioxidnivåer med användning av en syrekontrollerad inkubator eller anaerob kammare. I kulturen kontrolleras kulturer varje vecka, eller oftare, för närvaro av spiroketer med antingen mörkfältmikroskopi eller faskontrastmikroskopi. Odlingsutstryk kan färgas med antingen silverfläckar, immunhistokemi eller genom användning av fluorescerande märkta stammar29,30. PCR följt av DNA-sekvensering är en känslig och specifik metod för att detektera och genetiskt identifiera eller bekräfta Borrelia-arten 30,31,32,33.

Många mindre variationer på BSK-II finns, och vissa är kommersiellt tillgängliga. Det protokoll som beskrivs här i avsnitt 1 har anpassats från Barbour (1984) 21. Flytande MKP-medium är ett nyligen utvecklat medium och beskrivs i avsnitt 2. Den framställs enligt ett tidigare rapporterat protokoll33,34, som i likhet med BSK-medium består av två steg: beredning av basmedium och beredning av komplett medium. Borreliaodlingsmediet kan framställas med eller utan antibiotika, såsom beskrivs i avsnitt 3; Antibiotika verkar för att minska kontaminerande bakterier som införs vid inokulering med kliniska prover eller miljöprover, enligt beskrivningen i avsnitt 4. om inokulering med ren Borrelia sp. kultur, antibiotika kanske inte behövs. Att göra långsiktiga Borrelia-aktier är ofta viktigt, och ett protokoll för att göra det beskrivs i avsnitt 5. I avsnitt 6 beskrivs användningen av dessa medier för att isolera rena Borrelia sensu lato-kloner från kliniska prover eller miljöprover. Det finns ett antal möjliga tillvägagångssätt36; Nedan är en som visat sig vara effektiv. Pläteringsmediet som används i detta protokoll är en modifiering av BSK-II-pläteringsmedium37 och MKP-medium 34 (med kaninserum ökat till 10%38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla studier med prover som erhållits från människor godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid det relevanta universitetet och / eller den medicinska anläggningen, och skriftligt informerat samtycke erhölls från deltagarna innan proverna samlades in. Alla studier med prover från djur godkändes och genomfördes enligt riktlinjerna från den institutionella djurförsöksetiska kommittén. I förekommande fall har godkännanden erhållits för miljöprovtagning.

OBS: Kulturens framgång är kritiskt beroende av ingrediensernas kvalitet. Kommersiellt BSK-medium är tillgängligt och stöder robust tillväxten av laboratorieanpassad ren B. burgdorferi och besläktade arter där högdosinokulum kan användas för att fröa kulturen. För isolat av stammar från primärt biologiskt material föredras nyberett medium och är ofta nödvändigt.

Borrelia sp. är kända eller misstänkta patogener, och oskärmad vävnad från människa eller djur kan också vara en biologisk fara. Hantering av potentiellt smittsamt material kräver personlig skyddsutrustning och steril teknik för utredarens säkerhet. Dessutom är mediet så näringsrikt att kulturen lätt förorenas. Biosäkerhetsnivå 2 inneslutning krävs i allmänhet för detta arbete och allt arbete med Borrelia sp. eller prover bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp.

1. Instruktioner för att göra BSK-II medium

  1. Beredning av komplett BSK-II-medium
    1. Skaffa reagenser för att bereda 1 liter av mediet enligt tabell 1.
      OBS: BSA-renhet (eller brist på renhet) är avgörande för optimal tillväxt. I synnerhet skiljer sig BSA-renheten mellan både tillverkare och parti. Se tabell 2 för en lista över fler respektive mindre framgångsrika produkter. Att få flera prover från olika leverantörer, testa dem för optimal tillväxt och sedan köpa en stor mängd av det bästa partiet är en effektiv strategi för att mildra detta problem och producera ett bra medium.
    2. Börja med att lösa BSA i en bägare genom att röra i vattnet, vilket tar minst en halvtimme.
    3. Tillsätt alla torra kemikalier och låt dem lösas upp. Lägg sedan till CMRL.
    4. Justera pH för BSK-II-mediet till 7,6, om nödvändigt, med 1 M NaOH.
    5. Tillsätt kaninserum till BSK-II-mediet till en koncentration av 6% -10%. Filter sterilisera (0,22 μm porstorlek) BSK-II-mediet. Den erforderliga mängden serum beror på Borrelia-arten . Använd 6% -7% för RF-arter och stammar, och för Borrelia burgdorferi sensu lato. Om tillväxten inte är stark, tillsätt ytterligare 1% -2% sterilt kaninserum till mediet.
    6. Frys stammen av BSK-II-medium i 100 ml eller 400 ml alikvoter.
    7. För RF-stammar krävs gelatin. Tillsätt 100 ml 7% sterilt gelatin (något uppvärmt för att sätta det i en lösning) till 400 ml BSK-II-medium. Värm BSK-II med gelatin vid 37 °C så att gelatinet smälter innan kulturen ympas.
      OBS: Medium kan frysas (-20 ° C) före filtersterilisering och tillsats av kaninserum och gelatin (för RF-spiroketer) eller efter filtersterilisering och tillsats av serum (och gelatin). Mediet är stabilt när det är fryst under lång tid. När det förvaras i kylskåp, använd mediet inom 1 månad. RF-arter växer bäst med färskt medium, vanligtvis inte mer än 1 vecka gammalt. Om det inte är fryst, inspektera visuellt mediets kvalitet för grumlighet. Kassera mediet som verkar vara förorenat, utfällande ingredienser eller på annat sätt tvivelaktigt.
    8. Om antibiotika skall tillsättas mediet, tillsätt dem till nytillverkade medelstora eller tidigare frysta alikvoter. Det senare är det mer flexibla tillvägagångssättet. Använd antibiotikakoncentrationer som beskrivs av Oliver et al.39.
    9. Medan du tinar ett rör av mediet, väg antibiotika i sterila (autoklaverade) 1,7 ml rör eller sterila 15 ml koniska rör med en precisionsbalans. Bered stamlösningarna enligt följande: Lös 25 mg amfotericin B i 10 ml DMSO, 20 mg fosfomycin i 1 ml autoklaverat destillerat vatten och 50 mg rifampicin i 1 ml DMSO.
    10. Filtersterilisera (0,2 μm sprutfilter) antibiotikan och överför dem till ett nytt rör av lämplig storlek.
    11. Späd antibiotika i ett förhållande av 1:1000 av mediet för att nå sin slutliga koncentration. För 500 ml BSK, tillsätt 0,5 ml amfotericin B-stamlösning (2,5 mg/ml i DMSO), 0,5 ml fosfomycinstamlösning (20 mg/ml i sterilH2O) och 0,5 ml stamlösning av rifampicin (US: rifampicin) (50 mg/ml i DMSO).
    12. Använd det antibiotikakompletterade mediet eller alikvoten och frys vid -20 °C.
Beståndsdelar Belopp (/L)
BSA-fraktion V 50 g
CMRL-1066 (10x) 100 ml
Neopepton 5 g
Hepes 6 g
Citronsyra trinatriumsaltdihydrat 0,7 gr
Glukos 5 g
TC-jäst 2 g
Pyruvsyra (Na-salt) 0,8 gr
N-acetyl-D-glukosamin 0,4 gr
Bikarbonat 2.2 gr
Vatten (hög renhet) 900 ml

Tabell 1: Sammansättning av 1 liter BSK-II-medium.

Källa Lämplighet
Serva GmbH, Heidelberg, Tyskland Ja
Proliant Biologicals, Boone IA, USA Ja
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, USA Nej

Tabell 2: Källor till BSA och lämplighet för BSK-II-medium.

2. Instruktioner för att göra MKP

  1. Beredning av basmedium
    1. Väg försiktigt upp och lös upp alla pulverformiga komponenter enligt tabellen 3 i 3 /4 av den slutliga volymenddH2O(ca 750 ml) under omrörning tills den är helt upplöst, vilket tar ~1 timme.
    2. Efter fullständig upplösning, justera pH med NaOH till 7,6 och volymen till 1000 ml och sterilisera sedan genom filtrering (0,22 μm filter).
      OBS: Basmedium kan förvaras vid -20 °C i upp till 3 månader.
  2. Beredning av MKP komplett medium
    1. Blanda alla komponenter enligt tabell 4 på ett sterilt sätt. Sterilisera gelatinet genom autoklavering och hantera på ett sterilt sätt. Arbeta i ett sterilt biologiskt säkerhetsskåp och använd ett sterilt filtrerat serum.
    2. Aliquot MKP i 50 ml rör. Sätt en liten alikvot vid 33 °C i flera dagar och kontrollera sedan under ett mörkfältsmikroskop att det inte förekommer någon kontaminering.
      OBS: Håll MKP komplett medium vid +4 ° C i högst 1 månad, och frys inte. Hela mediet kan dessutom steriliseras genom filtrering med användning av ett 0,22 μm filter.
Beståndsdelar Belopp (/L)
CMRL-1066 (10x utan glutamin) 100 ml (om vätska)/9,7 g/l om pulver
Neopepton 3 g
Hepes 6 g
Citronsyra 0,7 gr
Glukos 3 g
Pyruvsyra 0,8 gr
N-acetylglukosamin 0,4 gr
Bikarbonat 2 g

Tabell 3: Sammansättning av 1 liter basiskt MKP-medium (modifierat Kelly-Pettenkofer-medium).

Beståndsdelar Mängd (ml)
Grundläggande medium 500
7% gelatin (i H2O) (nyligen autoklaverat men inte varmt) 100
Kanin serum 36
35% BSA 17.5

Tabell 4: Sammansättning av MKP (modifierad Kelly-Pettenkofer) komplett medium.

3. Kultur av Borrelia, med eller utan antibiotika

  1. Utför alla experimentella steg under sterila arbetsförhållanden i ett biologiskt säkerhetsskåp. Desinficera ytan och allt material med 70% etanol och överför dem omedelbart till det biologiska säkerhetsskåpet. UV-sterilisera alla icke-biologiska material i det biologiska säkerhetsskåpet i 5 minuter före arbetets början.
  2. Använd det färskaste mediet som möjligt.
  3. För att starta en kultur, förvärm mediet (33 ° C - 37 ° C) i en inkubator. Applicera skakning om det behövs.
    Beroende på medievolymen kan det här steget ta flera timmar.
  4. Tillsätt ~1 ml tinad Borreliakultur från en glycerol eller liknande stam, som tidigare lagrats vid -80 °C och tinats vid rumstemperatur (RT), så snart den är flytande, till 5-15 ml förvärmt BSK-medium. Inokulera kulturen i en liten volym (5-15 ml BSK) med kommersiellt tillgängliga glas- eller plastflaskor med skruvlock. Fyll rören nästan fulla för att skapa en mikro- eller anaerob atmosfär. Stäng rören tätt; om den odlas på detta sätt behövs inte CO2 .
  5. Odla RF-arter (och B. persica) vid 37 °C i en inkubator utan omrörning eller omrörning. Odla arter av B. burgdorferi sensu lato vid 33–34 °C.
  6. Övervaka tillväxten av Borreliakulturen med faskontrast eller mörkfältsmikroskopi med 200x-400x förstoring (figur 3). För att säkerställa en jämn fördelning av celler, blanda kulturen med en serologisk pipett eller för mer blandning med en 3 ml överföringspipett medan pipettering upp och ner.
    OBS: Borrelia är mest synliga vid högre förstoring (200X-400X), men är bäst att räkna vid 200X förstoring på en hemocytometer40. Borrelia rörelse och morfologi är en indikation på närvaron av dessa bakterier.
  7. För att kvantifiera bakterietillväxt, räkna flera (10) enskilda små rutor i sextonfältsmönstret för att räkna området på båda sidor av hemocytometern och medelvärdet. Multiplicera det genomsnittliga cellantalet per liten kvadrat med omvandlingsfaktorn som är lämplig för hemocytometern som används för att bestämma cellantalet per ml.
  8. Övervaka bakterietillväxten med 1-2 dagars intervall. Den exponentiella tillväxten av Borrelia är beroende av viabilitet och celldensitet och kan ta 1 vecka eller längre vid 34 °C. Späd de exponentiella faskulturerna i förhållandet 1: 2 eller 1: 4 med mediet i ett 1,7 ml rör före belastning på hemocytometern. Ta hänsyn till utspädningsfaktorn på lämpligt sätt vid bestämning av cellantalet. Efter användning, spraya ytorna och hemocytometern med utspädd blekmedel (10%) och / eller 70% etanol.
    OBS: Borrelia är i exponentiell tillväxt när cellkoncentrationerna är 1-5 x 107 celler / ml. Inom detta område växer cellerna bra.
  9. Utökad kultur kommer att tömma näringsämnen och ändra mediets pH, så subkultur krävs. Under sterila förhållanden i ett biologiskt säkerhetsskåp överförs 1/10 av odlingsvolymen till ett nytt rör och fylls med det nya mediet (en ny alikvot av samma medium som användes för att odla föregående passage). En utspädning på 1:10 är optimal. Om odlingsvolymen ska ändras, justera inokulatmängden därefter och fortsätt inkubationen. Antalet passager ökar med varje medieändring.
  10. För extraktion av DNA eller isolering av Borrelia-celler, centrifugera exponentialfasen Borrelia i 10 minuter vid 4000 x g för att pellet bakterierna. Kassera supernatanten i lämpligt biologiskt farligt avfall. Bearbeta de pelleterade bakterierna med en kommersiell DNA-extraktionssats eller suspendera bakterierna på nytt i ett medium som är lämpligt för det avsedda experimentet.
  11. Vid slutet av varje manipulation, sterilisera all utrustning med etanol och UV-strålning, beroende på vad som är lämpligt för utrustningen. Samla det flytande avfallet, inklusive överskottskultur, i en avfallsflaska och tillsätt blekmedel till en slutlig koncentration på 10%. Placera flaskan vid -80 °C innan du slänger den. Alternativt sterilisera det flytande avfallet och kulturen utan blekmedel eller alkohol genom autoklavering.

4. Långtidsförvaring av Borreliakulturer

  1. Beredning av glycerolbestånd av Borrelia-kulturen
    1. Ta ~ 1,8 ml alikvoter av exponentiella faskulturer, cellkoncentrationer ~ 107-10 8 celler / ml och tillsätt steril glycerol till en slutlig koncentration på 10% (koncentrationer av 5% -20% arbete).
    2. Placera i 2 ml kryogena injektionsflaskor med skruvlock. Förvaras vid -80 °C.
    3. Håll ett lager med minst 10 rör av varje stam i frysen.
  2. Ett alternativt lagringsrecept för att producera ett glycerollager för permanent lagring
    1. Blanda 2/3 av Borrelia-kulturen med 1/3 av 15% glycerol i Brucella-buljong . Använd 2,8 g Brucella-buljong upplöst i 100 mlddH2O, som sterilfiltrerades (0,22 μm).
    2. Förvara glycerolstammen i proverna vid -70 °C till -80 °C.

5. Isolering av spiroketer från miljö eller kliniska källor

OBS: Om isolerande material från människor, djur eller miljökällor måste forskningsetik, djurvård eller ekologisk certifiering, beroende på vad som är lämpligt, erhållas.

  1. Odling av Borrelia från hårda fästingar
    1. Samla vuxna honor, hanar och/eller nymphal fästingar.
    2. Ytsterilisera alla fästingprover genom att doppa dem i 70% etanol i 2 min och lufttorka i ett biologiskt säkerhetsskåp. Dissekera individuellt i flera bitar med en steril skalpell. Placera bitarna i ett 2 ml rör innehållande 1,5 ml medium, kompletterat med antibiotika.
    3. Inkubera kulturerna vid 34 °C och kontrollera spiroketer med mörkfälts- eller faskontrastmikroskopi två gånger i veckan under de första 2 veckorna och därefter varje vecka i 6 veckor (oftare för RF-spiroketer). Subkulturkulturpositiva prover i 5 ml av samma medium.
      OBS: Förorenade kulturer kan renas i viss utsträckning genom filtrering med ett 0,2 μm filter; Antibiotika kan krävas för att helt lösa kontaminering.
  2. Odling av Borrelia från blodprover
    OBS: Blodprovet ska tas av en kvalificerad medicinsk, veterinär eller forskare, beroende på materialets källa. Mindre än 24 timmar vid rumstemperatur bör gå mellan provet
    borttagning och ankomst till labbet.
    1. Erhåll 10 ml blod, uppsamlat i bloduppsamlingsrör av glas med surt citratdextros (ACD; "gul topp") som ett antikoagulant. Låt stå i rumstemperatur. Det rekommenderas att mindre än 24 timmar passerar mellan blodinsamling och ympning.
    2. Centrifugera blodet med antikoagulantia i 10 minuter vid 200-400 x g för att separera plasma från blodkroppar.
    3. Ta försiktigt bort plasman från röret och inokulera 1 ml plasma i 5 ml förvärmt MKP komplett medium. MKP kan kompletteras med antibiotika. Inkubera kulturer vid 33 °C med daglig visuell inspektion och veckovis mörkfälts- eller faskontrastmikroskopi tills borrelial tillväxt märks (oftare för RF Borrelia), vilket kan ta upp till 9 veckor.
      OBS: Om du använder större eller mindre inokuleringsvolymer, behåll förhållandet 1:5 mellan inokulant och medium. Använd serum eller plasma snarare än helblod.
  3. Odling av Borrelia från hudbiopsi
    1. Ytsterilisera hudbiopsin (helst en kub på 3 mm x 3 mm x 3 mm, dvs med 70% etanol och väteperoxid). Placera biopsiprovet i fysiologisk saltlösning.
      OBS: Ett biopsiprov ska tas av en kvalificerad medicinsk, veterinär eller forskare, beroende på materialets källa. Mindre än 24 timmar vid RT bör gå mellan provborttagning och ankomst till laboratoriet.
    2. Tärna provet i två till sex mindre bitar med ett sterilt rakblad i en steril petriskål av glas medan du är nedsänkt i den fysiologiska saltlösningen. Överför alla prover och ~ 1 ml av den fysiologiska saltlösningen där hudbiopsin lagrades till 5 ml förvärmt medium kompletterat med antibiotika och inkubera vid 33 ° C.
    3. Vid överväxt av kontaminerande bakterier, tillsätt antibiotika som i steg 1.1.10 ovan, eller genom att tillsätta två tabletter sulfametoxazol (23,75 mg; slutlig koncentration 5 mg/ml) + trimetoprim (1,25 mg; 0,25 mg/ml) eller Bactrim (minsta hämmande koncentration >128 μg/ml), två tabletter amikacin (2 x 30 μg; slutlig koncentration 12 μg/ml), och två tabletter fosfomycin (2 x 200 μg; slutlig koncentration 80 μg/ml).
      OBS: I alla fall, var noga med att hålla sig under den minsta hämmande koncentrationen av det antibiotikumet för de Borrelia-arter för vilka odling försöks41,42,43.
    4. Om kulturen är positiv för Borrelia , behåll kulturen i ytterligare 3-4 dagar eller tills mängden Borrelia når 10+ spiroketer i ett mikroskopfält med ett 40X-mål. Skapa ett glycerollager för permanent lagring.

6. Isolering av monoklonala populationer av B. burgdorferi sensu lato spiroketer och B. miyamotoi från flytande kulturer genom odling på fasta medier

  1. För att göra plattor, värm 300 ml 1.5X MKP komplett medium (utan gelatin). Värm också 200 ml 1,7% agaros (autoklaverad i avjoniserat vatten, lagrad vid RT och mikrovågsugn före användning) till 55 ° C. Blanda båda vätskorna.
  2. Pipettera 15 ml av denna blandning i var och en av 16 djupa petriskålar för att göra bottenagarskiktet.
  3. Behåll resten av mediet vid 55 °C i ett vattenbad.
    OBS: Borrelia blandas i det övre agarosskiktet.
  4. Kvantifiera först Borrelia-odlingsdensiteten med hjälp av en hemocytometer och späd till önskad densitet i ett flytande medium.
    OBS: 500, 200, 100 och 50 spiroketer per tallrik fungerar bra.
  5. Efter att bottenplattorna har stelnat, tillsätt 10 ml av den återstående agarosblandningen till ett 15 ml rör innehållande lämpligt antal spiroketer.
  6. Häll suspensionen på botten agaros i den märkta petriskålen.
    OBS: Eftersom Borrelia spiroketer är känsliga för hög temperatur, bör man se till att bakterierna inte utsätts för 55 ° C under en längre tid; Häll toppagaren omedelbart efter tillsats till bakteriecellerna i mediet.
  7. När plattorna har stelnat helt, stäng petriskålarna och lägg dem upp och ner vid 34-35 ° C i 2,5% CO2.
    OBS: Kolonierna kommer att visas 1 vecka efter plätering om proceduren är framgångsrik.
  8. För att screena och expandera de enskilda kolonierna, välj enskilda kolonier från plattorna och lägg dem i 1,5 ml modifierad flytande MKP, eller andra lämpliga medier, i sterila 2 ml odlingsrör.
  9. Inkubera kulturerna vid 34 °C och undersök spiroketer med mörkfälts- eller fasmikroskopi. Använd dessa kulturer för analys eller bestånd, gjorda enligt beskrivningen ovan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Borrelia kulturmedier BSK och MKP, och varianter, är rika kulturmedier med ingredienser som måste beredas och steriliseras sekventiellt. När det är korrekt förberett ska BSK-mediet vara rödorange och klart (figur 1). Grumlighet och nederbörd som kvarstår efter uppvärmning indikerar problematiska ingredienser, medelproduktion eller förorening; Sådant medium kasseras bäst. Om gelatin tillsätts till BSK och med MKP kommer mediet att vara gelatinöst när det kyls; Vid uppvärmning kommer den att vara flytande, även om den är något viskös.

Tillväxten av rena Borrelia-kulturer kommer inte att förändra mediets grumlighet. Tillväxten av bakteriekulturer, Borrelia, liksom föroreningar, kommer emellertid att ändra medelfärg som ett resultat av pH-indikatorn. Överväxt av andra bakterier kommer att producera grumlighet och klumpiga material (figur 2).

Kulturtillväxt kan övervakas med faskontrast eller mörkfältsmikroskopi (figur 3 och figur 4). Borreliaceller i exponentiell fas är vanligtvis smala och kinkade och rörliga till viss del. När kulturerna går in i den stationära fasen blir runda kroppar alltmer uppenbara (figur 5). Kliniska isolat eller miljöisolat innehåller ofta flera Borrelia-stammar och/eller arter. För att isolera rena kloner kan flytande kulturer pläteras för att isolera monoklonala kolonier (figur 6); Ibland kan flera omgångar av koloniisolering behövas.

Figure 1
Figur 1: BSK och MKP medium. (A) BSK (med antibiotika) med en ren kultur av Borrelia burgdorferi. Med eller utan B. burgdorferi-medium förblir utan synlig grumlighet och är orange-bärnsten (färgen varierar något med ingredienser). (B) MKP medium, oinokulerad, tining. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Förorenat BSK- och MKP-medium med överväxt av konkurrerande bakterier. Medium är missfärgad, grumlig och med tiden dör konkurrerande bakterier och fälls ut till botten av röret. (A) Övervuxet BSK-rör. (B) Gammalt BSK-rör med utfällda förorenande bakterier. (C) MKP-rör med (vänster) och utan (mitten) kultur och förorenad kultur (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Användning av en hemocytometer för att övervaka Borrelia-tillväxt . Borrelia burgdorferi stam B31 (en delmängd indikerad med pilar) sedd på en hemocytometer (en rad i det lilla rutnätet indikeras av pilspetsen) under 200X faskontrast. Denna förstoring och process möjliggör övervakning av kulturer och uppskattning av celldensitet. Skalstången är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Mörkfältsbild av Borrelia burgdorferi. Mörkfältsbild av Borrelia burgdorferi-stammen SCW-53, vid hög densitet i exponentiell fas efter 5-7 dagars odling i MKP-medium (400X förstoring). Skalstången är 20 μm. Denna stam isolerades från den hårda fästingen Ixodes affinis, samlad i South Carolina, USA. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Borrelia i gamla kulturer. När Borrelia-celler går in i den stationära fasen i gamla kulturer ses runda kroppsformer alltmer ersätta spiroketalformen. Dessa kan vara vilande former eller döda celler. Vänster panel, Dieterle fläck; mittpanel, immunohistokemi fläck; och höger panel, fluorescerande in situ-hybridisering av en Borrelia-kultur (antas vara B. burgdorferi baserat på ursprung men arten och stammen identifierades inte molekylärt) inokulerad med hundurin. Insamling av data i figur 5 godkändes av Mrt. Allison University Animal Care Committee, godkännandenummer 16-1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Borrelia burgdorferi sensu lato komplexa spiroketer. Kolonier av Borrelia burgdorferi sensu lato komplexa spiroketer odlade på fast medium för att isolera rena klonpopulationer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Laboratoriekulturen av bakterier är språngbrädan för forskning. Den djupa fördel som förmågan att odla ges exemplifieras av kampen, under mer än ett sekel som nyligen kulminerade i framgång, för att odla Treponema pallidum, spiroketen som är syfilisetiologiska agent 44. Borrelia spiroketer är också utmanande för kultur, men kultur är möjlig 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Borreliaceller är kräsna och varje art och stam, och till och med isolat skiljer sig åt, både genetiskt och genom anpassning till värden från vilken de har isolerats 51,52,53,54,55. Vid tillverkning av media gör användningen av lämpliga ingredienser en enorm skillnad i kraften i Borrelia-kulturen eller till och med kulturens livskraft. Användningen av nyberedda, högberikade och korrekt lagrade medier är avgörande för att främja bakterietillväxt och är ett väletablerat krav för bakterietillväxt. För Borrelia krävs upprätthållande av anaeroba eller mikroaeroba förhållanden för god tillväxt. Detta kan uppnås enklast genom att fylla rören till toppen, så det finns lite eller ingen luft kvar i röret och växer kulturerna utan omrörning; Strängare kontroll av syre och koldioxid kan krävas för genuttryck och relaterade studier 26,27,28,29,30. Tillsatsen av antibiotika till bakterieodlingsmediet kan verka kontraintuitiv; användningen av låga doser antibiotika i Borrelia-mediet är att motverka tillväxten av snabbare växande bakterier. Om kulturen inokuleras med ett rent Borrelia-isolat behövs inte tillsats av antibiotika; Användningen av tillsatta antibiotika är dock avgörande för att motverka överväxt från konkurrerande bakterier vid inokulering med kliniska eller miljömässiga prover. BSK-medium kan också kompletteras med 3% -7% gelatin. Detta behövs för tillväxten av RF Borrelia arter21. Användningen av BSK eller MKP för tillväxt av Borrelia burgdorferi sensu lato-arter beror på isolatets källa. Båda medierna stöder tillväxten av etablerade kulturer, men MKP har visat sig prestera bättre när sådd nya kulturer med lågt antal Borrelia-celler, såsom sker med kliniska eller miljömässiga isolat23,24. Detta medium tillåter också kulturen av B. miyamotoi56,57,58. I slutändan finns det ett element av konst till vetenskapen om att odla snabba mikrober, men det är möjligt med omsorg och uthållighet.

Kulturen i Borrelia ligger till grund för framsteg inom biomedicinsk forskning. Kulturen av Borrelia har gjort det möjligt att bestämma hela genomet och proteomet hos många Borrelia-arter, vilket har gjort det möjligt för forskare att börja riva upp evolutionen och biologin hos dessa spiroketer54,58,59. På samma sätt möjliggör tillgång till rena kulturer av Borrelia förståelsen av de många komplexa interaktionerna mellan Borrelia och däggdjursvärden och leddjursvektorn 61,62,63,64,65, inklusive interaktioner med värdimmunsystemet11,65, gör det möjligt att sluta sig till överföringsmekanismer 29,66, och ger det viktigaste undersökningsverktyget för att skilja odlingsbara, därmed nödvändigtvis levande, celler från cellulärt skräp, en distinktion som är avgörande för att avslöja mekanismerna för patogenes samt effektiva behandlingsregimer 8,67,68,69,70,71. Medan in vitro Borrelia-kulturen kan ta flera veckor innan spiroketer är tillräckligt rikliga för detektion, vilket begränsar kliniska diagnostiska tillämpningar, har grundläggande förståelse för Borrelia-biologi, genomik, värd-patogeninteraktioner och många fler applikationer förlitat sig på förmågan att isolera ren Borrelia kulturer från miljöisolat och att förstärka dessa isolat genom odling för att producera tillräckligt med material för biokemisk och genetisk analys. Det finns ett samhälleligt tryck för snabb respons på infektioner för att stödja snabb diagnos och behandling. Den andra komponenten i detta behov är emellertid den biomedicinska och biologiska forskning som behövs för en solid grund för att på lämpligt och framgångsrikt behandla och förebygga sjukdomar. Även om det är utmanande är in vitro-odling av Borrelia-spiroketer möjlig och kan stödja dessa behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklarerades.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av Kanadas naturvetenskapliga och tekniska forskningsråd och Canadian Lyme disease Foundation (AB och VL), Vetenskapsrådet (SB, M-LF och IN), TAČR GAMA 2-projektet - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG och NR), och av ett bidrag från Tjeckiens hälsoministerium NV19-05-00191 (MG och NR). Vi tackar S. Vranjes (2021, Rudenko lab) för bilden i figur 4 och J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) för bilderna i figur 5. Vi tackar alla forskare som har bidragit till fältet och ber om ursäkt till dem vars arbete vi inte kunde citera på grund av utrymmesbegränsningar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 189
Odlingsmetoder för spiroketer från Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato Complex och återfallsfeber <em>Borrelia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter