Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Методы культивирования спирохет из комплекса Borrelia burgdorferi Sensu Lato и боррелии возвратного тифа

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

Культура in vitro является прямым методом обнаружения присутствия живых бактерий. В этом протоколе описываются методы культивирования различных спирохет Borrelia, в том числе комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato, видов Borrelia при возвратном тифе и Borrelia miyamotoi. Эти виды привередливы и медленно растут, но их можно культивировать.

Abstract

Боррелии состоят из трех групп видов: группы боррелиоза Лайма (LB), также известной как B. burgdorferi sensu lato (s.l.) и недавно реклассифицированной в Borreliella, группы возвратного тифа (RF) Borrelia и третьей группы спирохет, связанных с рептилиями. Методы, основанные на культуре, остаются золотым стандартом лабораторного выявления бактериальных инфекций как для исследовательской, так и для клинической работы, поскольку культура патогенов из жидкостей или тканей организма непосредственно обнаруживает реплицирующиеся патогены и предоставляет исходный материал для исследований. Боррелии и спирохеты Borreliella привередливы и медленно растут, поэтому обычно не культивируются в клинических целях; Тем не менее, культура необходима для исследований. Этот протокол демонстрирует методологию и рецепты, необходимые для успешного культивирования спирохет LB и RF, включая все признанные виды из комплекса B. burgdorferi s.l., включая B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis иRF спирохеты, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis и B. miyamotoi. Основной средой для выращивания спирохет LB и RF является среда Барбура-Штеннера-Келли (BSK-II или BSK-H), которая надежно поддерживает рост спирохет в устоявшихся культурах. Чтобы иметь возможность выращивать недавно изолированные изоляты Borrelia из образцов, полученных от клещей или хозяев, где исходное число спирохеты в инокуляте низкое, предпочтительна модифицированная среда Келли-Петтенкофера (MKP). Эта среда также поддерживает рост B. miyamotoi. Успех культивирования RF-спирохет также критически зависит от качества ингредиентов.

Introduction

Borrelia — род спирохетных бактерий, который включает в себя три основные клады: группу боррелиоза Лайма (LB), группу возвратного тифа (RF) и менее хорошо охарактеризованную группу, по-видимому, ограниченную рептилиями. Таксономия боррелий находится в постоянном движении с появлением молекулярных методологий, которые позволяют сравнивать геном и протеом, как и большинство других таксономических групп 1,2,3,4,5,6,7. Группа LB (также называемая группой болезни Лайма) традиционно называлась Borrelia burgdorferi sensu lato в честь ее наиболее охарактеризованного члена Borrelia burgdorferi sensu stricto.  В этой статье используется наиболее широко используемая в настоящее время терминология: LB, RF и группа, связанная с рептилиями, и описываются протоколы культивирования для групп LB и RF.

Как и следовало ожидать от члена семейства Spirochaetaceae, боррелии могут принимать отчетливо длинную и тонкую спиральную форму, обычно 20-30 мкм в длину и 0,2-0,3 мкм в ширину. Тем не менее, клетки Borrelia обладают высокой плеоморфностью и могут принимать множество других форм как в культуре, так и in vivo 1,8 в результате их сложной клеточной и генетической структуры. В своей спирохетальной форме плоская синусоидальная морфология является результатом вращения ее осевых эндофлагелл в периплазматическом пространстве между внутренней и внешней мембранами. Эта структура позволяет клеткам быть очень подвижными, а внешняя мембрана содержит белки, которые позволяют клетке взаимодействовать с тканями хозяина 9,10. Экспрессия белков внешней мембраны жестко регулируется и влияет не только на инвазию ткани хозяина, но и на взаимодействие с иммунной системой хозяина11. Эта сложная экспрессия генов позволяет клеткам Borrelia перемещаться между очень разными средами позвоночных хозяев и беспозвоночных переносчиков. Геном боррелий необычен среди прокариот, состоит из линейной, а не кольцевой хромосомы. Помимо линейной хромосомы, виды Borrelia содержат 7-21 плазмиду, некоторые линейные, а некоторые кольцевые. Плазмиды содержат большинство генов, необходимых для адаптации хозяина и вирулентности, а кольцевые плазмиды, полученные из профагов, как полагают, ответственны за большую часть горизонтального потока генов между спирохетальными клетками12,13. В соответствии с ролью в адаптации хозяина, некоторые, возможно, многие или все, члены группы боррелиоза Лайма теряют плазмиды в культуре14. Наиболее изученный «адаптированный к лаборатории» штамм B. burgdorferi, B31, имеет только семь из девяти плазмид, обнаруженных в диких изолятах этого вида15. Точно так же B. garinii теряет плазмиды в культуре16. Некоторые исследования показали, что виды RF и B. miyamotoi сохраняют плазмиды при культивировании14,17, но недавняя работа демонстрирует измененные плазмиды и инфекционность при длительном культивировании in vitro 18.

Методы, основанные на культуре, остаются золотым стандартом для лабораторного выявления бактериальных инфекций, как для исследований, так и для клинической работы14,17. Культура патогенов из биологических жидкостей или тканей непосредственно обнаруживает реплицирующиеся патогены и предоставляет исходный материал для исследований14,17. Этот протокол демонстрирует методологию и рецепты, необходимые для успешного культивирования спирохет группы LB, а также RF Borrelia и B. miyamotoi. Основной средой для выращивания спирохет Borrelia является среда Барбура-Штеннера-Келли (BSK-II или коммерчески доступный BSK-H) с антибиотиками или без них, чтобы уменьшить рост загрязняющих прокариот. Эта среда была адаптирована из среды, первоначально использовавшейся для поддержки RF Borrelia19, в дальнейшем модифицированной Stoenner20, а затем Barbour21. С тех пор было разработано множество модификаций, каждая из которых оказывает влияние на физиологию бактерий, что может влиять на рост, инфекционность и патогенность22. Эта среда надежно поддерживает рост спирохет в устоявшихся культурах и использовалась для выделения спирохет из клещей, млекопитающих и клинических образцов23. Недавно разработанная вариация, модифицированная среда Келли-Петтенкофера (MKP), может обеспечить лучший успех изоляции, морфологию и подвижность при выделении новых изолятов Borrelia из образцов окружающей среды, когда количество спирохет, присутствующих в образце, доступном для посева культуры, низкое23,24. Во всех случаях успех выращивания критически зависит от свежеприготовленной среды и использования соответствующих ингредиентов; Не все коммерческие ингредиенты производят высококачественную среду. Инокулированные культуры можно удобно инкубировать без встряхивания в обычном инкубаторе с температурой 32-34 °C в присутствии небольшого количества остаточного кислорода окружающей среды. Спирохеты Borrelia являются анаэробами, но по своей природе подвержены колебаниям концентрации кислорода и углекислого газа и реагируют изменениями экспрессии генов26,27,28,29. Таким образом, экспрессия генов, рост и другие метаболические исследования должны контролировать уровни кислорода и углекислого газа с использованием кислородно-контролируемого инкубатора или анаэробной камеры. В культуре культуры проверяют еженедельно или чаще на наличие спирохет либо с помощью темнопольной микроскопии, либо с помощью фазово-контрастной микроскопии. Мазки культуры могут быть окрашены либо серебристыми пятнами, иммуногистохимией, либо с помощью флуоресцентно меченных штаммов29,30. ПЦР с последующим секвенированием ДНК является чувствительным и специфическим методом обнаружения и генетической идентификации или подтверждения видов Borrelia 30,31,32,33.

Существует множество незначительных вариаций BSK-II, и некоторые из них коммерчески доступны. Протокол, описанный здесь в разделе 1, был адаптирован из Barbour (1984)21. Жидкая среда МКП является более недавно разработанной средой и описана в разделе 2. Его готовят в соответствии с ранее опубликованным протоколом33,34, который, как и среда BSK, состоит из двух этапов: приготовления основной среды и подготовки полной среды. Питательная среда Borrelia может быть приготовлена с антибиотиками или без них, как описано в разделе 3; антибиотики действуют для уменьшения количества загрязняющих бактерий, вводимых при инокуляции клинических образцов или образцов окружающей среды, как описано в разделе 4; при инокуляции чистой культурой Borrelia sp. антибиотики могут не понадобиться. Создание долгосрочных запасов боррелий часто имеет важное значение, и протокол для этого описан в разделе 5. В разделе 6 описывается использование этих сред для выделения чистых клонов Borrelia sensu lato из клинических образцов или образцов окружающей среды. Возможны несколько подходов36; Ниже приведен один из них, признанный эффективным. Гальваническая среда, используемая в этом протоколе, представляет собой модификацию гальванической средыBSK-II 37 и средыMKP 34 (с крольчатиной сывороткой, увеличенной до 10%38).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования с участием образцов, полученных от человека, были одобрены Институциональным наблюдательным советом соответствующего университета и/или медицинского учреждения, и до того, как образцы были собраны, от участников было получено письменное информированное согласие. Все исследования с использованием образцов, полученных от животных, были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по этике животных. Там, где это уместно, были получены разрешения на отбор проб окружающей среды.

ПРИМЕЧАНИЕ: Успех культуры в решающей степени зависит от качества ингредиентов. Коммерческая среда BSK доступна и надежно поддерживает рост адаптированного к лаборатории чистого B. burgdorferi и родственных видов, где для посева культуры можно использовать инокулят в высоких дозах. Для изолятов штаммов из первичного биологического материала предпочтительна и часто необходима свежеприготовленная среда.

Borrelia sp. являются известными или предполагаемыми патогенами, а непроверенные ткани человека или животных также могут представлять биологическую опасность. Работа с потенциально инфекционным материалом требует средств индивидуальной защиты и стерильной техники для обеспечения безопасности следователя. Кроме того, среда настолько богата питательными веществами, что культура легко загрязняется. Для этой работы, как правило, требуется сдерживание уровня биобезопасности 2, и все работы с Borrelia sp. или образцами должны проводиться в шкафу биологической безопасности.

1. Инструкция по изготовлению носителя БСК-II

  1. Приготовление готовой среды БСК-II
    1. Получают реагенты для приготовления 1 л среды, как показано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистота BSA (или отсутствие чистоты) имеет решающее значение для оптимального роста. В частности, чистота BSA различается как у производителя, так и у партии. Пожалуйста, смотрите Таблицу 2 для списка более и менее успешных продуктов. Получение нескольких образцов от разных поставщиков, тестирование их на оптимальный рост, а затем покупка большого количества лучшей партии является эффективной стратегией для смягчения этой проблемы и производства хорошей среды.
    2. Начните с растворения BSA в стакане, помешивая воду, что займет не менее получаса.
    3. Добавьте все сухие химикаты и дайте им раствориться. Затем добавьте CMRL.
    4. При необходимости отрегулируйте рН среды BSK-II до 7,6 с помощью 1 М NaOH.
    5. Добавьте кроличью сыворотку в среду BSK-II до концентрации 6%-10%. Фильтр стерилизует (размер пор 0,22 мкм) среду BSK-II. Необходимое количество сыворотки зависит от вида боррелий . Используйте 6-7% для видов и штаммов RF, а также для Borrelia burgdorferi sensu lato. Если рост не сильный, добавьте еще 1%-2% стерильной кроличьей сыворотки в среду.
    6. Заморозьте запас среды BSK-II в аликвотах объемом 100 мл или 400 мл.
    7. Для штаммов RF требуется желатин. Добавьте 100 мл 7% стерильного желатина (слегка подогретого, чтобы поместить его в раствор) в 400 мл среды BSK-II. Перед инокуляцией культуры подогрейте BSK-II с желатином при температуре 37 °C, чтобы желатин растаял.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среду можно заморозить (-20 °C) до фильтрующей стерилизации и добавления кроличьей сыворотки и желатина (для радиочастотных спирохет) или после фильтрующей стерилизации и добавления сыворотки (и желатина). Среда стабильна при длительном замораживании. При хранении в холодильнике используйте средство в течение 1 месяца. Виды RF лучше всего растут на свежей среде, обычно не более 1 недели. Если не замерзла, визуально осмотрите качество среды на предмет помутнения. Выбросьте среду, которая кажется загрязненной, осаждающими ингредиентами или иным образом сомнительной.
    8. Если антибиотики должны быть добавлены в среду, добавьте их в свежеприготовленную среду или ранее замороженные аликвоты; Последний является более гибким подходом. Используйте концентрацию антибиотиков, как описано Oliver et al.39.
    9. При размораживании пробирки среды взвешивайте антибиотики в стерильные (автоклавированные) пробирки объемом 1,7 мл или стерильные конические пробирки объемом 15 мл, используя прецизионные весы. Приготовьте исходные растворы следующим образом: растворите 25 мг амфотерицина В в 10 мл ДМСО, 20 мг фосфомицина в 1 мл автоклавной дистиллированной воды и 50 мг рифампицина в 1 мл ДМСО.
    10. Фильтр стерилизуют (шприцевые фильтры 0,2 мкм) антибиотики и переносят их в новую пробирку соответствующего размера.
    11. Разведите антибиотики в соотношении 1:1000 среды до достижения их конечной концентрации. Для 500 мл BSK добавьте 0,5 мл исходного раствора амфотерицина B (2,5 мг / мл в ДМСО), 0,5 мл исходного раствора фосфомицина (20 мг / мл в стерильном H2O) и 0,5 мл исходного раствора рифампицина (США: рифампицин) (50 мг / мл в ДМСО).
    12. Используйте среду с добавлением антибиотиков или аликвоту и заморозьте при -20 ° C.
Составляющих Количество (/л)
БСА дробь V 50 г
CMRL-1066 (10x) 100 мл
Неопептон 5 г
Хепес 6 г
Дигидрат тринатриевой соли лимонной кислоты 0,7 г
Глюкоза 5 г
ТЦ Дрожжевой 2 г
Пировиноградная кислота (Na-соль) 0,8 г
N-ацетил-D-глюкозеамин 0,4 г
Бикарбонат натрия 2,2 г
Вода (высокой чистоты) 900 мл

Таблица 1: Состав 1 л среды БСК-II.

Источник Пригодность
Serva GmbH, Гейдельберг, Германия Да
Proliant Biologicals, Бун И.А., США Да
Сигма (Millipore-Sigma & Sigma-Aldrich), Сент-Луис, Миссури, США Нет

Таблица 2: Источники БСА и пригодность для среды БСК-II.

2. Инструкция по изготовлению МКП

  1. Приготовление основной среды
    1. Тщательно взвесьте и растворите все порошкообразные компоненты, как указано ниже в таблице 3, в 3 /4 конечного объема ddH2O (около 750 мл) путем перемешивания до полного растворения, что занимает ~ 1 час.
    2. После полного растворения отрегулируйте рН с NaOH до 7,6 и объем до 1000 мл, а затем стерилизуйте фильтрацией (фильтр 0,22 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основную среду можно хранить при температуре -20 °C до 3 месяцев.
  2. Приготовление полной среды МКП
    1. Смешайте все компоненты, перечисленные в таблице 4 , стерильно; Стерилизуйте желатин автоклавированием и обрабатывайте стерильно. Работайте в стерильном шкафу биологической безопасности и используйте стерильную отфильтрованную сыворотку.
    2. Aliquot MKP в пробирках по 50 мл. Положите одну маленькую аликвоту при 33 °C на несколько дней, затем проверьте под темным микроскопом на отсутствие загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить полную среду MKP при температуре +4 °C не более 1 месяца и не замораживать. Вся среда может быть дополнительно стерилизована путем фильтрации с использованием фильтра 0,22 мкм.
Составляющих Количество (/л)
CMRL-1066 (в 10 раз без глютамина) 100 мл (если жидкость)/9,7 г/л если порошок
Неопептон 3 г
Хепес 6 г
Лимонная кислота 0,7 г
Глюкоза 3 г
Пировиноградная кислота 0,8 г
N-ацетилглюкозамин 0,4 г
Бикарбонат натрия 2 г

Таблица 3: Состав 1 л основной среды MKP (модифицированная среда Келли-Петтенкофера).

Составляющих Количество (мл)
Базовый носитель 500
7% желатина (в H2O) (свежеприготовленный в автоклаве, но не горячий) 100
Сыворотка для кроликов 36
35% BSA 17.5

Таблица 4: Состав полной среды MKP (модифицированная среда Келли-Петтенкофера).

3. Культура боррелий, с антибиотиками или без них

  1. Выполняйте все экспериментальные действия в стерильных условиях труда в шкафу биологической безопасности. Продезинфицируйте поверхность и все материалы 70% этанолом и немедленно перенесите их в шкаф биологической безопасности. УФ-стерилизуют все небиологические материалы в шкафу биологической безопасности в течение 5 минут до начала работ.
  2. Используйте как можно более свежую среду.
  3. Для запуска культуры предварительно прогрейте среду (33 °C - 37 °C) в инкубаторе. При необходимости встряхните.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от объема среды этот шаг может занять несколько часов.
  4. Добавьте ~ 1 мл размороженной культуры боррелий из глицерина или аналогичного сырья, предварительно хранящегося при -80 ° C и размороженного при комнатной температуре (RT), как только он станет жидким, в 5-15 мл предварительно подогретой среды BSK. Инокулируют культуру в небольшой объем (5-15 мл БСК) с помощью имеющихся в продаже стеклянных или пластиковых флаконов с завинчивающимися крышками. Заполните трубки почти полностью, чтобы создать микро- или анаэробную атмосферу. Плотно закройте трубки; при культивировании таким образом CO2 не нужен.
  5. Выращивайте виды RF (и B. persica) при 37 ° C в инкубаторе без перемешивания или перемешивания. Выращивают виды B. burgdorferi sensu lato при температуре 33-34 °C.
  6. Следите за ростом культуры Borrelia с помощью фазового контраста или темнопольной микроскопии при 200-400-кратном увеличении (рис. 3). Чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, смешайте культуру серологической пипеткой или, для большего перемешивания, трансферной пипеткой объемом 3 мл при пипетке вверх и вниз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Боррелии наиболее заметны при большем увеличении (200X-400X), но лучше всего поддаются подсчету при 200-кратном увеличении на гемоцитометре40. Движение и морфология боррелий свидетельствуют о присутствии этих бактерий.
  7. Чтобы количественно оценить рост бактерий, подсчитайте несколько (10) отдельных маленьких квадратов в шестнадцатипольной сетке подсчета площади подсчета по обе стороны гемоцитометра и усредненного. Умножьте среднее количество клеток на маленький квадрат с коэффициентом преобразования, подходящим для гемоцитометра, используемого для определения количества клеток на мл.
  8. Следите за ростом бактерий с интервалом в 1-2 дня. Экспоненциальный рост боррелий зависит от жизнеспособности и плотности клеток и может занять 1 неделю или дольше при 34 ° C. Разбавляют экспоненциальные фазовые культуры в соотношении 1:2 или 1:4 со средой в пробирке объемом 1,7 мл перед загрузкой на гемоцитометр. Включите соответствующий учет коэффициента разбавления при определении количества клеток. После использования опрыскайте поверхности и гемоцитометр разбавленным отбеливателем (10%) и/или 70% этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Боррелии находятся в экспоненциальном росте, когда концентрация в клетках составляет 1-5 x 107 клеток / мл. В пределах этого диапазона клетки хорошо растут.
  9. Расширенная культура истощает питательные вещества и изменяет рН среды, поэтому требуется субкультивирование. В стерильных условиях в шкафу биологической безопасности переносят 1/10 объема культуры в новую пробирку и заполняют ее новой средой (свежей аликвотой той же среды, использованной для выращивания предыдущего пассажа). Оптимальным является разведение 1:10. Если необходимо изменить объем культуры, соответствующим образом отрегулируйте количество посевного материала и продолжайте инкубацию. Количество пассажей увеличивается с каждой сменой среды.
  10. Для экстракции ДНК или выделения клеток Borrelia центрифугируйте экспоненциальную фазу Borrelia в течение 10 мин при 4000 x g для гранулирования бактерий. Выбросьте надосадочную жидкость вместе с подходящими биологически опасными отходами. Обработайте гранулированные бактерии с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК или ресуспендируйте бактерии в среде, подходящей для предполагаемого эксперимента.
  11. В конце каждой манипуляции стерилизуйте все оборудование этанолом и УФ-излучением, в зависимости от оборудования. Соберите жидкие отходы, включая излишки культуры, в бутылку для отходов и добавьте отбеливатель до конечной концентрации 10%. Поместите эту бутылку при температуре -80 ° C, прежде чем выбросить ее. В качестве альтернативы можно стерилизовать жидкие отходы и культуру без отбеливателя или спирта путем автоклавирования.

4. Длительное хранение культур боррелий

  1. Приготовление глицеринового сырья культуры боррелий
    1. Возьмите ~ 1,8 мл аликвот экспоненциальных фазовых культур, клеточные концентрации ~ 107-10 8 клеток / мл и добавьте стерильный глицерин до конечной концентрации 10% (концентрации 5-20% работают).
    2. Поместите в криогенные флаконы с завинчивающейся крышкой объемом 2 мл. Хранить при температуре -80 °C.
    3. Храните в морозильной камере не менее 10 тюбиков каждого штамма.
  2. Альтернативный рецепт хранения для получения глицеринового запаса для постоянного хранения
    1. Смешайте 2/3 культуры боррелий с 1/3 15% глицерина в отваре бруцелл . Используйте 2,8 г бульона бруцелл , растворенного в 100 мл ddH2O, который был стерильно отфильтрован (0,22 мкм).
    2. Храните глицериновый запас образцов при температуре от -70 °C до -80 °C.

5. Выделение спирохет из экологических или клинических источников

ПРИМЕЧАНИЕ: Если материал изолируется от людей, животных или источников окружающей среды, необходимо получить исследовательскую этику, уход за животными или экологическую сертификацию, в зависимости от обстоятельств.

  1. Выращивание боррелии от твердых клещей
    1. Соберите взрослых самок, самцов и/или нимфальных клещей.
    2. Поверхность стерилизует все образцы клещей, погружая их в 70% этанол на 2 минуты, и сушит на воздухе в шкафу биологической безопасности. Рассекают по отдельности на несколько частей стерильным скальпелем. Поместите кусочки в пробирку объемом 2 мл, содержащую 1,5 мл среды, дополненной антибиотиками.
    3. Инкубируют культуры при 34 ° C и проверяют наличие спирохет с помощью темнопольной или фазово-контрастной микроскопии два раза в неделю в течение первых 2 недель и еженедельно после этого в течение 6 недель (чаще для RF-спирохет). Субкультура-посев - положительные образцы в 5 мл той же среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязненные культуры могут быть в некоторой степени очищены путем фильтрации с использованием фильтра 0,2 мкм; Для полного устранения загрязнения могут потребоваться антибиотики.
  2. Выращивание боррелий из образцов крови
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец крови должен быть взят квалифицированным медицинским, ветеринарным или исследовательским специалистом, в зависимости от источника материала. Между пробами должно пройти менее 24 ч при ЛТ
    Удаление и прибытие в лабораторию.
    1. Получить 10 мл крови, собранной в стеклянные пробирки для сбора крови с цитратной декстрозой кислоты (ACD; «желтая вершина») в качестве антикоагулянта. Оставить при комнатной температуре. Рекомендуется, чтобы между сбором крови и инокуляцией прошло менее 24 часов.
    2. Центрифугируют кровь с антикоагулянтом в течение 10 мин при 200-400 х г для отделения плазмы от клеток крови.
    3. Аккуратно удалите плазму из пробирки и инокулируйте 1 мл плазмы в 5 мл предварительно нагретой полной среды МКП. МКП можно дополнить антибиотиками. Инкубируйте культуры при 33 ° C с ежедневным визуальным осмотром и еженедельной темнопольной или фазово-контрастной микроскопией до тех пор, пока не будет замечен рост боррелии (чаще для RF Borrelia), что может занять до 9 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании больших или меньших объемов инокуляции поддерживайте соотношение инокулянта и среднего 1:5. Используйте сыворотку или плазму, а не цельную кровь.
  3. Выращивание боррелий из биопсии кожи
    1. Поверхность стерилизуют биопсией кожи (в идеале кубиком размером 3 мм х 3 мм х 3 мм, т.е. 70% этанолом и перекисью водорода). Поместите образец биопсии в физиологический раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец биопсии должен быть взят квалифицированным медицинским, ветеринарным или исследовательским специалистом, в зависимости от источника материала. Между взятием образца и прибытием в лабораторию должно пройти менее 24 часов при ЛТ.
    2. Нарежьте образец кубиками на два-шесть более мелких кусочков с помощью стерильного бритвенного лезвия в стерильной стеклянной чашке Петри, погруженной в физиологический раствор. Перенесите все образцы и ~ 1 мл физиологического раствора, в котором хранилась биопсия кожи, в 5 мл предварительно подогретой среды, дополненной антибиотиками, и инкубируйте при 33 ° C.
    3. В случае чрезмерного роста загрязняющих бактерий добавьте антибиотики, как описано на этапе 1.1.10 выше, или добавив две таблетки сульфаметоксазола (23,75 мг; конечная концентрация 5 мг/мл) + триметоприм (1,25 мг; 0,25 мг/мл) или бактрим (минимальная ингибирующая концентрация >128 мкг/мл), две таблетки амикацина (2 х 30 мкг; конечная концентрация 12 мкг/мл), и две таблетки фосфомицина (2 х 200 мкг; конечная концентрация 80 мкг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех случаях обязательно оставайтесь ниже минимальной ингибирующей концентрации этого антибиотика для видов Borrelia, для которых проводится культивирование41,42,43.
    4. Если культура положительна на боррелии , храните культуру еще 3-4 дня или до тех пор, пока количество боррелий не достигнет 10+ спирохет в поле микроскопа с использованием 40-кратного объектива. Создайте запас глицерина для постоянного хранения.

6. Выделение моноклональных популяций B. burgdorferi sensu lato spirochetes и B. miyamotoi из жидких культур методом культивирования на твердых средах

  1. Для изготовления тарелок разогрейте 300 мл 1,5X полной среды MKP (без желатина). Кроме того, нагрейте 200 мл 1,7% агарозы (автоклавной в деионизированной воде, хранящейся в RT и разогретой в микроволновой печи перед использованием) до 55 ° C. Смешайте обе жидкости.
  2. Налейте пипеткой 15 мл этой смеси в каждую из 16 глубоких чашек Петри, чтобы сделать нижний слой агара.
  3. Остаток среды выдержать при температуре 55 °C на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Боррелии смешиваются с верхним слоем агарозы.
  4. Сначала количественно определяют плотность культуры боррелий с помощью гемоцитометра и разбавляют до желаемой плотности в жидкой среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 500, 200, 100 и 50 спирохет на тарелку работают хорошо.
  5. После того, как нижние пластины затвердеют, добавьте 10 мл оставшейся агарозной смеси в пробирку объемом 15 мл, содержащую соответствующее количество спирохет.
  6. Вылейте суспензию на дно агарозы в маркированной чашке Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку спирохеты Borrelia чувствительны к высокой температуре, следует позаботиться о том, чтобы бактерии не подвергались воздействию 55 ° C в течение длительного периода времени; Залейте верхний агар сразу после добавления его к бактериальным клеткам в среде.
  7. После того, как пластины полностью затвердеют, закройте чашки Петри и поставьте их вверх дном при температуре 34-35 °C в 2,5% CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии появятся через 1 неделю после покрытия, если процедура пройдет успешно.
  8. Чтобы просеять и расширить отдельные колонии, выберите отдельные колонии из планшетов и поместите их в 1,5 мл модифицированного жидкого MKP или другой подходящей среды в стерильных культуральных пробирках объемом 2 мл.
  9. Инкубируют культуры при 34 ° C и исследуют спирохеты с помощью темнопольной или фазовой микроскопии. Используйте эти культуры для анализа или запасов, сделанных так, как описано выше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Питательные среды для боррелий BSK и MKP, а также варианты, представляют собой богатые питательные среды с ингредиентами, которые необходимо готовить и стерилизовать последовательно. При правильном приготовлении среда BSK должна быть красно-оранжевой и прозрачной (рис. 1). Мутность и осадки, сохраняющиеся после нагревания, указывают на проблемные ингредиенты, среднюю выработку или загрязнение; От такой среды лучше отказаться. Если желатин добавить в BSK и с MKP, среда будет желатиновой при охлаждении; При нагревании он будет жидким, хотя и слегка вязким.

Рост чистых культур боррелий не изменит помутнение среды. Однако рост бактериальных культур, боррелий, а также загрязняющих веществ изменит цвет среды в результате показателя рН. Чрезмерный рост другими бактериями приведет к помутнению и слипанию материалов (рис. 2).

Рост культуры можно контролировать с помощью фазово-контрастной или темнопольной микроскопии (рис. 3 и рис. 4). Клетки боррелий в экспоненциальной фазе, как правило, тонкие и изогнутые, и в некоторой степени подвижны. По мере того, как культуры переходят в стационарную фазу, круглые тела становятся все более очевидными (рис. 5). Клинические изоляты или изоляты окружающей среды часто содержат несколько штаммов и/или видов боррелий . Чтобы выделить чистые клоны, жидкие культуры могут быть покрыты для выделения моноклональных колоний (рис. 6); Иногда может потребоваться несколько раундов изоляции колонии.

Figure 1
Рисунок 1: Среда БСК и МКП . (А) БСК (с антибиотиками) с чистой культурой Borrelia burgdorferi. С B. burgdorferi или без него среда остается без видимой мутности и имеет оранжево-янтарный цвет (цвет незначительно варьируется в зависимости от ингредиентов). (Б) МКП средний, неинокулированный, оттаивающий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Загрязненная среда BSK и MKP с чрезмерным ростом конкурирующих бактерий. Среда обесцвечивается, мутнеет, и со временем конкурирующие бактерии погибают и выпадают в осадок на дно пробирки. (А) Заросшая труба БСК. (B) Старая трубка BSK с осажденными загрязняющими бактериями. (C) Пробирка МКП с (слева) и без (посередине) культуры и загрязненной культуры (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Использование гемоцитометра для мониторинга роста боррелий . Штамм B31 Borrelia burgdorferi (подмножество, обозначенное стрелками), наблюдаемый на гемоцитометре (одна линия маленькой сетки обозначена наконечником стрелки) при 200-кратном фазовом контрасте. Это увеличение и процесс позволяют контролировать культуры и оценивать плотность клеток. Масштабная линейка 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Изображение Borrelia burgdorferi в темном поле. Темное изображение штамма Borrelia burgdorferi SCW-53 при высокой плотности в экспоненциальной фазе после 5-7 дней культивирования в среде MKP (400-кратное увеличение). Масштабная линейка составляет 20 мкм. Этот штамм был выделен из твердого клеща Ixodes affinis, собранного в Южной Каролине, США. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Боррелии в старых культурах. По мере того, как клетки боррелий переходят в стационарную фазу в старых культурах, формы круглого тела все чаще заменяют спирохетальную форму. Это могут быть спящие формы или мертвые клетки. Левая панель, морилка Дитерле; средняя панель, иммуногистохимическое окрашивание; и правая панель, флуоресцентная гибридизация in situ культуры Borrelia (предположительно B. burgdorferi на основании происхождения, но вид и штамм не были молекулярно идентифицированы), инокулированной собачьей мочой. Сбор данных, показанных на рисунке 5, был одобрен Комитетом по уходу за животными Университета Эллисона, номер одобрения 16-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato. Колонии спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato выращивали на твердой среде с целью выделения чистых клональных популяций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Лабораторная культура бактерий является плацдармом для исследований. Глубокое преимущество, обеспечиваемое способностью культивировать, иллюстрируется борьбой, которая на протяжении более чем столетия завершилась лишь недавним успехом, за культивирование бледной трепонемы, спирохеты, которая является этиологическим агентом сифилиса44. Спирохеты Borrelia также сложно культивировать, но возможнокультивирование 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

Клетки боррелий привередливы, и каждый вид, штамм и даже изолят различаются как генетически, так и благодаря адаптации к хозяину, от которого они были выделены 51,52,53,54,55. При изготовлении среды использование соответствующих ингредиентов имеет огромное значение для жизнеспособности культуры боррелий или даже жизнеспособности культуры. Использование свежеприготовленной, высокообогащенной и правильно хранящейся среды имеет важное значение для стимулирования роста бактерий и является устоявшимся требованием для роста бактерий. Для боррелии для хорошего роста требуется поддержание анаэробных или микроаэробных условий. Этого можно добиться проще всего, заполнив трубки доверху, чтобы в трубке практически не оставалось воздуха, и выращивая культуры без перемешивания; Более строгий контроль кислорода и углекислого газа может потребоваться для экспрессии генов и связанных с ними исследований 26,27,28,29,30. Добавление антибиотиков в бактериальную питательную среду может показаться нелогичным; использование низких доз антибиотиков в среде Borrelia должно препятствовать росту быстрорастущих бактерий. Если культура инокулирована чистым изолятом боррелий, добавление антибиотиков не нужно; Тем не менее, использование добавленных антибиотиков имеет важное значение для предотвращения чрезмерного роста конкурирующих бактерий при инокуляции клинических образцов или образцов окружающей среды. Среда BSK также может быть дополнена 3-7% желатином. Это необходимо для роста21 вида боррелий RF. Использование BSK или MKP для роста видов Borrelia burgdorferi sensu lato зависит от источника изолята. Обе среды поддерживают рост устоявшихся культур, но было обнаружено, что MKP лучше работает при посеве новых культур с низким количеством клеток боррелий, например, с клиническими или экологическими изолятами23,24. Эта среда также позволяет культивировать B. miyamotoi56,57,58. В конечном счете, в науке о выращивании привередливых микробов есть элемент искусства, но это возможно с осторожностью и настойчивостью.

Культура боррелий лежит в основе достижений в биомедицинских исследованиях. Культура боррелий позволила определить полный геном и протеом многих видов боррелий, что позволило исследователям начать разгадывать эволюцию и биологию этих спирохет54,58,59. Аналогичным образом, доступ к чистым культурам боррелий позволяет понять многие сложные взаимодействия боррелий с млекопитающими-хозяином и членистоногими переносчиками 61,62,63,64,65, включая взаимодействия с иммунной системой хозяина11,65, позволяет вывести механизмы передачи 29,66и предоставляет ключевой исследовательский инструмент для отличия культивируемых, следовательно, обязательно живых, клеток от клеточного мусора, различие, которое имеет решающее значение для раскрытия механизмов патогенеза, а также эффективных схем лечения 8,67,68,69,70,71. В то время как культура боррелий in vitro может занять несколько недель, прежде чем спирохеты станут достаточно обильными для обнаружения, ограничивая клинические диагностические приложения, фундаментальное понимание биологии боррелий, геномики, взаимодействия хозяина и патогена и многих других применений опиралось на способность выделять чистые боррелии культуры из изолятов окружающей среды и амплификация этих изолятов с помощью культуры для получения достаточного материала для биохимического и генетического анализа. Общество стремится к быстрому реагированию на инфекции для поддержки быстрой диагностики и лечения. Другим компонентом этой потребности, однако, являются биомедицинские и биологические исследования, необходимые для прочного фундамента, на котором можно надлежащим образом и успешно лечить и предотвращать болезни. Несмотря на сложную задачу, культивирование спирохет Borrelia in vitro возможно и может удовлетворить эти потребности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

О конфликте интересов не было заявлено.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады и Канадским фондом болезни Лайма (AB и VL), Шведским исследовательским советом (SB, M-LF и IN), ПРОЕКТОМ TAČR GAMA 2 - «Поддержка верификации потенциала применения 2.0 в Биологическом центре CAS» (TP01010022) (MG и NR), а также грантом Министерства здравоохранения Чешской Республики NV19-05-00191 (MG и NR). Мы благодарим S. Vranjes (2021, лаборатория Руденко) за изображение на рисунке 4 и J. Thomas-Ebbett (2021, лаборатория Ллойда) за изображения на рисунке 5. Мы благодарим всех исследователей, которые внесли свой вклад в эту область, и приносим извинения тем, чьи работы мы не смогли процитировать из-за нехватки места.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia. , Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022).
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W. Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey,, Whitman, W. B. , John Wiley & Sons. 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc. , Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016).
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 189
Методы культивирования спирохет из комплекса <em>Borrelia burgdorferi</em> Sensu Lato и <em>боррелии</em> возвратного тифа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berthold, A., Faucillion, M. L.,… More

Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter