Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrkningsmetoder for spirocheter fra Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex og recidiverende feber Borrelia

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

In vitro-kultur er en direkte detektionsmetode for tilstedeværelsen af levende bakterier. Denne protokol beskriver metoder til dyrkning af forskellige Borrelia spirochetes, herunder dem af Borrelia burgdorferi sensu lato komplekset, recidiverende feber Borrelia arter og Borrelia miyamotoi. Disse arter er kræsne og langsomt voksende, men kan dyrkes.

Abstract

Borrelia består af tre grupper af arter, dem af Lyme borreliosis (LB) gruppen, også kendt som B. burgdorferi sensu lato (s.l.) og for nylig omklassificeret til Borreliella, recidiverende feber (RF) gruppe Borrelia og en tredje reptil-associeret gruppe af spirochetes. Kulturbaserede metoder forbliver guldstandarden for laboratoriepåvisning af bakterielle infektioner til både forskning og klinisk arbejde, da dyrkning af patogener fra kropsvæsker eller væv direkte registrerer replikerende patogener og giver kildemateriale til forskning. Borrelia og Borreliella spirochetes er kræsne og langsomt voksende og dyrkes derfor ikke almindeligvis til kliniske formål; Men kultur er nødvendig for forskning. Denne protokol demonstrerer den metode og de opskrifter, der kræves for med succes at dyrke LB- og RF-spirokæter, herunder alle anerkendte arter fra B. burgdorferi s.l.-komplekset, herunder B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis og RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis og B. miyamotoi. Det grundlæggende medium til dyrkning af LB- og RF-spirocheter er Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II eller BSK-H) mediet, som pålideligt understøtter væksten af spirocheter i etablerede kulturer. For at kunne dyrke nyligt isolerede Borrelia-isolater fra flåt- eller værtsafledte prøver, hvor det oprindelige spirochete-antal er lavt i podningen, foretrækkes modificeret Kelly-Pettenkofer (MKP) medium. Dette medium understøtter også væksten af B. miyamotoi. Succesen med dyrkning af RF-spirocheter afhænger også kritisk af ingrediensernes kvalitet.

Introduction

Borrelia er en slægt af spirochete bakterier, der omfatter tre store klader: Lyme borreliosis (LB) gruppen, recidiverende feber (RF) gruppe, og en mindre velkarakteriseret gruppe tilsyneladende begrænset til krybdyr. Borrelia-taksonomi er i flux med fremkomsten af molekylære metoder, der tillader genom- og proteomsammenligninger, som det er tilfældet med de fleste andre taksonomiske grupper 1,2,3,4,5,6,7. LB-gruppen (også kaldet borreliosegruppen) er traditionelt blevet kaldt Borrelia burgdorferi sensu lato efter sit bedst karakteriserede medlem Borrelia burgdorferi sensu stricto.  Dette papir bruger den aktuelt mest anvendte terminologi: LB, RF og den reptilassocierede gruppe og beskriver kulturprotokollerne for LB- og RF-grupperne.

Som man kunne forvente for et medlem af familien Spirochaetaceae, kan Borrelia antage den karakteristiske lange og tynde spiralform, typisk 20-30 μm lang og 0,2-0,3 μm bred. Borrelia-celler er imidlertid meget pleomorfe og kan antage mange andre former i både kultur og in vivo 1,8 som følge af deres komplekse cellulære og genetiske struktur. I sin spirochetale form skyldes den plane sinusbølgemorfologi dens aksiale endoflagella, der roterer i det periplasmatiske rum mellem de indre og ydre membraner. Denne struktur gør det muligt for cellerne at være meget bevægelige, med den ydre membran indeholdende proteiner, der gør det muligt for cellen at interagere med værtsvæv 9,10. Ekspressionen af de ydre membranproteiner er stramt reguleret og påvirker ikke kun værtsvævsinvasion, men også interaktion med værtsimmunsystemet11. Denne komplekse genekspression gør det muligt for Borrelia-cellerne at skifte mellem de meget forskellige miljøer hos hvirveldyrværter og hvirvelløse vektorer. Borrelia's genom er usædvanligt blandt prokaryoter, der består af et lineært snarere end et cirkulært kromosom. Ud over det lineære kromosom indeholder Borrelia-arter 7-21 plasmider, nogle lineære og nogle cirkulære. Plasmiderne huser størstedelen af gener, der kræves til værtstilpasning og virulens, og de cirkulære plasmider afledt af profager menes at være ansvarlige for størstedelen af vandret genstrøm mellem spirochetalceller12,13. I overensstemmelse med en rolle i værtstilpasning mister nogle, muligvis mange eller alle, medlemmer af Lyme borreliose-gruppen plasmider i kultur14. Den bedst undersøgte "laboratorietilpasset" stamme af B. burgdorferi, B31, har kun syv af de ni plasmider, der findes i vilde isolater af denne art15. Tilsvarende mister B. garinii plasmider i kultur16. Nogle undersøgelser har vist, at RF-arter og B. miyamotoi bevarer plasmider, når de dyrkes 14,17, men nyere arbejde viser ændrede plasmider og infektivitet med langvarig in vitro-dyrkning 18.

Kulturbaserede metoder forbliver guldstandarden til laboratoriepåvisning af bakterielle infektioner, både til forskning og klinisk arbejde14,17. Kulturen af patogener fra kropsvæsker eller væv detekterer direkte replikerende patogener og leverer kildemateriale til forskning14,17. Denne protokol demonstrerer den metode og de opskrifter, der kræves for med succes at dyrke spirokæterne fra LB-gruppen samt RF Borrelia og B. miyamotoi. Det grundlæggende medium til dyrkning af Borrelia spirochetes er Barbour-Stoenner-Kelly-mediet (BSK-II eller det kommercielt tilgængelige BSK-H), med eller uden antibiotika for at reducere væksten af forurenende prokaryoter. Dette medium blev tilpasset fra et medium, der oprindeligt blev brugt til at understøtte RF Borrelia19, yderligere modificeret af Stoenner20 og derefter af Barbour21. Mange modifikationer er siden blevet udviklet, hver med virkninger på bakteriel fysiologi, der kan påvirke vækst, infektivitet og patogenicitet22. Dette medium understøtter pålideligt væksten af spirocheter i etablerede kulturer og er blevet brugt til at isolere spirokæter fra flåt-, pattedyr- og kliniske prøver23. Den nyere udviklede variation, modificeret Kelly-Pettenkofer (MKP) medium, kan give bedre isolationssucces, morfologi og motilitet ved isolering af nye Borrelia-isolater fra miljøprøver, når antallet af spirokæter, der er til stede i prøven, der er tilgængeligt for frø af kulturen, er lavt23,24. I alle tilfælde afhænger dyrkningens succes kritisk af det frisklavede medium og brugen af passende ingredienser; Ikke alle kommercielle ingredienser producerer medium af høj kvalitet. Podede kulturer kan nemt inkuberes uden omrystning i en konventionel 32-34 °C inkubator under tilstedeværelse af en lille mængde resterende omgivende ilt. Borrelia spirochetes er anaerober, men udsættes i naturen for udsving i ilt- og kuldioxidkoncentrationer og reagerer med ændringer i genekspression26,27,28,29. Således bør genekspression, vækst og andre metaboliske undersøgelser kontrollere for ilt- og kuldioxidniveauer ved brug af en iltstyret inkubator eller anaerob kammer. I kultur kontrolleres kulturer ugentligt eller oftere for tilstedeværelsen af spirocheter med enten mørkefeltmikroskopi eller fasekontrastmikroskopi. Kulturudstrygninger kan farves med enten sølvpletter, immunhistokemi eller ved brug af fluorescerende mærkede stammer29,30. PCR efterfulgt af DNA-sekventering er en følsom og specifik metode til at detektere og genetisk identificere eller bekræfte Borrelia-arten 30,31,32,33.

Der findes mange mindre variationer af BSK-II, og nogle er kommercielt tilgængelige. Den protokol, der her er beskrevet i afsnit 1, er tilpasset fra Barbour (1984)21. Flydende MKP-medium er et nyere udviklet medium og er beskrevet i afsnit 2. Den fremstilles i henhold til en tidligere rapporteret protokol33,34, som i lighed med BSK-mediet består af to trin: forberedelse af basisk medium og forberedelse af komplet medium. Borrelia-dyrkningssubstratet kan fremstilles med eller uden antibiotika som beskrevet i punkt 3. antibiotika virker for at reducere kontaminerende bakterier, der indføres ved podning med kliniske prøver eller miljøprøver, som beskrevet i punkt 4 hvis podning med ren Borrelia sp. kultur, er antibiotika muligvis ikke nødvendig. Det er ofte vigtigt at lave langsigtede Borrelia-aktier, og en protokol for at gøre dette er beskrevet i afsnit 5. Afsnit 6 beskriver brugen af disse medier til at isolere rene Borrelia sensu lato-kloner fra kliniske eller miljømæssige prøver. Der er en række mulige tilgange36; Nedenfor er en fundet at være effektiv. Det pletteringsmedium, der anvendes i denne protokol, er en modifikation af BSK-II-platingmedium37 og MKP-medium 34 (med kaninserum øget til 10%38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle undersøgelser, der involverede prøver opnået fra mennesker, blev godkendt af Institutional Review Board for det relevante universitet og / eller medicinske facilitet, og skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra deltagerne, før prøverne blev indsamlet. Alle undersøgelser, der involverede prøver fra dyr, blev godkendt og udført i henhold til retningslinjerne fra den institutionelle dyreetiske komité. Hvor det er relevant, er der opnået godkendelse til miljøprøvetagning.

BEMÆRK: Kulturens succes er kritisk afhængig af ingrediensernes kvalitet. Kommercielt BSK-medium er tilgængeligt og understøtter robust væksten af laboratorietilpasset ren B. burgdorferi og beslægtede arter, hvor højdosisinokulum kan bruges til at frø kulturen. For isolater af stammer fra primært biologisk materiale foretrækkes frisklavet substrat og er ofte nødvendigt.

Borrelia sp. er kendte eller mistænkte patogener, og uscreenet væv fra mennesker eller dyr kan også være en biohazard. Håndtering af potentielt smittefarligt materiale kræver personlige værnemidler og steril teknik af hensyn til investigators sikkerhed. Derudover er mediet så næringsrigt, at kulturen let forurenes. Indeslutning af biosikkerhedsniveau 2 er generelt påkrævet til dette arbejde, og alt arbejde med Borrelia sp. eller prøver skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab.

1. Instruktioner til fremstilling af BSK-II-medium

  1. Fremstilling af komplet BSK-II medium
    1. Der udtages reagenser til fremstilling af 1 liter substrat som vist i tabel 1.
      BEMÆRK: BSA-renhed (eller mangel på renhed) er afgørende for optimal vækst. Især BSA-renhed varierer mellem både producent og parti. Se tabel 2 for en liste over flere versus mindre succesrige produkter. At få flere prøver fra forskellige leverandører, teste dem for optimal vækst og derefter købe en stor mængde af det bedste parti er en effektiv strategi til at afbøde dette problem og producere et godt medium.
    2. Start med at opløse BSA i et bægerglas ved omrøring i vandet, hvilket vil tage mindst en halv time.
    3. Tilsæt alle de tørre kemikalier og lad dem opløses. Tilføj derefter CMRL.
    4. BSK-II-substratets pH justeres om nødvendigt til 7,6 med 1 M NaOH.
    5. Tilsæt kaninserum til BSK-II-mediet i en koncentration på 6% -10%. Filtrer steriliser (0,22 μm porestørrelse) BSK-II-mediet. Den nødvendige mængde serum afhænger af Borrelia-arten . Brug 6% -7% til RF-arter og stammer og til Borrelia burgdorferi sensu lato. Hvis væksten ikke er stærk, tilsættes yderligere 1% -2% sterilt kaninserum til mediet.
    6. Lageret af BSK-II-substrat fryses ned i 100 ml eller 400 ml alikvoter.
    7. For RF-stammer kræves gelatine. Tilsæt 100 ml 7% steril gelatine (let opvarmet for at sætte den i en opløsning) til 400 mL BSK-II medium. BSK-II opvarmes med gelatine ved 37 °C for at få gelatinen til at smelte, inden kulturen podes.
      BEMÆRK: Substratet kan fryses (-20 °C) før filtersterilisering og tilsætning af kaninserum og gelatine (til RF-spirocheter) eller efter filtersterilisering og serumtilsætning (og gelatine). Mediet er stabilt, når det fryses i lang tid. Når det opbevares i køleskab, skal du bruge mediet inden for 1 måned. RF-arter vokser bedst med frisk medium, normalt ikke mere end 1 uge gammel. Hvis det ikke er frosset, skal du visuelt inspicere mediets kvalitet for turbiditet. Kassér mediet, der ser ud til at være forurenet, udfældet ingredienser eller på anden måde tvivlsomt.
    8. Hvis der skal tilsættes antibiotika til mediet, tilsættes de til frisklavede, middelsnedige eller tidligere frosne delprøver. Sidstnævnte er den mere fleksible tilgang. Brug antibiotikakoncentrationer som beskrevet af Oliver et al.39.
    9. Mens du optøer et rør af mediet, vejes antibiotika i sterile (autoklaverede) 1,7 ml rør eller sterile 15 ml koniske rør ved hjælp af en præcisionsbalance. Stamopløsningerne fremstilles på følgende måde: 25 mg amphotericin B opløses i 10 ml DMSO, 20 mg phosphomycin i 1 ml autoklaveret destilleret vand og 50 mg rifampicin i 1 ml DMSO.
    10. Filtrer, steriliser (0,2 μm sprøjtefiltre) antibiotika og overfør dem til et nyt rør af passende størrelse.
    11. Fortynd antibiotika i et forhold på 1:1000 af mediet for at nå deres endelige koncentration. Til 500 ml BSK tilsættes 0,5 ml amphotericin B-stamopløsning (2,5 mg/ml i DMSO), 0,5 ml phosphomycinstamopløsning (20 mg/ml i sterilH2O) og 0,5 ml rifampicin (US: rifampin) stamopløsning (50 mg/ml i DMSO).
    12. Der anvendes antibiotika suppleret med substrat eller delprøve og fryses ved -20 °C.
Vælgere Beløb (/L)
BSA fraktion V 50 g
CMRL-1066 (10x) 100 ml
Neopepton 5 g
Hepes 6 g
Citronsyre trinatriumsalt dihydrat 0,7 g
Glukose 5 g
TC gærolat 2 g
Pyruvinsyre (Na-salt) 0,8 g
N-acetyl-D-glucoseamin 0,4 g
Natriumbicarbonat 2,2 g
Vand (høj renhed) 900 ml

Tabel 1: Sammensætning af 1 liter BSK-II medium.

Kilde Egnethed
Serva GmbH, Heidelberg, Tyskland Ja
Proliant Biologicals, Boone IA, USA Ja
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, Amerikas Forenede Stater Nej

Tabel 2: Kilder til BSA og egnethed for BSK-II medium.

2. Instruktioner til fremstilling af MKP

  1. Fremstilling af basisk medium
    1. Alle pulveriserede komponenter som anført nedenfor i tabel 3 afvejes og opløses omhyggeligt i 3 /4 af det endelige volumen afddH2O(ca. 750 ml) under omrøring, indtil det er helt opløst, hvilket tager ~1 time.
    2. Efter fuldstændig opløsning justeres pH med NaOH til 7,6 og volumenet til 1000 ml, og steriliseres derefter ved filtrering (0,22 μm filter).
      BEMÆRK: Basic medium kan opbevares ved -20 °C i op til 3 måneder.
  2. Fremstilling af MKP komplet medium
    1. Alle komponenter som anført i tabel 4 blandes på en steril måde; Steriliser gelatinen ved autoklavering og håndter på en steril måde. Arbejd i et sterilt biologisk sikkerhedsskab og brug et sterilt filtreret serum.
    2. Aliquot MKP i 50 ml rør. En lille prøve anbringes ved 33 °C i flere dage, og kontroller derefter under et mørkefeltmikroskop, om der ikke er kontaminering.
      BEMÆRK: Opbevar MKP komplet medium ved +4 °C i højst 1 måned, og frys ikke. Det komplette medium kan yderligere steriliseres ved filtrering under anvendelse af et 0,22 μm filter.
Vælgere Beløb (/L)
CMRL-1066 (10x uden glutamin) 100 ml (hvis flydende)/9,7 g/l hvis pulver
Neopepton 3 g
Hepes 6 g
Citronsyre 0,7 g
Glukose 3 g
Pyruvinsyre 0,8 g
N-acetylglucoseamin 0,4 g
Natriumbicarbonat 2 g

Tabel 3: Sammensætning af 1 liter basisk MKP (modificeret Kelly-Pettenkofer) medium.

Vælgere Beløb (ml)
Grundlæggende medium 500
7% gelatine (i H2O) (frisk autoklaveret, men ikke varm) 100
Kanin serum 36
35% BSA 17.5

Tabel 4: Sammensætning af MKP (modificeret Kelly-Pettenkofer) komplet medium.

3. Borrelias kultur, med eller uden antibiotika

  1. Udfør alle eksperimentelle trin under sterile arbejdsforhold i et biologisk sikkerhedsskab. Desinficer overfladen og alle materialer med 70% ethanol, og overfør dem straks til det biologiske sikkerhedsskab. UVSTERILISER alle ikke-biologiske materialer i det biologiske sikkerhedsskab i 5 minutter før arbejdets start.
  2. Brug det friskeste medium muligt.
  3. For at starte en kultur skal du forvarme mediet (33 ° C - 37 ° C) i en inkubator. Påfør omrystning, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Afhængigt af mediets volumen kan dette trin tage flere timer.
  4. Der tilsættes ~1 ml optøet Borrelia-kultur fra en glycerol eller lignende stamme, der tidligere har været opbevaret ved -80 °C og optøet ved stuetemperatur (RT), så snart den er flydende, til 5-15 ml forvarmet BSK-medium. Inokuler kulturen i et lille volumen (5-15 ml BSK) ved hjælp af kommercielt tilgængelige hætteglas af glas eller plast med skruelåg. Fyld rørene næsten fulde for at skabe en mikro- eller anaerob atmosfære. Luk rørene tæt; hvis dyrket på denne måde, er CO2 ikke nødvendig.
  5. Dyrk RF-arter (og B. persica) ved 37 °C i en inkubator uden omrøring eller omrøring. Dyrk B. burgdorferi sensu lato arter ved 33-34 °C.
  6. Overvåg væksten af Borrelia-kulturen ved hjælp af fasekontrast eller mørkefeltmikroskopi ved 200x-400x forstørrelse (figur 3). For at sikre en jævn fordeling af cellerne blandes kulturen med en serologisk pipette eller blandes mere med en 3 ml overførselspipette, mens der pipetteres op og ned.
    BEMÆRK: Borrelia er mest synlige ved højere forstørrelse (200X-400X), men kan bedst tælles ved 200X forstørrelse på et hæmocytometer40. Borrelia bevægelse og morfologi er tegn på tilstedeværelsen af disse bakterier.
  7. For at kvantificere bakterievækst skal du tælle flere (10) individuelle små firkanter i sekstenfeltgittermønsteret for tælleareal på begge sider af hæmocytometeret og gennemsnittet. Multiplicer det gennemsnitlige celleantal pr. lille kvadrat med konverteringsfaktoren, der passer til det hæmocytometer, der bruges til at bestemme celletallet pr. ml.
  8. Overvåg bakterievæksten med 1-2 dages mellemrum. Borrelia's eksponentielle vækst afhænger af levedygtigheden og celletætheden og kan tage 1 uge eller længere ved 34 °C. Fortynd eksponentielle fasekulturer i et forhold på 1: 2 eller 1: 4 med mediet i et 1,7 ml rør, før du lægger på hæmocytometeret. Der tages passende hensyn til fortyndingsfaktoren ved bestemmelse af celleantallet. Efter brug sprøjtes overfladerne og hæmocytometeret med fortyndet blegemiddel (10%) og/eller 70% ethanol.
    BEMÆRK: Borrelia er i eksponentiel vækst, når cellekoncentrationerne er 1-5 x 107 celler/ml. Inden for dette område vokser cellerne godt.
  9. Udvidet kultur vil nedbryde næringsstoffer og ændre medium pH, så subkultur er påkrævet. Under sterile forhold i et biologisk sikkerhedsskab overføres 1/10 af dyrkningsvolumenet til et nyt rør og fyldes med det nye substrat (en frisk prøve af det samme medium, der blev brugt til at dyrke den foregående passage). En 1:10 fortynding er optimal. Hvis dyrkningsvolumen skal ændres, skal du justere podemængden i overensstemmelse hermed og fortsætte inkubationen. Antallet af passager stiger med hver medieændring.
  10. Til ekstraktion af DNA eller isolering af Borrelia-celler centrifugeres eksponentialfasen Borrelia i 10 minutter ved 4000 x g for at pelletere bakterierne. Supernatanten kasseres sammen med egnet affald ved biologisk fare. De pelleterede bakterier behandles med et kommercielt DNA-ekstraktionssæt, eller bakterierne resuspenderes i et passende medium til det påtænkte forsøg.
  11. Ved afslutningen af hver manipulation steriliseres alt udstyr med ethanol og UV-stråling, alt efter hvad der er relevant for udstyret. Opsaml det flydende affald, herunder overskydende kultur, i en affaldsflaske og tilsæt blegemiddel til en endelig koncentration på 10%. Anbring flasken ved -80 °C, før du kasserer den. Alternativt steriliseres det flydende affald og kulturen uden blegemiddel eller alkohol ved autoklavering.

4. Langtidsopbevaring af Borrelia-kulturer

  1. Fremstilling af glycerolbestand af Borrelia-kultur
    1. Tag ~ 1,8 ml alikvoter af eksponentielle fasekulturer, cellekoncentrationer ~ 107-10 8 celler / ml, og tilsæt steril glycerol til en endelig koncentration på 10% (koncentrationer på 5% -20% arbejde).
    2. Anbring kryogene hætteglas med 2 ml skruelåg. Opbevares ved -80 °C.
    3. Oprethold et lager med mindst 10 rør af hver stamme i fryseren.
  2. En alternativ opbevaringsopskrift til fremstilling af en glycerolbestand til permanent opbevaring
    1. Bland 2/3 af Borrelia-kulturen med 1/3 af 15% glycerol i Brucella bouillon. Brug 2,8 g Brucella bouillon opløst i 100 ml ddH2O, som var sterilt filtreret (0,22 μm).
    2. Opbevar glycerolstammen af prøver ved -70 °C til -80 °C.

5. Isolering af spirokæter fra miljømæssige eller kliniske kilder

BEMÆRK: Hvis der isoleres materiale fra menneskers, dyrs eller miljømæssige kilder, skal der opnås forskningsetik, dyrepleje eller økologisk certificering, alt efter hvad der er relevant.

  1. Dyrkning af Borrelia fra hårde flåter
    1. Saml voksne hunner, hanner og/eller nymphalflåter.
    2. Overfladesteriliser alle flåtprøver ved at dyppe dem i 70% ethanol i 2 minutter og lufttørre i et biologisk sikkerhedsskab. Disseker individuelt i flere stykker med en steril skalpel. Anbring stykkerne i et 2 ml rør indeholdende 1,5 ml medium, suppleret med antibiotika.
    3. Kulturerne inkuberes ved 34 °C og kontrolleres for spirokæter ved mørkefelts- eller fasekontrastmikroskopi to gange om ugen i de første 2 uger og derefter ugentligt i 6 uger (oftere for RF-spirocheter). Subkultur kultur-positive prøver i 5 ml af samme medium.
      BEMÆRK: Kontaminerede kulturer kan til en vis grad renses ved filtrering ved hjælp af et 0,2 μm filter; Antibiotika kan være nødvendigt for fuldt ud at løse forurening.
  2. Dyrkning af Borrelia fra blodprøver
    BEMÆRK: Blodprøven skal tages af en kvalificeret medicinsk, veterinær eller forskningspersonale, afhængigt af materialets kilde. Der skal gå mindre end 24 timer ved RT mellem prøven
    fjernelse og ankomst til laboratoriet.
    1. Få 10 ml blod, opsamlet i glasblodopsamlingsrør med syrecitratdextrose (ACD; "gul top") som antikoagulant. Lad være ved stuetemperatur. Det anbefales, at der går mindre end 24 timer mellem blodindsamling og podning.
    2. Centrifuger blodet med antikoagulantia i 10 minutter ved 200-400 x g for at adskille plasma fra blodlegemer.
    3. Fjern forsigtigt plasmaet fra røret og pod 1 ml plasma i 5 ml forvarmet MKP komplet medium. MKP kan suppleres med antibiotika. Inkuber kulturer ved 33 °C med daglig visuel inspektion og ugentlig mørkefelts- eller fasekontrastmikroskopi, indtil borrelial vækst bemærkes (oftere for RF Borrelia), hvilket kan tage op til 9 uger.
      BEMÆRK: Hvis du bruger større eller mindre podningsvolumener, skal du opretholde forholdet 1: 5 mellem podningsmiddel og medium. Brug sera eller plasma i stedet for fuldblod.
  3. Dyrkning af Borrelia fra hudbiopsi
    1. Overfladesteriliser hudbiopsien (ideelt set en 3 mm x 3 mm x 3 mm terning; dvs. med 70% ethanol og hydrogenperoxid). Placer biopsiprøven i fysiologisk saltvand.
      BEMÆRK: En biopsiprøve skal tages af en kvalificeret medicinsk, veterinær eller forskningspersonale afhængigt af materialets kilde. Mindre end 24 timer ved RT skal gå mellem prøveudtagning og ankomst til laboratoriet.
    2. Skær prøven i to til seks mindre stykker ved hjælp af et sterilt barberblad i en steril petriskål, mens du er nedsænket i den fysiologiske saltvand. Alle prøverne og ~1 ml af det fysiologiske saltvand, hvori hudbiopsien blev opbevaret, overføres til 5 ml forvarmet medium suppleret med antibiotika og inkuberes ved 33 °C.
    3. I tilfælde af overvækst af kontaminerende bakterier tilsættes antibiotika som i trin 1.1.10 ovenfor eller ved tilsætning af to tabletter sulfamethoxazol (23,75 mg; slutkoncentration 5 mg/ml) + trimethoprim (1,25 mg; 0,25 mg/ml) eller Bactrim (mindste hæmmende koncentration >128 μg/ml), to tabletter amikacin (2 x 30 μg; slutkoncentration 12 μg/ml), og to tabletter phosfomycin (2 x 200 μg; slutkoncentration 80 μg/ml).
      BEMÆRK: I alle tilfælde skal du sørge for at holde dig under den mindste hæmmende koncentration af det pågældende antibiotikum for Borrelia-arten, for hvilke dyrkning forsøges41,42,43.
    4. Hvis kulturen er positiv for Borrelia , skal du holde kulturen i yderligere 3-4 dage, eller indtil mængden af Borrelia når 10+ spirokæter i et mikroskopfelt ved hjælp af et 40X mål. Opret en glycerolbestand til permanent opbevaring.

6. Dyrkning af monoklonale populationer af B. burgdorferi sensu lato spirochetes og B. miyamotoi fra flydende kulturer ved dyrkning på faste medier

  1. Til fremstilling af plader opvarmes 300 ml 1,5X MKP komplet medium (uden gelatine). Der opvarmes også 200 ml 1,7% agarose (autoklaveret i deioniseret vand, opbevares ved RT og mikrobølges før brug) til 55 °C. Bland begge væsker.
  2. Pipette 15 ml af denne blanding i hver af 16 dybe petriskåle for at fremstille det nederste agaroselag.
  3. Opbevar resten af substratet ved 55 °C i vandbad.
    BEMÆRK: Borrelia blandes i det øverste agaroselag.
  4. Først kvantificeres Borrelia-kulturtætheden ved hjælp af et hæmocytometer og fortyndes til den ønskede densitet i et flydende medium.
    BEMÆRK: 500, 200, 100 og 50 spirocheter pr. Plade fungerer godt.
  5. Når bundpladerne er størknet, tilsættes 10 ml af den resterende agaroseblanding til et 15 ml rør indeholdende det passende antal spirocheter.
  6. Hæld suspensionen på bunden agarose i den mærkede petriskål.
    BEMÆRK: Da Borrelia spirochetes er følsomme over for høje temperaturer, skal det sikres, at bakterierne ikke udsættes for 55 °C i længere tid; Hæld den øverste agar straks efter tilsætning til bakteriecellerne i mediet.
  7. Når pladerne er helt størknet, lukkes petriskålene og lægges på hovedet ved 34-35 °C i 2,5% CO2.
    BEMÆRK: Kolonierne vises 1 uge efter plettering, hvis proceduren er vellykket.
  8. For at screene og udvide de enkelte kolonier skal du vælge enkelte kolonier fra pladerne og lægge dem i 1,5 ml modificeret flydende MKP eller andre egnede medier i sterile 2 ml kulturrør.
  9. Kulturerne inkuberes ved 34 °C og undersøges for spirokæter ved mørkefelts- eller fasemikroskopi. Brug disse kulturer til analyse eller bestande, lavet som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Borrelia-kulturmediet BSK og MKP og varianter er rige kulturmedier med ingredienser, der skal tilberedes og steriliseres sekventielt. Når BSK er korrekt forberedt, skal det være rød-orange og klart (figur 1). Uklarhed og nedbør, der vedvarer efter opvarmning, indikerer problematiske ingredienser, medium produktion eller forurening; Et sådant medium kasseres bedst. Hvis gelatine tilsættes til BSK og med MKP, vil mediet være gelatinøst, når det nedkøles; Ved opvarmning vil den være flydende, selvom den er lidt tyktflydende.

Væksten af rene Borrelia-kulturer vil ikke ændre mediets turbiditet. Imidlertid vil væksten af bakteriekulturer, Borrelia såvel som forurenende stoffer ændre mellemfarve som følge af pH-indikatoren. Overvækst af andre bakterier vil producere turbiditet og klumpede materialer (figur 2).

Kulturvækst kan overvåges ved fasekontrast eller mørkefeltmikroskopi (figur 3 og figur 4). Borrelia-celler i eksponentialfasen er typisk slanke og knækkede og bevægelige til en vis grad. Efterhånden som kulturerne går ind i den stationære fase, bliver runde kroppe mere og mere tydelige (figur 5). Kliniske eller miljømæssige isolater indeholder ofte flere Borrelia-stammer og/eller arter. For at isolere rene kloner kan flydende kulturer belægges for at isolere monoklonale kolonier (figur 6); Nogle gange kan der være behov for flere runder af koloniisolering.

Figure 1
Figur 1: BSK og MKP medium. (A) BSK (med antibiotika) med en ren kultur af Borrelia burgdorferi. Med eller uden B. burgdorferi medium forbliver uden synlig turbiditet og er orange-rav (farve varierer lidt med ingredienser). B) MKP-medium, ikke-inokuleret, optøet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forurenet BSK- og MKP-medium med overvækst af konkurrerende bakterier. Medium er misfarvet, uklart, og over tid dør konkurrerende bakterier og udfældes til bunden af røret. (A) Tilgroet BSK-rør. (B) Gammelt BSK-rør med udfældede kontaminerende bakterier. C) MKP-rør med (venstre) og uden (midterste) kultur og kontamineret kultur (højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Anvendelse af et hæmocytometer til overvågning af Borrelia-vækst . Borrelia burgdorferi stamme B31 (en delmængde angivet med pile) set på et hæmocytometer (en linje i det lille gitter er angivet med pilespidsen) under 200X fasekontrast. Denne forstørrelse og proces muliggør overvågning af kulturer og estimering af celletæthed. Skalabjælken er 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Darkfield billede af Borrelia burgdorferi. Darkfield billede af Borrelia burgdorferi stamme SCW-53, ved høj densitet i eksponentiel fase efter 5-7 dages dyrkning i MKP medium (400X forstørrelse). Skalabjælken er 20 μm. Denne stamme blev isoleret fra den hårde flåt Ixodes affinis, indsamlet i South Carolina, USA. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Borrelia i gamle kulturer. Da Borrelia-celler går ind i den stationære fase i gamle kulturer, ses runde kropsformer i stigende grad at erstatte den spirochetale form. Disse kan være sovende former eller døde celler. Venstre panel, Dieterle plet; midterste panel, immunohistokemisk plet; og højre panel, fluorescerende in situ hybridisering af en Borrelia-kultur (formodes at være B. burgdorferi baseret på oprindelse, men arten og stammen blev ikke molekylært identificeret) podet med hundeurin. Indsamling af data i figur 5 blev godkendt af Mrt. Allison University Animal Care Committee, godkendelsesnummer 16-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Borrelia burgdorferi sensu lato komplekse spirochetes. Kolonier af Borrelia burgdorferi sensu lato komplekse spirocheter dyrket på fast medium for at isolere rene klonale populationer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakteriens laboratoriekultur er springbrættet til forskning. Den dybe fordel, som evnen til kultur giver, eksemplificeres ved kampen, over mere end et århundrede, der først for nylig kulminerede med succes, til kultur Treponema pallidum, spirocheten, der er det etiologiske middel til syfilis44. Borrelia spirochetes er også udfordrende for kultur, men kultur er mulig 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Borrelia-celler er kræsne, og hver art og stamme og endda isolat adskiller sig, både genetisk og gennem tilpasning til værten, hvorfra de er blevet isoleret 51,52,53,54,55. Når man laver medier, gør brugen af passende ingredienser en enorm forskel i Borrelia-kulturens kraft eller endda kulturens levedygtighed. Brugen af frisklavet, højt beriget og korrekt opbevaret medium er afgørende for at fremme bakterievækst og er et veletableret krav til bakterievækst. For Borrelia er det nødvendigt at opretholde anaerobe eller mikroaerobe forhold for god vækst. Dette kan opnås mest enkelt ved at fylde rør til toppen, så der er lidt eller ingen luft tilbage i røret og dyrke kulturerne uden omrøring; Strengere kontrol med ilt og kuldioxid kan være påkrævet for genekspression og relaterede undersøgelser 26,27,28,29,30. Tilsætningen af antibiotika til bakteriekulturmediet kan virke kontraintuitiv; brugen af lave doser antibiotika i Borrelia-mediet er at modvirke væksten af hurtigere voksende bakterier. Hvis kulturen podes med et rent Borrelia-isolat, er tilsætning af antibiotika ikke nødvendig; Imidlertid er brugen af tilsatte antibiotika afgørende for at modvirke overvækst fra konkurrerende bakterier, når de podes med kliniske eller miljømæssige prøver. BSK-medium kan også suppleres med 3% -7% gelatine. Dette er nødvendigt for væksten af RF Borrelia arter21. Anvendelsen af BSK eller MKP til vækst af Borrelia burgdorferi sensu lato arter afhænger af isolatkilden. Begge medier understøtter væksten af etablerede kulturer, men MKP har vist sig at fungere bedre, når der sås nye kulturer med et lavt antal Borrelia-celler, som det sker med kliniske eller miljømæssige isolater23,24. Dette medium tillader også kulturen af B. miyamotoi56,57,58. I sidste ende er der et element af kunst til videnskaben om voksende kræsne mikrober, men det er muligt med omhu og vedholdenhed.

Borrelia-kulturen ligger til grund for fremskridt inden for biomedicinsk forskning. Borrelia-kulturen har gjort det muligt at bestemme det fulde genom og proteom for mange Borrelia-arter, hvilket har gjort det muligt for forskere at begynde at optrævle udviklingen og biologien af disse spirokæter54,58,59. På samme måde giver adgang til rene kulturer af Borrelia mulighed for at forstå de mange komplekse interaktioner mellem Borrelia og pattedyrværten og leddyrvektoren 61,62,63,64,65, herunder interaktioner med værtsimmunsystemet11,65, gør det muligt at udlede transmissionsmekanismer 29,66, og giver det vigtigste undersøgelsesværktøj til at skelne dyrkelige, og dermed nødvendigvis levende, celler fra cellulært affald, en sondring, der er afgørende for at optrævle patogenesemekanismerne samt effektive behandlingsregimer 8,67,68,69,70,71. Mens in vitro Borrelia-kulturen kan tage flere uger, før spirokæter er tilstrækkeligt rigelige til påvisning, begrænser kliniske diagnostiske anvendelser, har grundlæggende forståelse af Borrelia-biologi, genomik, værtspatogeninteraktioner og mange flere anvendelser været afhængig af evnen til at isolere ren Borrelia kulturer fra miljøisolater og at forstærke disse isolater gennem dyrkning for at producere tilstrækkeligt materiale til biokemisk og genetisk analyse. Der er et samfundsmæssigt skub for hurtig reaktion på infektioner for at understøtte hurtig diagnose og behandling. Den anden komponent i dette behov er imidlertid den biomedicinske og biologiske forskning, der er nødvendig for et solidt fundament, hvorpå man på passende og vellykket vis kan behandle og forebygge sygdomme. Selvom det er udfordrende, er in vitro-dyrkning af Borrelia spirochetes mulig og kan understøtte disse behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der blev ikke erklæret interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Natural Science and Engineering Research Council of Canada og Canadian Lyme disease Foundation (AB og VL), det svenske forskningsråd (SB, M-LF og IN), TAČR GAMA 2-projektet - "Support of application potential verification 2.0 at the Biology Centre CAS" (TP01010022) (MG og NR) og af et tilskud fra Tjekkiets sundhedsministerium NV19-05-00191 (MG og NR). Vi takker S. Vranjes (2021, Rudenko lab) for billedet i figur 4 og J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) for billederne i figur 5. Vi takker alle forskere, der har bidraget til feltet og undskylder over for dem, hvis arbejde vi ikke var i stand til at citere på grund af pladsbegrænsninger.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

Immunologi og infektion nummer 189
Dyrkningsmetoder for spirocheter fra Borrelia <em>burgdorferi</em> Sensu Lato Complex og recidiverende feber <em>Borrelia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter