Summary
시험관 내 배양은 살아있는 박테리아의 존재에 대한 직접적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 Borrelia burgdorferi sensu lato complex, 재발 열 Borrelia 종 및 Borrelia miyamotoi를 포함하여 다양한 Borrelia spirochetes의 배양 방법을 설명합니다. 이 종은 까다 롭고 느리게 자라지 만 배양 할 수 있습니다.
Abstract
Borrelia는 B. burgdorferi sensu lato (sl)라고도 알려진 라임 보렐리 아증 (LB) 그룹의 세 그룹으로 구성되며 최근에는 Borreliella, 재발 열 (RF) 그룹 Borrelia 및 세 번째 파충류 관련 스피로 체타 그룹으로 재 분류되었습니다. 배양 기반 방법은 체액 또는 조직에서 병원체를 배양하여 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를 위한 소스 자료를 제공하기 때문에 연구 및 임상 작업 모두에서 실험실 박테리아 감염 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. Borrelia와 Borreliella spirochetes는 까다롭고 느리게 자라기 때문에 일반적으로 임상 목적으로 배양되지 않습니다. 그러나 연구에는 문화가 필요합니다. 이 프로토콜은 B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis 및 RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis 및 B. miyamotoi. LB 및 RF 스피로헤타를 성장시키기 위한 기본 배지는 Barbour-Stoenner-Kelly(BSK-II 또는 BSK-H) 배지로, 기존 배양에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원합니다. 접종물에서 초기 스피로헤타 수가 적은 진드기 또는 숙주 유래 샘플에서 새로 분리된 Borrelia 분리물을 성장시킬 수 있으려면 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지가 선호됩니다. 이 배지는 또한 B. miyamotoi 의 성장을 지원합니다.RF 스피로헤타 재배의 성공 여부는 성분의 품질에 크게 좌우됩니다.
Introduction
Borrelia는 라임 보렐리오스(LB) 그룹, 재발열(RF) 그룹 및 파충류에 국한된 것처럼 보이는 덜 잘 특성화된 그룹의 세 가지 주요 분기군을 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. Borrelia 분류학은 대부분의 다른 분류학적 그룹 1,2,3,4,5,6,7과 마찬가지로 게놈과 프로테옴 비교를 허용하는 분자 방법론의 출현과 함께 유동적입니다. LB 그룹(라임병 그룹이라고도 함)은 전통적으로 가장 특징적인 구성원인 Borrelia burgdorferi sensu stricto의 이름을 따서 Borrelia burgdorferi sensu lato라고 불렸습니다. 이 논문은 현재 가장 널리 사용되는 용어인 LB, RF 및 파충류 관련 그룹을 사용하고 LB 및 RF 그룹에 대한 배양 프로토콜을 설명합니다.
Spirochaetaceae 계통의 구성원에게 예상되는 바와 같이 Borrelia는 일반적으로 길이 20-30 μm, 너비 0.2-0.3 μm의 독특하고 길고 얇은 나선형 모양을 채택 할 수 있습니다. 그러나 Borrelia 세포는 매우 다형성이며 복잡한 세포 및 유전 구조의 결과로 배양 및 생체 내 1,8 모두에서 다른 많은 모양을 채택할 수 있습니다. 스피로헤탈 형태에서 평면 사인파 형태는 내막과 외막 사이의 주변세포질 공간에서 회전하는 축 방향 내편모충의 결과입니다. 이 구조는 세포가 숙주 조직과 상호 작용할 수 있도록 하는 단백질을 포함하는 외막과 함께 세포가 매우 운동성을 가질 수 있도록 합니다 9,10. 외막 단백질의 발현은 엄격하게 조절되며 숙주 조직 침습뿐만 아니라 숙주 면역계와의 상호 작용에도 영향을 미친다11. 이 복잡한 유전자 발현은 Borrelia 세포가 척추동물 숙주와 무척추동물 벡터의 매우 다른 환경 사이를 왕복할 수 있도록 합니다. Borrelia의 게놈은 원형 염색체가 아닌 선형 염색체로 구성된 원핵 생물 중에서 드뭅니다. 선형 염색체 외에도 Borrelia 종에는 7-21 개의 플라스미드가 포함되어 있으며 일부는 선형이고 일부는 원형입니다. 플라스미드는 숙주 적응 및 독성에 필요한 대부분의 유전자를 보유하고 있으며, 프로파지에서 유래한 원형 플라스미드는 스피로헤탈 세포 사이의 수평 유전자 흐름의 대부분을 담당하는 것으로 생각됩니다12,13. 숙주 적응에서의 역할과 일관되게, 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis) 그룹의 일부, 아마도 많은 구성원 또는 전부가 배양에서 플라스미드를 잃는다14. 가장 잘 연구된 B. burgdorferi, B31의 "실험실 적응" 균주는 이 종의 야생 분리주에서 발견되는 9개의 플라스미드 중 7개만 가지고 있다15. 유사하게, B. garinii는 배양물16에서 플라스미드를 잃는다. 일부 연구에서는 RF종과 B. miyamotoi가 배양 시 플라스미드를 보유하는 것으로 나타났으나 14,17, 최근 연구에서는 장기간 체외 배양을 통해 플라스미드와 감염성이 변화된 것으로 나타났다18.
배양 기반 방법은 연구 및 임상 작업 모두에서 박테리아 감염의 실험실 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다14,17. 체액 또는 조직에서 병원체의 배양은 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를위한 소스 자료를 제공합니다14,17. 이 프로토콜은 LB 그룹과 RF Borrelia 및 B. miyamotoi의 스피로헤타를 성공적으로 배양하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. Borrelia spirochetes를 재배하기 위한 기본 배지는 오염된 원핵생물의 성장을 줄이기 위해 항생제를 사용하거나 사용하지 않는 Barbour-Stoenner-Kelly 배지(BSK-II 또는 상업적으로 이용 가능한 BSK-H)입니다. 이 매체는 원래 RF Borrelia19를 지원하는 데 사용된 매체에서 채택되었으며 Stoenner20과 Barbour21에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로 많은 변형이 개발되었으며, 각각은 성장, 감염성 및 병원성에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 생리학에 영향을 미친다22. 이 배지는 확립된 배양균에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원하며, 진드기, 포유류, 임상 검체에서 스피로헤타를 분리하는 데 사용되어 왔다23. 보다 최근에 개발된 변형인 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지는 배양에 사용할 수 있는 샘플에 존재하는 스피로헤타의 수가23,24개 낮을 때 환경 샘플에서 새로운 Borrelia 분리주를 분리할 때 더 나은 분리 성공, 형태 및 운동성을 제공할 수 있습니다. 모든 경우에 재배의 성공 여부는 신선하게 준비된 배지와 적절한 재료의 사용에 크게 좌우됩니다. 모든 상업용 성분이 고품질 매체를 생산하는 것은 아닙니다. 접종된 배양물은 소량의 잔류 주변 산소의 존재 하에 통상적인 32-34°C 인큐베이터에서 진탕 없이 편리하게 인큐베이션될 수 있다. Borrelia spirochetes는 혐기성 세균이지만 본질적으로 산소 및 이산화탄소 농도의 변동에 노출되며 유전자 발현의 변화에 반응합니다26,27,28,29. 따라서 유전자 발현, 성장 및 기타 대사 연구는 산소 제어 인큐베이터 또는 혐기성 챔버를 사용하여 산소 및 이산화탄소 수준을 제어해야 합니다. 배양에서 배양은 암시야 현미경 또는 위상차 현미경을 사용하여 스피로헤타의 존재 여부를 매주 또는 더 자주 확인합니다. 배양 도말은 은 염색, 면역조직화학, 또는 형광 태그가 부착된 균주29,30을 사용하여 염색할 수 있습니다. PCR 후 DNA 시퀀싱은 Borrelia 종30,31,32,33을 검출하고 유전적으로 식별하거나 확인하는 민감하고 특이적인 방법입니다.
BSK-II에는 많은 사소한 변형이 존재하며 일부는 상업적으로 이용 가능합니다. 섹션 1에서 여기에 설명된 프로토콜은 Barbour(1984)21에서 채택되었습니다. 액체 MKP 배지는 보다 최근에 개발된 배지이며 섹션 2에 설명되어 있습니다. 이전에보고 된 프로토콜33,34에 따라 제조되며, BSK 배지와 유사하게 기본 배지 준비 및 완전 배지 준비의 두 단계로 구성됩니다. Borrelia 배양 배지는 섹션 3에 설명된 바와 같이 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있습니다. 항생제는 섹션 4에 설명된 대로 임상 또는 환경 샘플을 접종할 때 유입되는 오염 박테리아를 줄이는 역할을 합니다. 순수한 Borrelia sp. 배양액으로 접종하는 경우 항생제가 필요하지 않을 수 있습니다. 장기 Borrelia 주식을 만드는 것은 종종 중요하며 이를 위한 프로토콜은 섹션 5에 설명되어 있습니다. 섹션 6은 이러한 배지를 사용하여 임상 또는 환경 샘플에서 순수한 Borrelia sensu lato 클론을 분리하는 방법을 설명합니다. 가능한 여러 가지 접근법이 있습니다36; 아래는 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 사용된 도금 매체는 BSK-II 도금 매체37 및 MKP 배지 34(토끼 혈청이 10%38로 증가)의 변형입니다.
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Protocol
인간 피험자로부터 얻은 샘플과 관련된 모든 연구는 관련 대학 및/또는 의료 시설의 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며 샘플을 수집하기 전에 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 동물에서 채취한 샘플과 관련된 모든 연구는 기관 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 해당되는 경우 환경 샘플링에 대한 승인을 받았습니다.
참고: 문화의 성공은 재료의 품질에 크게 좌우됩니다. 상업용 BSK 배지를 사용할 수 있으며 실험실에서 적응한 순수 B. burgdorferi 및 고용량 접종물을 사용하여 배양물을 파종할 수 있는 관련 종의 성장을 강력하게 지원합니다. 1차 생물학적 물질로부터 균주를 분리하는 경우, 새로 준비된 배지가 선호되며 종종 필요합니다.
Borrelia sp. 알려진 또는 의심되는 병원체이며 선별되지 않은 인간 또는 동물 조직도 생물학적 위험이 될 수 있습니다. 감염 가능성이 있는 물질을 취급하려면 조사자의 안전을 위해 개인 보호 장비와 멸균 기술이 필요합니다. 또한 배지는 영양이 풍부하여 배양물이 쉽게 오염됩니다. 이 작업에는 일반적으로 생물 안전 레벨 2 봉쇄가 필요하며 Borrelia sp. 또는 샘플은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.
1. BSK-II 매체 제작 지침
- 완전한 BSK-II 배지의 제조
- 표 1과 같이 1 L의 배지를 준비하여 시약을 얻었다.
참고: BSA 순도(또는 순도 부족)는 최적의 성장에 매우 중요합니다. 특히, BSA 순도는 제조업체와 로트에 따라 다릅니다. 더 많은 제품과 덜 성공적인 제품 목록을 보려면 표 2 를 참조하십시오. 서로 다른 공급업체로부터 여러 샘플을 채취하여 최적의 성장을 위해 테스트한 다음 가장 좋은 로트를 대량으로 구매하는 것이 이 문제를 완화하고 좋은 매체를 생산하는 효과적인 전략입니다. - 물을 저어 비커에 BSA를 녹이는 것으로 시작하면 최소 30분이 소요됩니다.
- 모든 건조 화학 물질을 첨가하고 용해시킵니다. 그런 다음 CMRL을 추가합니다.
- 필요한 경우 1M NaOH를 사용하여 BSK-II 배지의 pH를 7.6으로 조정합니다.
- 토끼 혈청을 BSK-II 배지에 6%-10%의 농도로 첨가합니다. 필터는 BSK-II 배지(0.22μm 공극 크기)를 살균합니다. 필요한 혈청의 양은 Borrelia 종에 따라 다릅니다. RF 종 및 균주에 대해 6%-7%를 사용하고 Borrelia burgdorferi sensu lato에 사용합니다. 성장이 강하지 않으면 배지에 1 % -2 % 멸균 토끼 혈청을 더 첨가하십시오.
- BSK-II 배지의 스톡을 100mL 또는 400mL 분취량으로 동결합니다.
- RF 균주의 경우 젤라틴이 필요합니다. 100mL의 7% 멸균 젤라틴(용액에 넣기 위해 약간 따뜻하게 함)을 400mL BSK-II 배지에 넣습니다. 배양물을 접종하기 전에 젤라틴을 녹이기 위해 37°C에서 젤라틴으로 BSK-II를 데우십시오.
참고: 배지는 필터 멸균 및 토끼 혈청 및 젤라틴(RF 스피로헤타용) 또는 필터 멸균 및 혈청(및 젤라틴) 첨가 후 동결(-20°C)할 수 있습니다. 매체는 장시간 동결 될 때 안정적입니다. 냉장고에 보관할 경우 1개월 이내에 사용하십시오. RF 종은 일반적으로 1주일 이상 되지 않은 신선한 배지에서 가장 잘 자랍니다. 얼지 않은 경우 탁도에 대해 매체의 품질을 육안으로 검사하십시오. 오염되거나 침전성 성분 또는 기타 의심스러운 것으로 보이는 매체는 폐기하십시오. - 항생제를 배지에 첨가해야 하는 경우 갓 만든 배지 또는 이전에 냉동된 분취량에 첨가하십시오. 후자가 더 유연한 접근 방식입니다. Oliver et al.39에 설명된 대로 항생제 농도를 사용하십시오.
- 배지의 튜브를 해동하는 동안 정밀 저울을 사용하여 멸균(오토클레이브) 1.7mL 튜브 또는 멸균 15mL 원추형 튜브에 항생제의 무게를 잰다. 다음과 같이 저장 용액을 준비하십시오 : 25 mg의 amphotericin B를 10 mL의 DMSO에, 20 mg의 포스 포 마이신을 1 mL의 오토 클레이브 증류수에 용해시키고, 50 mg의 리팜피신을 1 mL의 DMSO에 용해시킨다.
- 항생제를 필터로 멸균(0.2μm 주사기 필터)하고 적절한 크기의 새 튜브에 옮깁니다.
- 항생제를 배지의 1:1000 비율로 희석하여 최종 농도에 도달합니다. BSK 500mL의 경우 암포테리신 B 원액 0.5mL(DMSO에서 2.5mg/mL), 포스포마이신 원액 0.5mL(멸균 H 2O에서20mg/mL) 및 리팜피신(미국: 리팜핀) 원액(DMSO에서 50mg/mL).
- 항생제가 보충된 배지 또는 분취액을 사용하고 -20°C에서 동결합니다.
- 표 1과 같이 1 L의 배지를 준비하여 시약을 얻었다.
| 성분 | 금액(/L) |
| BSA 분획 V | 50 그램 |
| CMRL-1066 (10배) | 100 밀리리터 |
| 네오펩톤 | 5 그램 |
| 헤페스 | 6 그램 |
| 구연산 트리 소듐 염 이수화 물 | 0.7 그램 |
| 포도당 | 5 그램 |
| TC 효모 | 2 그램 |
| 피루브산(Na 염) | 0.8 그램 |
| N-아세틸-D-글루코세아민 | 0.4 그램 |
| 중탄산 나트륨 | 2.2 그램 |
| 물(고순도) | 900 밀리리터 |
표 1: BSK-II 배지 1L의 조성.
| 근원 | 적당 |
| Serva GmbH, 하이델베르크, 독일 | 예 |
| Proliant Biologicals, Boone IA, 미국 | 예 |
| Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스 | 아니요 |
표 2: BSA의 출처 및 BSK-II 배지에 대한 적합성.
2. MKP 제작 지침
- 염기성 배지의 제조
- 완전히 용해될 때까지 교반하여 표 3에 나열된 모든 분말 성분을 아래 표 4에 조심스럽게 칭량하고 용해합니다.2O(약 750mL) 완전히 용해될 때까지 교반하여 ~1시간이 걸립니다.
- 용해 완료 후 NaOH로 pH를 7.6, 부피를 1000 mL로 조절한 후 여과(0.22μm 필터)로 살균한다.
참고: 기본 배지는 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
- MKP 완전배지의 제조
- 표 4에 열거된 모든 성분을 멸균 방식으로 혼합하고; 고압 증기 멸균으로 젤라틴을 살균하고 멸균 방식으로 취급하십시오. 멸균 생물학적 안전 캐비닛에서 작업하고 멸균 여과 혈청을 사용하십시오.
- 분취량 MKP를 50mL 튜브에 담습니다. 작은 분취량 하나를 33°C에서 며칠 동안 보관한 다음 암시야 현미경으로 오염이 없는지 확인합니다.
알림: MKP 완전 배지를 +4°C에서 1개월 이상 보관하지 말고 얼리지 마십시오. 완전한 배지는 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하여 추가로 멸균할 수 있습니다.
| 성분 | 금액(/L) |
| CMRL-1066 (글루타민 없이 10배) | 100mL(액체인 경우)/분말인 경우 9.7g/L |
| 네오펩톤 | 3 그램 |
| 헤페스 | 6 그램 |
| 구연산 | 0.7 그램 |
| 포도당 | 3 그램 |
| 피루브산 | 0.8 그램 |
| N-아세틸글루코세아민 | 0.4 그램 |
| 중탄산 나트륨 | 2 그램 |
표 3: 염기성 MKP(Modified Kelly-Pettenkofer) 배지 1L의 조성.
| 성분 | 양(mL) |
| 기본 매체 | 500 |
| 7 % 젤라틴 (H2O) (갓 고압 증기 멸균되었지만 뜨겁지 않음) | 100 |
| 토끼 혈청 | 36 |
| BSA 35% | 17.5 |
표 4: MKP(Modified Kelly-Pettenkofer) 완전 배지의 조성.
3. 항생제 유무에 관계없이 보렐리아의 문화
- 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 작업 조건에서 모든 실험 단계를 수행합니다. 70% 에탄올로 표면과 모든 물질을 소독하고 즉시 생물학적 안전 캐비닛으로 옮깁니다. UV는 작업 시작 전에 생물학적 안전 캐비닛의 모든 비생물학적 물질을 5분 동안 살균합니다.
- 가능한 한 가장 신선한 매체를 사용하십시오.
- 배양을 시작하려면 배양기에서 배지(33°C - 37°C)를 예열합니다. 필요한 경우 흔들어 주십시오.
알림: 매체의 부피에 따라 이 단계는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. - 이전에 -80°C에서 보관하고 액체가 되는 즉시 실온(RT)에서 해동한 글리세롤 또는 이와 유사한 스톡에서 해동된 보 렐리아 배양액 ~1mL를 예열된 BSK 배지 5-15mL에 추가합니다. 스크류 캡이 있는 시중에서 판매되는 유리 또는 플라스틱 바이알을 사용하여 배양액을 소량(BSK 5-15mL)에 접종합니다. 미세 또는 혐기성 분위기를 만들기 위해 튜브를 거의 가득 채웁니다. 튜브를 단단히 닫으십시오. 이러한 방식으로 배양하면CO2 가 필요하지 않습니다.
- RF 종(및 B. 페르시카)을 교반 또는 교반 없이 인큐베이터에서 37°C에서 성장시킨다. B. burgdorferi sensu lato 종을 33-34 °C에서 재배합니다.
- 200x-400x 배율에서 위상차 또는 암시야 현미경을 사용하여 Borrelia 배양의 성장을 모니터링합니다(그림 3). 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 배양물을 혈청학적 피펫으로 혼합하거나 위아래로 피펫팅하면서 3mL 이송 피펫으로 더 혼합하십시오.
참고: Borrelia 는 더 높은 배율(200X-400X)에서 가장 잘 보이지만 혈구계40에서 200X 배율에서 가장 잘 셀 수 있습니다. Borrelia 의 움직임과 형태는 이러한 박테리아의 존재를 나타냅니다. - 박테리아 성장을 정량화하려면 혈구계의 양쪽에 있는 면적을 계수하는 16개 필드 그리드 패턴에서 여러(10) 개의 개별 작은 사각형을 계산하고 평균을 계산합니다. 작은 제곱당 평균 세포 수와 mL당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 혈구계에 적합한 변환 계수를 곱합니다.
- 1-2 일 간격으로 박테리아 성장을 모니터링하십시오. 보렐리아 의 기하급수적 성장은 생존율 및 세포 밀도에 따라 달라지며 34°C에서 1주일 이상 걸릴 수 있습니다. 지수 상 배양을 1:2 또는 1:4의 비율로 희석하여 1.7mL 튜브에 배지를 넣고 혈구계에 로딩합니다. 세포 수를 결정할 때 희석 계수에 대한 적절한 고려를 포함하십시오. 사용 후에는 희석된 표백제(10%) 및/또는 70% 에탄올로 표면과 혈구계를 분무하십시오.
참고: Borrelia 는 세포 농도가 1-5 x 107 cells/mL일 때 기하급수적으로 성장합니다. 이 범위 내에서 세포가 잘 자랍니다. - 배양 기간이 연장되면 영양소가 고갈되고 배지 pH가 변경되므로 계대배양이 필요합니다. 생물학적 안전 캐비닛의 무균 조건에서 배양 부피의 1/10을 새 튜브에 옮기고 새 배지(이전 계대를 성장시키는 데 사용된 것과 동일한 배지의 신선한 분취량)로 채웁니다. 1:10 희석이 최적입니다. 배양량을 변경해야 하는 경우 그에 따라 접종량을 조정하고 배양을 계속합니다. 각 매체가 바뀔 때마다 통로 수가 증가합니다.
- DNA를 추출하거나 Borrelia 세포를 분리하기 위해 지수 위상 Borrelia를 4000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다. 상청액을 적절한 생물학적 위험 폐기물에 버리십시오. 펠렛화된 박테리아를 상업용 DNA 추출 키트로 처리하거나 의도한 실험을 위해 적절한 배지에 박테리아를 재현탁합니다.
- 각 조작이 끝나면 장비에 맞게 에탄올 및 UV 방사선으로 모든 장비를 멸균하십시오. 과잉 배양액을 포함한 액체 폐기물을 쓰레기통에 수거하고 표백제를 최종 농도 10%까지 첨가합니다. 폐기하기 전에 이 병을 -80°C에 두십시오. 또는 액체 폐기물을 멸균하고 표백제나 알코올 없이 고압증기멸균으로 배양합니다.
4. Borrelia 문화의 장기 보관
- Borrelia 배양의 글리세롤 스톡의 제조
- ~1.8mL의 지수상 배양액, 세포 농도 ~107-10 8 cells/mL의 분취량을 취하고 멸균 글리세롤을 최종 농도 10%(농도 5%-20% 작업)에 추가합니다.
- 2mL 스크류 캡 극저온 바이알에 넣습니다. -80 °C에서 보관하십시오.
- 냉동실에 각 균주의 튜브를 10개 이상 보관하십시오.
- 영구 보관을 위한 글리세롤 스톡을 생산하기 위한 대체 보관 레시피
- 브루셀라 국물에 보렐리아 배양액의 2/3와 15% 글리세롤의 1/3을 섞습니다. 100 mL의ddH2O에 용해된 2.8 g의 브루셀라 액체배지를 사용하고, 멸균여과(0.22 μm)하였다.
- 샘플의 글리세롤 스톡을 -70°C 내지 -80°C에서 유지한다.
5. 환경 또는 임상 소스에서 스피로헤타의 분리
참고: 인간, 동물 또는 환경적 출처에서 재료를 분리하는 경우 적절한 경우 연구 윤리, 동물 관리 또는 생태학적 인증을 받아야 합니다.
- 딱딱한 진드기에서 Borrelia 의 재배
- 성인 여성, 남성 및/또는 애벌레 진드기를 수집합니다.
- 모든 진드기 샘플을 70 % 에탄올에 2 분 동안 담그고 생물학적 안전 캐비닛에서 자연 건조하여 표면 멸균합니다. 멸균 메스로 개별적으로 여러 조각으로 해부하십시오. 항생제가 보충된 1.5mL의 배지가 들어 있는 2mL 튜브에 조각을 넣습니다.
- 배양물을 34°C에서 배양하고 암시야 또는 위상차 현미경으로 처음 2주 동안 매주 2회, 그 후 6주 동안 매주 스피로체가 있는지 확인합니다(RF 스피로체의 경우 더 자주). 계대 배양 양성 시료를 동일한 배지 5mL에 넣습니다.
참고: 오염된 배양물은 0.2μm 필터를 사용하여 여과하여 어느 정도 정제할 수 있습니다. 오염을 완전히 해결하기 위해 항생제가 필요할 수 있습니다.
- 혈액 샘플에서 Borrelia 재배
알림: 혈액 샘플은 재료의 출처에 따라 자격을 갖춘 의료, 수의사 또는 연구 전문가가 채취해야 합니다. RT에서 24시간 미만이 경과해야 합니다.amp르
제거 및 실험실 도착.- 혈액 10mL를 채취하고, 산성 구연산염 포도당(ACD; "노란색 상단") 항응고제로. 실온에서 두십시오. 채혈과 접종 사이에 24시간 미만이 경과하는 것이 좋습니다.
- 혈액 세포에서 혈장을 분리하기 위해 200-400 x g 에서 10분 동안 항응고제로 혈액을 원심분리합니다.
- 튜브에서 혈장을 부드럽게 제거하고 혈장 1mL를 예열된 MKP 완전 배지 5mL에 접종합니다. MKP는 항생제로 보충 될 수 있습니다. 보렐리알 성장이 감지될 때까지 매일 육안 검사와 매주 암시야 또는 위상차 현미경을 사용하여 33°C에서 배양을 배양하며(RF Borrelia의 경우 더 자주), 최대 9주가 소요될 수 있습니다.
참고: 더 크거나 더 작은 접종량을 사용하는 경우 접종제와 중간의 비율을 1:5로 유지하십시오. 전혈보다는 혈청이나 혈장을 사용하십시오.
- 피부 생검에서 Borrelia 의 재배
- 피부 생검을 표면 멸균합니다(이상적으로는 3mm x 3mm x 3mm 큐브, 즉 70% 에탄올과 과산화수소 사용). 생검 샘플을 생리 식염수에 넣습니다.
알림: 생검 샘플은 재료의 출처에 따라 자격을 갖춘 의료, 수의사 또는 연구 전문가가 채취해야 합니다. RT에서 24시간 미만이 경과해야 합니다.ample 제거와 실험실 도착 사이. - 생리 식염수에 담그는 동안 멸균 유리 페트리 접시에 멸균 면도날을 사용하여 샘플을 2-6개의 작은 조각으로 깍둑썰기합니다. 피부 생검을 보관한 모든 샘플과 생리식염수 ~1mL를 항생제가 보충된 예열 배지 5mL에 옮기고 33°C에서 배양합니다.
- 오염 박테리아가 과도하게 증식하는 경우 위의 1.1.10 단계에서와 같이 항생제를 추가하거나 설파메톡사졸(23.75mg, 최종 농도 5mg/mL) + 트리메토프림(1.25mg, 0.25mg/mL) 또는 박트림(최소 억제 농도>128μg/mL), 아미카신 2정(2 x 30μg, 최종 농도 12μg/mL), 및 포스포마이신 2정(2 x 200μg, 최종 농도 80μg/mL).
참고: 모든 경우에 배양이 시도되고 있는 Borrelia 종에 대한 항생제의 최소 억제 농도 미만으로 유지해야 합니다41,42,43. - 배양액이 Borrelia에 양성인 경우 추가로 3-4일 동안 또는 4X 대물렌즈를 사용하여 현미경 필드에서 Borrelia의 양이 10+ 스피로헤타에 도달할 때까지 배양을 유지합니다. 영구 저장을 위해 글리세롤 스톡을 만듭니다.
- 피부 생검을 표면 멸균합니다(이상적으로는 3mm x 3mm x 3mm 큐브, 즉 70% 에탄올과 과산화수소 사용). 생검 샘플을 생리 식염수에 넣습니다.
6. 고체 배지에서 배양하여 액체 배양에서 B. burgdorferi sensu lato spirochetes 및 B. miyamotoi의 단일 클론 개체군 분리
- 플레이트를 만들기 위해 300mL의 1.5X MKP 완전 배지(젤라틴 제외)를 따뜻하게 합니다. 또한, 200 mL의 1.7% 아가로오스 (탈이온수 중 오토클레이브, RT에서 저장하고, 사용 전에 마이크로웨이브)를 55°C로 보온한다. 두 액체를 섞는다.
- 이 혼합물 15 mL를 각각 16개의 깊은 페트리 접시에 넣어 바닥 한천 오세층을 만든다.
- 나머지 배지를 수조에서 55°C로 유지한다.
참고: Borrelia 는 상단 아가로스 층에 혼합됩니다. - 먼저, 혈구계를 사용하여 Borrelia 배양 밀도를 정량화하고 액체 배지에서 원하는 밀도로 희석합니다.
참고: 플레이트당 500, 200, 100 및 50개의 스피로체가 잘 작동합니다. - 바닥 플레이트가 고형화 된 후, 나머지 아가로스 혼합물 10 mL를 적절한 수의 스피로 체가 들어있는 15 mL 튜브에 첨가한다.
- 라벨이 붙은 페트리 접시의 바닥 아가로스에 현탁액을 붓습니다.
알림: Borrelia spirochetes는 고온에 민감하기 때문에 박테리아가 장기간 55°C에 노출되지 않도록 주의해야 합니다. 배지의 박테리아 세포에 첨가하자마자 상단 한천을 붓습니다. - 플레이트가 완전히 고형화 된 후, 페트리 접시를 닫고 2.5 %CO2에서 34-35 °C에서 거꾸로 놓습니다.
참고: 절차가 성공하면 도금 후 1주일 후에 콜로니가 나타납니다. - 개별 콜로니를 스크리닝하고 확장하려면 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 멸균된 2mL 배양 튜브에 있는 1.5mL의 변형된 액체 MKP 또는 기타 적절한 배지에 넣습니다.
- 배양물을 34°C에서 배양하고 암시야 또는 위상 현미경으로 스피로헤타를 검사합니다. 위에서 설명한 대로 만들어진 분석 또는 주식을 위해 이러한 배양물을 사용하십시오.
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Representative Results
Borrelia 배양 배지 BSK 및 MKP 및 변종은 순차적으로 준비하고 멸균해야 하는 성분이 포함된 풍부한 배양 배지입니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 빨간색-주황색이고 투명해야 합니다(그림 1). 온난화 후에도 지속되는 탁도와 강수량은 문제가있는 성분, 중간 생산 또는 오염을 나타냅니다. 이러한 매체는 폐기하는 것이 가장 좋습니다. 젤라틴이 BSK와 MKP에 첨가되면 냉장 보관시 배지가 젤라틴이됩니다. 온난화하면 약간 점성이 있지만 액체가됩니다.
순수한 Borrelia 문화의 성장은 배지의 탁도를 변화시키지 않습니다. 그러나 박테리아 배양 물, Borrelia 및 오염 물질의 성장은 pH 표시기의 결과로 중간 색상으로 변합니다. 다른 박테리아에 의한 과증식은 탁도와 응집된 물질을 생성합니다(그림 2).
배양 성장은 위상차 또는 암시야 현미경으로 모니터링할 수 있습니다(그림 3 및 그림 4). 지수 단계의 보렐리아 세포는 일반적으로 가늘고 꼬여 있으며 어느 정도 운동성이 있습니다. 배양이 정지 단계로 들어감에 따라 둥근 몸체가 점점 더 분명해집니다(그림 5). 임상적 또는 환경적 분리주에는 종종 여러 Borrelia 균주 및/또는 종이 포함됩니다. 순수 클론을 분리하기 위해 액체 배양을 플레이팅하여 단클론 콜로니를 분리할 수 있습니다(그림 6). 때로는 여러 차례의 콜로니 격리가 필요할 수 있습니다.
그림 1: BSK 및 MKP 배지. (A) Borrelia burgdorferi의 순수 배양물을 사용한 BSK(항생제 포함). B. burgdorferi 배지의 유무에 관계없이 눈에 띄는 탁도가 없으며 주황색-호박색입니다(색상은 성분에 따라 약간 다름). (B) MKP 배지, 접종되지 않은, 해동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 경쟁 박테리아가 과도하게 증식하는 오염된 BSK 및 MKP 배지. 배지는 변색되고 탁하며 시간이 지남에 따라 경쟁 박테리아가 죽어 튜브 바닥에 침전됩니다. (A) 자란 BSK 튜브. (B) 침전된 오염 박테리아가 있는 오래된 BSK 튜브. (C) 배양액이 있는(왼쪽) 및 없는(가운데) MKP 튜브와 오염된 배양물(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 보렐리아 성장을 모니터링하기 위한 혈구계 사용. Borrelia burgdorferi 균주 B31(화살표로 표시된 하위 집합)은 200X 위상차 하에서 혈구계(작은 그리드의 한 줄은 화살촉으로 표시됨)에서 볼 수 있습니다. 이 확대 및 공정을 통해 배양을 모니터링하고 세포 밀도를 추정할 수 있습니다. 스케일 바는 10μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Borrelia burgdorferi의 암시야 이미지. MKP 배지(400X 배율)에서 배양 5-7일 후 지수 단계의 고밀도 Borrelia burgdorferi 균주 SCW-53의 암시야 이미지. 스케일 바는 20μm입니다. 이 균주는 미국 사우스 캐롤라이나에서 수집 된 하드 틱 Ixodes affinis에서 분리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 고대 문화의 보렐리아. Borrelia 세포가 오래된 배양에서 정지 단계로 들어가면서 둥근 몸체 형태가 스피로헤탈 형태를 대체하는 것으로 점점 더 많이 보입니다. 이들은 휴면 형태 또는 죽은 세포 일 수 있습니다. 좌측 패널, 디터(Dieterle) 염색; 중간 패널, 면역 조직 화학 염색; 및 오른쪽 패널, 송곳니 소변을 접종한 Borrelia 배양(기원에 따라 B. burgdorferi로 추정되지만 종과 균주는 분자적으로 확인되지 않음)의 형광 현장 교잡화. 도 5의 데이터 수집은 Mrt. Allison University Animal Care Committee, 승인 번호 16-1에 의해 승인되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: Borrelia burgdorferi sensu lato complex spirochetes. Borrelia burgdorferi sensu lato 복합체의 식민지는 순수한 클론 개체군을 분리하기 위해 고체 배지에서 자랐습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
박테리아의 실험실 배양은 연구의 발판입니다. 배양 능력에 의해 부여되는 심오한 이점은 매독의 병인인 스피로헤타인 Treponema pallidum을 배양하기 위한100년 이상의 투쟁에서 예시됩니다 44. Borrelia spirochetes도 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다 23,24,34,44,45,46,47,48,49.
Borrelia 세포는 까다롭고 각 종과 균주, 심지어 분리도 유전적으로 그리고 그들이 분리된 숙주에 대한 적응을 통해 다릅니다 51,52,53,54,55. 배지를 만들 때 적절한 재료를 사용하면 보렐리아 문화의 활력이나 문화의 생존 가능성에 엄청난 차이가 있습니다. 신선하게 준비되고 고도로 농축되고 적절하게 보관된 배지의 사용은 박테리아 성장을 촉진하는 데 필수적이며 박테리아 성장을 위한 잘 확립된 요구 사항입니다. Borrelia의 경우 좋은 성장을 위해서는 혐기성 또는 미세 호기성 조건을 유지해야합니다. 이것은 튜브를 상단에 채우는 것으로 가장 간단하게 달성할 수 있으므로 튜브에 공기가 거의 또는 전혀 남아 있지 않고 교반 없이 배양물을 성장시킵니다. 유전자 발현 및 관련 연구를 위해 산소 및 이산화탄소의 보다 엄격한 제어가 필요할 수 있다 26,27,28,29,30. 박테리아 배양 배지에 항생제를 첨가하는 것은 직관적이지 않은 것처럼 보일 수 있습니다. Borrelia 배지에서 저용량의 항생제를 사용하는 것은 빠르게 성장하는 박테리아의 성장을 억제하는 것입니다. 배양 물에 순수한 Borrelia 분리 물을 접종하면 항생제를 첨가 할 필요가 없습니다. 그러나 추가 항생제의 사용은 임상 또는 환경 샘플을 접종할 때 경쟁 박테리아의 과증식을 방지하는 데 필수적입니다. BSK 배지는 또한 3%-7% 젤라틴으로 보충될 수 있습니다. 이것은 RF Borrelia 종21의 성장에 필요합니다. Borrelia burgdorferi sensu lato 종의 성장을 위한 BSK 또는 MKP의 사용은 분리주의 출처에 따라 다릅니다. 두 배지 모두 기존 배양균의 성장을 지원하지만, MKP는 임상적 또는 환경적 분리주에서 발생하는 것과 같이 적은 수의 보렐리아 세포로 새로운 배양을 파종할 때 더 나은 성능을 발휘하는 것으로 밝혀졌습니다23,24. 이 배지는 또한 B. miyamotoi56,57,58의 배양을 허용합니다. 궁극적으로, 까다로운 미생물을 키우는 과학에는 예술의 요소가 있지만, 신중하고 끈기 있게 가능합니다.
Borrelia의 문화는 생물 의학 연구의 발전의 기초가됩니다. Borrelia의 문화는 많은 Borrelia 종의 전체 게놈과 프로테옴을 결정할 수 있게 했으며, 이를 통해 연구자들은 이 스피로헤타54,58,59의 진화와 생물학을 풀기 시작할 수 있었습니다. 유사하게, 보렐리아의 순수 배양물에 대한 접근은 숙주 면역계(11,65)와의 상호작용을 포함하여, 포유류 숙주 및 절지동물 벡터(61,62,63,64,65)와 보렐리아의 많은 복잡한 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 전달 메카니즘을 추론할 수 있게 한다 29,66, 배양 가능한, 따라서 필연적으로 살아있는 세포를 세포 파편과 구별하는 핵심 조사 도구를 제공하며, 이는 병인의 메커니즘과 효과적인 치료 요법을 밝히는 데 중요한 구별입니다 8,67,68,69,70,71. 시험관 내 보렐리아 배양은 스피로헤타가 검출에 충분히 풍부해지기까지 몇 주가 걸릴 수 있지만, 임상 진단 적용, 보렐리아 생물학, 유전체학, 숙주-병원체 상호 작용 및 더 많은 응용 분야에 대한 근본적인 이해는 순수한 보렐리아를 분리하는 능력 에 의존했습니다 환경 분리주로부터 배양하고, 배양을 통해 분리된 균주를 증폭시켜 생화학적 및 유전자 분석을 위한 충분한 물질을 생산합니다. 신속한 진단과 치료를 지원하기 위해 감염에 대한 신속한 대응에 대한 사회적 요구가 있습니다. 그러나 이러한 필요성의 또 다른 요소는 질병을 적절하고 성공적으로 치료하고 예방할 수 있는 견고한 토대에 필요한 생물 의학 및 생물학 연구입니다. 도전적이지만 Borrelia spirochetes의 체외 재배가 가능하며 이러한 요구를 지원할 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충은 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회와 캐나다 라임병 재단(AB 및 VL), 스웨덴 연구 위원회(SB, M-LF 및 IN), TAČR GAMA 2 프로젝트 - "생물학 센터 CAS에서 응용 가능성 검증 2.0 지원"(TP01010022)(MG 및 NR) 및 체코 보건부 NV19-05-00191(MG 및 NR)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 4의 이미지에 대해 S. Vranjes(2021, Rudenko lab)에게, 그림 5의 이미지에 대해 J. Thomas-Ebbett(2021, Lloyd lab)에게 감사드립니다. 이 분야에 기여한 모든 연구자들에게 감사드리며, 지면의 제약으로 인해 인용하지 못한 분들께 사과드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL tubes | VWR | 87003-294 | Standard item - any supplier will do |
| 0.2 µm Sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | Standard item - any supplier will do |
| 10 µL barrier pipette tip | Neptune | BT10XLS3 | Standard item - any supplier will do |
| 10 mL Serological pipettes | Celltreat | 229011B | Standard item - any supplier will do |
| 1000 µL barrier pipette tip | Neptune | BT1000.96 | Standard item - any supplier will do |
| 15 mL tube | Celltreat | 188261 | Standard item - any supplier will do |
| 20 µL barrier pipette tip | Neptune | BT20 | Standard item - any supplier will do |
| 20 mL Sterile syringe | BD | 309661 | Standard item - any supplier will do |
| 200 µL barrier pipette tip | Neptune | BT200 | Standard item - any supplier will do |
| 25 mL Screw Cap Culture Tubes | Fisher Scientific | 14-933C | Standard item - any supplier will do |
| 25 mL Serological pipettes | Celltreat | 229025B | Standard item - any supplier will do |
| 3 mL Sterile syringe | BD | 309657 | Standard item - any supplier will do |
| 35% BSA | Sigma | A-7409 | Source is important - see note |
| 5 mL Serological pipettes | Celltreat | 229006B | Standard item - any supplier will do |
| 50 mL tube | Celltreat | 229421 | Standard item - any supplier will do |
| 6.5 ml MKP glass tubes | Schott | Schott Nr. 26 135 115 | Standard item - any supplier will do |
| Amikacine | Sigma | PHR1654 | Standard item - any supplier will do |
| Amphotericin B | Sigma | A9528-100MG | Standard item - any supplier will do |
| Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole | Sigma | PHR1126-1G | Standard item - any supplier will do |
| BBL Brucella broth | BD | 211088 | Standard item - any supplier will do |
| Biosafety Cabinet | Labconco | 302419100 | Standard item - any supplier will do |
| Blood collection tubes (yellow top - ACD) | Fisher Scientific | BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) | Standard item - any supplier will do |
| BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum] | Darlynn biologicals | BB83-500 | Standard item - any supplier will do |
| centrifuge | Eppendorf | model 5430 | Standard item - any supplier will do |
| Citric acid TrisodiumSaltDihydrate | Sigma | C-8532 100 g | Standard item - any supplier will do |
| CMRL | Gibco BRL | 21540 500 mL | Standard item - any supplier will do |
| CMRL-1066 | Gibco | 21-510-018 | Standard item - any supplier will do |
| Cryogenic Tubes (Nalgene) | Fisher Scientific | 5000-0020 | Standard item - any supplier will do |
| Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm | Sigma | P7741 | Standard item - any supplier will do |
| Digital Incubator | VWR | model 1545 | Standard item - any supplier will do |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | Standard item - any supplier will do |
| Filters for filter sterilization | Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane | SCGPU05RE | Standard item - any supplier will do |
| Gelatin | Difco BD | 214340 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | 99449-20 | Standard item - any supplier will do |
| Glucose | Sigma | G-7021 1 kg | Standard item - any supplier will do |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Standard item - any supplier will do |
| Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) | Labwissen | Model 3220 | Standard item - any supplier will do |
| HEPES | Sigma | H-3784 100 g | Standard item - any supplier will do |
| N-acetylglucoseamine | Sigma | A-3286 25 g | Standard item - any supplier will do |
| Neopeptone | Difco BD | 211681 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Neubauer Hematocytometer | Sigma | Z359629 | Standard item - any supplier will do |
| Phase contrast microscope | Leitz | Standard item - any supplier will do | |
| Phosphomycin | Sigma | P5396-1G | Standard item - any supplier will do |
| Phosphomycine | Sigma | P5396 | Standard item - any supplier will do |
| Pipetboy | Integra | Standard item - any supplier will do | |
| Precision Standard Balance | OHAUS | model TS200S | Standard item - any supplier will do |
| Pyruvic acid (Na salt) | Sigma | P-8574 25 g | Standard item - any supplier will do |
| Rabbit Serum | Gibco | 16-120-032 | Source is important |
| Rabbit Serum | Sigma | R-4505 100 mL | Source is important |
| Rifampicin | Sigma | R3501-1G | Standard item - any supplier will do |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-5761 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Sufametaxazole | Sigma | PHR1126 | Standard item - any supplier will do |
| TC Yeastolate | Difco BD | 255752 100 g | Standard item - any supplier will do |
| Transfer Pipettes | VWR | 470225-044 | Standard item - any supplier will do |
| Trimethoprim | Sigma | PHR1056 | Standard item - any supplier will do |
References
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