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Immunology and Infection

बोरेलिया बर्गडॉर्फेरी सेंसु लाटो कॉम्प्लेक्स और रिलैप्सिंग फीवर बोरेलिया से स्पाइरोकेट्स की खेती के तरीके

Published: November 25, 2022 doi: 10.3791/64431
Automatic Translation
*1, *2, 2, 3, 1, 2, 3
1Department of Biology, Mt. Allison University, 2Department of Molecular Biology, Umeå University, 3Biology Centre Czech Academy of Sciences, Institute of Parasitology
* These authors contributed equally

Summary

इन विट्रो कल्चर जीवित बैक्टीरिया की उपस्थिति के लिए एक प्रत्यक्ष पहचान विधि है। यह प्रोटोकॉल विविध बोरेलिया स्पाइरोकेट्स की संस्कृति के तरीकों का वर्णन करता है, जिसमें बोरेलिया बर्गडोर्फरी सेंसु लाटो कॉम्प्लेक्स, रिलैप्सिंग फीवर बोरेलिया प्रजातियां और बोरेलिया मियामोटोई शामिल हैं। ये प्रजातियां तेजी से और धीमी गति से बढ़ रही हैं लेकिन सुसंस्कृत हो सकती हैं।

Abstract

बोरेलिया में प्रजातियों के तीन समूह होते हैं, जो लाइम बोरेलियोसिस (एलबी) समूह के होते हैं, जिन्हें बी बर्गडोरफेरी सेंसु लाटो (एसएल) के रूप में भी जाना जाता है और हाल ही में बोरेलिला, रिलैप्सिंग फीवर (आरएफ) समूह बोरेलिया और स्पाइरोकेट्स के एक तीसरे सरीसृप से जुड़े समूह में पुनर्वर्गीकृत किया गया है। संस्कृति-आधारित विधियां अनुसंधान और नैदानिक कार्य दोनों के लिए जीवाणु संक्रमण की प्रयोगशाला का पता लगाने के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई हैं, क्योंकि शारीरिक तरल पदार्थ या ऊतकों से रोगजनकों की संस्कृति सीधे प्रतिकृति रोगजनकों का पता लगाती है और अनुसंधान के लिए स्रोत सामग्री प्रदान करती है। बोरेलिया और बोरेलिला स्पाइरोकेट्स तेजी से और धीमी गति से बढ़ते हैं, और इस प्रकार आमतौर पर नैदानिक उद्देश्यों के लिए सुसंस्कृत नहीं होते हैं; हालांकि, अनुसंधान के लिए संस्कृति आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल एलबी और आरएफ स्पाइरोकेट्स को सफलतापूर्वक कल्चर करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली और व्यंजनों को प्रदर्शित करता है, जिसमें बी. बर्गडॉर्फरी एसएल कॉम्प्लेक्स की सभी मान्यता प्राप्त प्रजातियां शामिल हैं, जिनमें बी. अफज़ेली, बी. अमेरिकाना, बी. एंडरसनी, बी. बवेरीएन्सिस, बी. बिसेट्टी/बिस्सेटिए, बी. बर्गडॉर्फरी सेंसु स्ट्रिटो (एस.एस.), बी. कैलीफोर्निएन्सिस, बी. कैरोलिनोसिस, बी. चिलेंसिस, बी. बी. लुसिटानिया, बी. मारितिमा, बी. मेयोनी, बी. स्पीलमैनी, बी. तनुकी, बी. टर्डी, बी. सिनिका, बी. वलैसियाना, बी. यांग्त्ज़ेंसिस, और आरएफस्पाइरोकेट्स, बी. एन्सेरिना, बी. कोरियासी, बी. क्रोसिड्यूरे, बी. डटोनी, बी. हर्मी, बी. हिस्पैनिका, बी. पर्सिका, बी. एलबी और आरएफ स्पाइरोकेट्स को उगाने के लिए मूल माध्यम बारबोर-स्टोएनर-केली (बीएसके-द्वितीय या बीएसके-एच) माध्यम है, जो स्थापित संस्कृतियों में स्पाइरोकेट्स के विकास का मज़बूती से समर्थन करता है। टिक- या मेजबान-व्युत्पन्न नमूनों से नए पृथक बोरेलिया आइसोलेट्स को विकसित करने में सक्षम होने के लिए, जहां इनोकुलम में प्रारंभिक स्पाइरोकेट संख्या कम है, संशोधित केली-पेटेंकोफर (एमकेपी) माध्यम को प्राथमिकता दी जाती है। यह माध्यम बी मियामोटोई के विकास का भी समर्थन करता है।आरएफ स्पाइरोकेट्स की खेती की सफलता भी सामग्री की गुणवत्ता पर गंभीर रूप से निर्भर करती है।

Introduction

बोरेलिया स्पाइरोकेट बैक्टीरिया का एक जीनस है जिसमें तीन प्रमुख क्लेड शामिल हैं: लाइम बोरेलियोसिस (एलबी) समूह, रिलैप्सिंग फीवर (आरएफ) समूह, और एक कम अच्छी तरह से विशेषता वाला समूह जो सरीसृपों तक सीमित है। बोरेलिया टैक्सोनॉमी आणविक पद्धतियों के आगमन के साथ प्रवाह में है जो जीनोम और प्रोटिओम तुलना की अनुमति देता है, जैसा कि अधिकांश अन्य टैक्सोनोमिक समूहों 1,2,3,4,5,6,7 के बारे में सच है। एलबी समूह (जिसे लाइम रोग समूह भी कहा जाता है) को पारंपरिक रूप से बोरेलिया बर्गडॉर्फरी सेंसु लाटो कहा जाता है, इसके सबसे अच्छी विशेषता वाले सदस्य बोरेलिया बर्गडोरफेरी सेंसु स्ट्रिटो के बाद। यह पेपर वर्तमान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली शब्दावली का उपयोग करता है: एलबी, आरएफ, और सरीसृप से जुड़े समूह, और एलबी और आरएफ समूहों के लिए संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

जैसा कि परिवार के एक सदस्य स्पिरोकेटेसी के लिए उम्मीद की जाएगी, बोरेलिया विशिष्ट रूप से लंबे और पतले सर्पिल आकार को अपना सकता है, आमतौर पर 20-30 μm लंबा और 0.2-0.3 μm चौड़ा। हालांकि, बोरेलिया कोशिकाएं अत्यधिक प्लियोमॉर्फिक हैं और अपनी जटिल सेलुलर और आनुवंशिक संरचना के परिणामस्वरूप संस्कृति और विवो 1,8 दोनों में कई अन्य आकृतियों को अपना सकती हैं। अपने स्पाइरोकेटल रूप में, प्लानर साइन तरंग आकृति विज्ञान आंतरिक और बाहरी झिल्ली के बीच पेरिप्लाज्मिक स्थान में घूमने वाले अपने अक्षीय एंडोफ्लैगेला से उत्पन्न होता है। यह संरचना कोशिकाओं को अत्यधिक गतिशील होने में सक्षम बनाती है, जिसमें बाहरी झिल्ली में प्रोटीन होते हैं जो कोशिका को मेजबान ऊतकों 9,10 के साथ बातचीत करने में सक्षम बनाते हैं। बाहरी झिल्ली प्रोटीन की अभिव्यक्ति को कसकर विनियमित किया जाता है और न केवल मेजबान ऊतक आक्रमण को प्रभावित करता है बल्कि मेजबानप्रतिरक्षा प्रणाली के साथ बातचीत भी करता है। यह जटिल जीन अभिव्यक्ति बोरेलिया कोशिकाओं को कशेरुक मेजबानों और अकशेरुकी वैक्टर के बहुत अलग वातावरण के बीच शटल करने की अनुमति देती है। बोरेलिया का जीनोम प्रोकैरियोट्स के बीच असामान्य है, जिसमें एक गोलाकार गुणसूत्र के बजाय एक रैखिक होता है। रैखिक गुणसूत्र के अलावा, बोरेलिया प्रजातियों में 7-21 प्लास्मिड, कुछ रैखिक और कुछ गोलाकार होते हैं। प्लास्मिड मेजबान अनुकूलन और विषाणु के लिए आवश्यक अधिकांश जीनों को आश्रय देते हैं, और प्रोफेज से प्राप्त परिपत्र प्लास्मिड को स्पाइरोकेटल कोशिकाओं12,13 के बीच क्षैतिज जीन प्रवाह के बहुमत के लिए जिम्मेदार माना जाता है। मेजबान अनुकूलन में एक भूमिका के अनुरूप, कुछ, संभवतः कई या सभी, लाइम बोरेलियोसिस समूह के सदस्य संस्कृति14 में प्लास्मिड खो देते हैं। बर्गडॉर्फरी, बी 31 के सबसे अच्छे अध्ययन किए गए "प्रयोगशाला अनुकूलित" तनाव मेंइस प्रजाति के जंगली आइसोलेट्स में पाए जाने वाले नौ प्लास्मिड में से केवल सात हैं। इसी तरह, बी गैरिनी संस्कृति16 में प्लास्मिड खो देता है। कुछ अध्ययनों से पता चला है कि आरएफ प्रजातियां और बी मियामोटोई 14,17 सुसंस्कृत होने पर प्लास्मिड को बनाए रखते हैं, लेकिन हाल के काम में लंबे समय तक इन विट्रो खेती के साथ परिवर्तित प्लास्मिड और संक्रामकता प्रदर्शित होतीहै।

संस्कृति-आधारित विधियां अनुसंधान और नैदानिक कार्यदोनों के लिए बैक्टीरिया के संक्रमण की प्रयोगशाला का पता लगाने के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई हैं। शारीरिक तरल पदार्थ या ऊतकों से रोगजनकों की संस्कृति सीधे प्रतिकृति रोगजनकों का पता लगाती है और अनुसंधान के लिए स्रोत सामग्री प्रदान करती है14,17. यह प्रोटोकॉल एलबी समूह के स्पाइरोकेट्स के साथ-साथ आरएफ बोरेलिया और बी मियामोटोई को सफलतापूर्वक कल्चर करने के लिए आवश्यक कार्यप्रणाली और व्यंजनों को प्रदर्शित करता है। बोरेलिया स्पाइरोकेट्स को उगाने का मूल माध्यम बारबोर-स्टोएनर-केली माध्यम (बीएसके -2 या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीएसके-एच) है, जो दूषित प्रोकैरियोट्स के विकास को कम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के साथ या बिना है। इस माध्यम को मूल रूप से आरएफ बोरेलिया19 का समर्थन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माध्यम से अनुकूलित किया गया था, जिसे आगे स्टोनर20 और फिर बारबोर21 द्वारा संशोधित किया गया था। तब से कई संशोधन विकसित किए गए हैं, जिनमें से प्रत्येक का जीवाणु शरीर विज्ञान पर प्रभाव पड़ता है जो विकास, संक्रामकता और रोगजनकताको प्रभावित कर सकता है। यह माध्यम विश्वसनीय रूप से स्थापित संस्कृतियों में स्पाइरोकेट्स के विकास का समर्थन करता है और इसका उपयोग टिक, स्तनपायी औरनैदानिक नमूनों से स्पाइरोकेट्स को अलग करने के लिए किया गया है। हाल ही में विकसित भिन्नता, संशोधित केली-पेटेंकोफर (एमकेपी) माध्यम, पर्यावरणीय नमूनों से नए बोरेलिया आइसोलेट्स को अलग करते समय बेहतर अलगाव सफलता, आकृति विज्ञान और गतिशीलता प्रदान कर सकता है, जब संस्कृति के बीज के लिए उपलब्ध नमूने में मौजूद स्पाइरोकेट्स की संख्या23,24 कम है। सभी मामलों में, खेती की सफलता ताजा तैयार माध्यम और उचित सामग्री के उपयोग पर गंभीर रूप से निर्भर है; सभी वाणिज्यिक सामग्री उच्च गुणवत्ता वाले माध्यम का उत्पादन नहीं करती हैं। अवशिष्ट परिवेश ऑक्सीजन की थोड़ी मात्रा की उपस्थिति में पारंपरिक 32-34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में हिलाए बिना टीका कृत संस्कृतियों को आसानी से इनक्यूबेट किया जा सकता है। बोरेलिया स्पाइरोकेट्स एनारोबेस हैं, लेकिन ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड सांद्रता में उतार-चढ़ाव के लिए प्रकृति में उजागर होते हैं और जीन अभिव्यक्ति 26,27,28,29 में परिवर्तन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। इस प्रकार, जीन अभिव्यक्ति, विकास और अन्य चयापचय अध्ययनों को ऑक्सीजन-नियंत्रित इनक्यूबेटर या एनारोबिक कक्ष के उपयोग के साथ ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के स्तर को नियंत्रित करना चाहिए। संस्कृति में, संस्कृतियों को डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी या चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ स्पाइरोकेट्स की उपस्थिति के लिए साप्ताहिक या अधिक बार जांचा जाता है। कल्चर स्मीयर को या तो चांदी के दाग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, या फ्लोरोसेंटली टैग किए गए उपभेदों29,30 के उपयोग के माध्यम से दाग दिया जा सकता है। डीएनए अनुक्रमण के बाद पीसीआर बोरेलिया प्रजातियों30,31,32,33 का पता लगाने और आनुवंशिक रूप से पहचानने या पुष्टि करने के लिए एक संवेदनशील और विशिष्ट विधि है।

बीएसके -2 पर कई मामूली भिन्नताएं मौजूद हैं, और कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। खंड 1 में यहां वर्णित प्रोटोकॉल को बारबोर (1984)21 से अनुकूलित किया गया है। तरल एमकेपी माध्यम एक अधिक हाल ही में विकसित माध्यम है और इसे खंड 2 में वर्णित किया गया है। यह पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल33,34 के अनुसार तैयार किया गया है, जिसमें बीएसके माध्यम के समान, दो चरण होते हैं: बुनियादी माध्यम की तैयारी और पूर्ण माध्यम की तैयारी। बोरेलिया कल्चर माध्यम एंटीबायोटिक दवाओं के साथ या बिना तैयार किया जा सकता है, जैसा कि धारा 3 में वर्णित है; एंटीबायोटिक्स नैदानिक या पर्यावरणीय नमूनों के साथ इंजेक्शन लगाते समय पेश किए गए दूषित बैक्टीरिया को कम करने के लिए कार्य करते हैं, जैसा कि धारा 4 में वर्णित है; यदि शुद्ध बोरेलिया एसपी कल्चर के साथ इंजेक्शन लगाया जाता है, तो एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता नहीं हो सकती है। लंबी अवधि के बोरेलिया स्टॉक बनाना अक्सर महत्वपूर्ण होता है, और ऐसा करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुभाग 5 में वर्णित है। खंड 6 नैदानिक या पर्यावरणीय नमूनों से शुद्ध बोरेलिया सेंसु लाटो क्लोन को अलग करने के लिए इन मीडिया का उपयोग करने का वर्णन करता है। कई संभव दृष्टिकोण हैं36; नीचे एक को प्रभावी पाया गया है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त चढ़ाना माध्यम बीएसके-II प्लेटिंग माध्यम37 और एमकेपी माध्यम 34 (खरगोश सीरम 10%38 तक बढ़ने के साथ) का संशोधन है।

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Protocol

मानव विषय से प्राप्त नमूनों से जुड़े सभी अध्ययनों को संबंधित विश्वविद्यालय और / या चिकित्सा सुविधा के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था, और नमूने एकत्र करने से पहले प्रतिभागियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। जानवरों से प्राप्त नमूनों से जुड़े सभी अध्ययनों को संस्थागत पशु आचार समिति के दिशानिर्देशों के तहत अनुमोदित और आयोजित किया गया था। जहां प्रासंगिक है, पर्यावरण नमूने के लिए अनुमोदन प्राप्त किए गए हैं।

नोट: संस्कृति की सफलता सामग्री की गुणवत्ता पर गंभीर रूप से निर्भर है। वाणिज्यिक बीएसके माध्यम उपलब्ध है और प्रयोगशाला-अनुकूलित शुद्ध बी बर्गडोरफेरी और संबंधित प्रजातियों के विकास का समर्थन करता है जहां संस्कृति को बीज देने के लिए उच्च खुराक इनोकुलम का उपयोग किया जा सकता है। प्राथमिक जैविक सामग्री से उपभेदों के आइसोलेट्स के लिए, ताजा तैयार माध्यम पसंद किया जाता है और अक्सर आवश्यक होता है।

बोरेलिया एसपी ज्ञात या संदिग्ध रोगजनक हैं, और बिना स्क्रीनिंग वाले मानव या पशु ऊतक भी एक बायोहैज़र्ड हो सकते हैं। संभावित संक्रामक सामग्री की हैंडलिंग के लिए जांचकर्ता सुरक्षा के लिए व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और बाँझ तकनीक की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, माध्यम इतना पोषक तत्वों से भरपूर है कि संस्कृति आसानी से दूषित हो जाती है। इस काम के लिए आम तौर पर जैव सुरक्षा स्तर 2 रोकथाम की आवश्यकता होती है और बोरेलिया एसपी के साथ सभी काम या नमूने जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किए जाने चाहिए।

1. बीएसके-2 को माध्यम बनाने के निर्देश

  1. पूर्ण बीएसके-II माध्यम की तैयारी
    1. माध्यम के 1 एल तैयार करने के लिए अभिकर्मकों को प्राप्त करें, जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है।
      नोट: बीएसए शुद्धता (या शुद्धता की कमी) इष्टतम विकास के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, बीएसए शुद्धता निर्माता और लॉट दोनों के बीच भिन्न होती है। अधिक बनाम कम सफल उत्पादों की सूची के लिए कृपया तालिका 2 देखें। विभिन्न विक्रेताओं से कई नमूने प्राप्त करना, इष्टतम विकास के लिए उनका परीक्षण करना, फिर सबसे अच्छी मात्रा में खरीदना इस समस्या को कम करने और एक अच्छा माध्यम बनाने के लिए एक प्रभावी रणनीति है।
    2. बीएसए को पानी में हिलाकर बीकर में घोलने से शुरू करें, जिसमें कम से कम आधा घंटा लगेगा।
    3. सभी सूखे रसायनों को जोड़ें और उन्हें घुलने दें। फिर CMRL जोड़ें।
    4. बीएसके-II माध्यम के पीएच को 7.6 तक समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, तो 1 एम एनएओएच के साथ।
    5. 6% -10% की एकाग्रता के लिए बीएसके -2 माध्यम में खरगोश सीरम जोड़ें। BSK-II माध्यम को फ़िल्टर करें (0.22 μm छिद्र आकार)। सीरम की आवश्यक मात्रा बोरेलिया प्रजातियों पर निर्भर करती है। आरएफ प्रजातियों और उपभेदों के लिए 6% -7% का उपयोग करें, और बोरेलिया बर्गडोरफेरी सेंसु लाटो के लिए। यदि विकास मजबूत नहीं है, तो माध्यम में एक और 1% -2% बाँझ खरगोश सीरम जोड़ें।
    6. बीएसके -2 माध्यम के स्टॉक को 100 एमएल या 400 एमएल एलिकोट में फ्रीज करें।
    7. आरएफ उपभेदों के लिए, जिलेटिन की आवश्यकता होती है। 400 एमएल बीएसके-II माध्यम में 7% बाँझ जिलेटिन के 100 एमएल (इसे घोल में डालने के लिए थोड़ा गर्म) जोड़ें। जिलेटिन को 37 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन के साथ बीएसके -2 को गर्म करें ताकि जिलेटिन को कल्चर करने से पहले पिघला दिया जा सके।
      नोट: फिल्टर नसबंदी और खरगोश सीरम और जिलेटिन (आरएफ स्पाइरोकेट्स के लिए) या फिल्टर नसबंदी और सीरम (और जिलेटिन) जोड़ने के बाद माध्यम को फ्रीज (-20 डिग्री सेल्सियस) किया जा सकता है। लंबे समय तक जमे रहने पर माध्यम स्थिर होता है। फ्रिज में संग्रहीत होने पर, 1 महीने के भीतर माध्यम का उपयोग करें। आरएफ प्रजातियां ताजा माध्यम के साथ सबसे अच्छी तरह से बढ़ती हैं, आमतौर पर 1 सप्ताह से अधिक पुरानी नहीं होती हैं। यदि जमे हुए नहीं हैं, तो मैलापन के लिए माध्यम की गुणवत्ता का निरीक्षण करें। उस माध्यम को त्याग दें जो दूषित, अवक्षेपित अवयव, या अन्यथा संदिग्ध प्रतीत होता है।
    8. यदि एंटीबायोटिकदवाओं को माध्यम में जोड़ा जाना है, तो उन्हें ताजा बनाए गए माध्यम या पहले से जमे हुए एलिकोट में जोड़ें; उत्तरार्द्ध अधिक लचीला दृष्टिकोण है। ओलिवर एट अल .39 द्वारा वर्णित एंटीबायोटिक सांद्रता का उपयोग करें।
    9. माध्यम की एक ट्यूब को पिघलाते समय, एंटीबायोटिक दवाओं को बाँझ (आटोक्लेव) 1.7 एमएल ट्यूबों या बाँझ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में तौलें, एक सटीक संतुलन का उपयोग करके। स्टॉक समाधान निम्नानुसार तैयार करें: डीएमएसओ के 10 एमएल में 25 मिलीग्राम एम्फोटेरिसिन बी, 1 एमएल आटोक्लेव डिस्टिल्ड पानी में 20 मिलीग्राम फॉस्फोमाइसिन और डीएमएसओ के 1 एमएल में 50 मिलीग्राम रिफैम्पिसिन घोलें।
    10. एंटीबायोटिक दवाओं को फ़िल्टर करें (0.2 μm सिरिंज फिल्टर) और उन्हें उचित आकार की एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    11. एंटीबायोटिक दवाओं को उनकी अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए माध्यम के 1: 1000 के अनुपात में पतला करें। बीएसके के 500 एमएल के लिए, 0.5 एमएल एम्फोटेरिसिन बी स्टॉक समाधान (डीएमएसओ में 2.5 मिलीग्राम / एमएल), 0.5 एमएल फॉस्फोमाइसिन स्टॉक समाधान (बाँझ एच2ओ में 20 मिलीग्राम / एमएल), और रिफैम्पिसिन (यूएस: रिफैम्पिन) स्टॉक समाधान (डीएमएसओ में 50 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें।
    12. एंटीबायोटिक-पूरक माध्यम या एलिकोट का उपयोग करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
घटक राशि (/L)
बीएसए अंश वी 50 ग्राम
CMRL-1066 (10x) 100 एमएल
नियोपेप्टोन 5 ग्राम
Hepes 6 g
साइट्रिक एसिड ट्राइसोडियम नमक डाइहाइड्रेट 0.7 ग्राम
ग्लूकोज़ 5 ग्राम
टीसी येस्टोलेट; 2 जी
पाइरुविक एसिड (ना नमक) 0.8 ग्राम
एन-एसिटाइल-डी-ग्लूकोसेमाइन 0.4 ग्राम
सोडियम बाइकार्बोनेट 2.2 ग्राम
जल (उच्च शुद्धता) 900 एमएल

तालिका 1: बीएसके-II माध्यम के 1 एल की संरचना।

स्रोत उपयुक्तता
सर्वा जीएमबीएच, हीडलबर्ग, जर्मनी हाँ
प्रोलियंट बायोलॉजिकल्स, बून आईए, यूएसए हाँ
सिग्मा (मिलिपोर-सिग्मा और सिग्मा-एल्ड्रिच), सेंट लुइस, एमओ, संयुक्त राज्य अमेरिका नहीं

तालिका 2: बीएसके -2 माध्यम के लिए बीएसए और उपयुक्तता के स्रोत।

2. एमकेपी बनाने के निर्देश

  1. बुनियादी माध्यम की तैयारी
    1. डीडीएच2ओ (सीए 750 एमएल) के अंतिम आयतन के 3/4 में तालिका 3 में नीचे सूचीबद्ध सभी पाउडर घटकों को पूरी तरह से घुलने तक हिलाकर तौलें और घोलें, जिसमें ~ 1 घंटे लगते हैं।
    2. पूर्ण घुलने के बाद, एनएओएच के साथ पीएच को 7.6 और मात्रा को 1000 एमएल तक समायोजित करें, और फिर निस्पंदन (0.22 μm फिल्टर) द्वारा निष्फल करें।
      नोट: मूल माध्यम को 3 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एमकेपी पूर्ण माध्यम की तैयारी
    1. तालिका 4 में सूचीबद्ध सभी घटकों को बाँझ तरीके से मिलाएं; ऑटोक्लेविंग द्वारा जिलेटिन को स्टरलाइज़ करें और बाँझ तरीके से संभालें। एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट में काम करें और बाँझ फ़िल्टर किए गए सीरम का उपयोग करें।
    2. 50 एमएल ट्यूबों में एलिकोट एमकेपी। कई दिनों के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पर एक छोटा एलिकोट रखें, फिर संदूषण की अनुपस्थिति के लिए डार्कफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें।
      नोट: एमकेपी को 1 महीने से अधिक समय तक +4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण माध्यम रखें, और फ्रीज न करें। पूर्ण माध्यम को 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके निस्पंदन द्वारा अतिरिक्त रूप से निष्फल किया जा सकता है।
घटक राशि (/L)
CMRL-1066 (ग्लूटामाइन के बिना 10x) 100 एमएल (यदि तरल है)/9.7 ग्राम/लीटर यदि पाउडर
नियोपेप्टोन 3 g
Hepes 6 g
साइट्रिक एसिड 0.7 ग्राम
ग्लूकोज़ 3 g
पाइरुविक एसिड 0.8 ग्राम
एन-एसिटाइलग्लूकोसेमाइन 0.4 ग्राम
सोडियम बाइकार्बोनेट 2 जी

तालिका 3: मूल एमकेपी (संशोधित केली-पेटेंकोफर) माध्यम के 1 एल की संरचना।

घटक राशि (एमएल)
बुनियादी माध्यम 500
7% जिलेटिन (H2O में) (ताजा आटोक्लेव लेकिन गर्म नहीं) 100
खरगोश सीरम 36
35% बीएसए 17.5

तालिका 4: एमकेपी (संशोधित केली-पेटेंकोफर) पूर्ण माध्यम की संरचना।

3. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ या बिना बोरेलिया की संस्कृति

  1. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ कामकाजी परिस्थितियों के तहत सभी प्रयोगात्मक चरणों का प्रदर्शन करें। सतह और सभी सामग्रियों को 70% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित करें, और उन्हें तुरंत जैविक सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें। यूवी काम शुरू होने से पहले 5 मिनट के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में सभी गैर-जैविक सामग्रियों को निष्फल करें।
  2. सबसे ताजा संभव माध्यम का उपयोग करें।
  3. एक संस्कृति शुरू करने के लिए, एक इनक्यूबेटर में माध्यम (33 डिग्री सेल्सियस - 37 डिग्री सेल्सियस) को पूर्व-गर्म करें। यदि आवश्यक हो तो हिलाना लागू करें।
    नोट: माध्यम की मात्रा के आधार पर, इस चरण में कई घंटे लग सकते हैं।
  4. ग्लिसरॉल या इसी तरह के स्टॉक से पिघली हुई बोरेलिया संस्कृति के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ें, जिसे पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था और कमरे के तापमान (आरटी) पर पिघलाया गया था, जैसे ही यह तरल होता है, 5-15 एमएल पूर्व-गर्म बीएसके माध्यम में। स्क्रू कैप के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लास या प्लास्टिक की शीशियों का उपयोग करके कल्चर को एक छोटी मात्रा (बीएसके के 5-15 एमएल) में टीका लगाएं। सूक्ष्म या अवायवीय वातावरण बनाने के लिए ट्यूबों को लगभग भरा हुआ भरें। ट्यूबों को कसकर बंद करें; यदि इस तरह से सुसंस्कृत किया जाता है, तो सीओ2 की आवश्यकता नहीं है।
  5. आरएफ प्रजातियों (और बी पर्सिका) को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में बिना हिलाए या आंदोलन के उगाएं। 33-34 डिग्री सेल्सियस पर बी बर्गडॉर्फरी सेंसु लाटो प्रजातियों को उगाएं।
  6. 200x-400x आवर्धन पर चरण कंट्रास्ट या डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके बोरेलिया संस्कृति के विकास की निगरानी करें (चित्रा 3)। कोशिकाओं के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए, संस्कृति को सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ मिलाएं या ऊपर और नीचे पाइप िंग करते समय 3 एमएल ट्रांसफर पिपेट के साथ अधिक मिश्रण करें।
    नोट: बोरेलिया उच्च आवर्धन (200X-400X) पर सबसे अधिक दिखाई देते हैं, लेकिन हेमोसाइटोमीटर40 पर 200X आवर्धन पर सबसे अच्छी गणना योग्य हैं। बोरेलिया आंदोलन और आकृति विज्ञान इन बैक्टीरिया की उपस्थिति का संकेत है।
  7. बैक्टीरिया के विकास को मापने के लिए, हेमोसाइटोमीटर और औसत के दोनों किनारों पर गिनती क्षेत्र के सोलह-फील्ड ग्रिड पैटर्न में कई (10) अलग-अलग छोटे वर्गों की गणना करें। प्रति एमएल सेल गिनती निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जा रहे हेमोसाइटोमीटर के लिए उपयुक्त रूपांतरण कारक के साथ प्रति छोटे वर्ग में औसत सेल संख्या को गुणा करें।
  8. 1-2 दिन के अंतराल पर बैक्टीरिया के विकास की निगरानी करें। बोरेलिया की घातीय वृद्धि व्यवहार्यता और सेल घनत्व पर निर्भर है और 34 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह या उससे अधिक समय लग सकता है। हेमोसाइटोमीटर पर लोड होने से पहले 1.7 एमएल ट्यूब में माध्यम के साथ घातीय चरण संस्कृतियों को 1: 2 या 1: 4 के अनुपात में पतला करें। सेल गिनती का निर्धारण करते समय कमजोर पड़ने वाले कारक पर उचित विचार शामिल करें। उपयोग के बाद, सतहों और हेमोसाइटोमीटर को पतला ब्लीच (10%) और / या 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें।
    नोट: बोरेलिया घातीय वृद्धि में हैं जब सेल सांद्रता 1-5 x 107 सेल / एमएल होती है। इस सीमा के भीतर, कोशिकाएं अच्छी तरह से बढ़ती हैं।
  9. विस्तारित संस्कृति पोषक तत्वों को कम कर देगी और मध्यम पीएच को बदल देगी, इसलिए उप-संवर्धन की आवश्यकता है। एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में, संस्कृति की मात्रा के 1/10 को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे नए माध्यम से भरें (पिछले मार्ग को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी माध्यम का एक ताजा एलिकोट)। 1: 10 कमजोर पड़ना इष्टतम है। यदि कल्चर वॉल्यूम को बदलना है, तो इनोकुलम राशि को तदनुसार समायोजित करें, और इनक्यूबेशन जारी रखें। प्रत्येक माध्यम परिवर्तन के साथ अंशों की संख्या बढ़ जाती है।
  10. डीएनए के निष्कर्षण या बोरेलिया कोशिकाओं के अलगाव के लिए, बैक्टीरिया को पेलेट करने के लिए 4000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए घातीय चरण बोरेलिया को सेंट्रीफ्यूज करें। उपयुक्त बायोहेजार्ड कचरे में सतह पर तैरनेवाला को फेंक दें। पेलेट बैक्टीरिया को एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट के साथ संसाधित करें या इच्छित प्रयोग के लिए एक उपयुक्त माध्यम में बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें।
  11. प्रत्येक हेरफेर के अंत में, इथेनॉल और यूवी विकिरण के साथ सभी उपकरणों को निष्फल करें, जैसा कि उपकरण के लिए उपयुक्त है। अतिरिक्त कल्चर सहित तरल कचरे को एक अपशिष्ट बोतल में इकट्ठा करें और 10% की अंतिम एकाग्रता में ब्लीच जोड़ें। इसे छोड़ने से पहले इस बोतल को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। वैकल्पिक रूप से, ऑटोक्लेविंग द्वारा ब्लीच या अल्कोहल के बिना तरल अपशिष्ट और कल्चर को निष्फल करें।

4. बोरेलिया संस्कृतियों का दीर्घकालिक भंडारण

  1. बोरेलिया संस्कृति के ग्लिसरॉल स्टॉक की तैयारी
    1. घातीय चरण संस्कृतियों के ~ 1.8 एमएल एलिकोट लें, सेल सांद्रता ~ 107-10 8 कोशिकाएं / एमएल, और बाँझ ग्लिसरॉल को 10% की अंतिम एकाग्रता (5% -20% काम की सांद्रता) में जोड़ें।
    2. 2 एमएल स्क्रू कैप क्रायोजेनिक शीशियों में रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. फ्रीजर में प्रत्येक तनाव के कम से कम 10 ट्यूबों के साथ एक स्टॉक बनाए रखें।
  2. स्थायी भंडारण के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक का उत्पादन करने के लिए एक वैकल्पिक भंडारण नुस्खा
    1. ब्रुसेला शोरबा में 15% ग्लिसरॉल के 1/3 के साथ बोरेलिया संस्कृति के 2/3 को मिलाएं। 2.8 ग्राम ब्रुसेला शोरबा का उपयोग करें जो डीडीएच2ओ के 100 एमएल में घुल गया था, जिसे बाँझ फ़िल्टर किया गया था (0.22 μm)।
    2. नमूनों के ग्लिसरॉल स्टॉक को -70 डिग्री सेल्सियस से -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

5. पर्यावरणीय या नैदानिक स्रोतों से स्पाइरोकेट्स का अलगाव

नोट: यदि मानव, पशु, या पर्यावरणीय स्रोतों से सामग्री को अलग किया जाता है, तो अनुसंधान नैतिकता, पशु देखभाल, या पारिस्थितिक प्रमाणन, जैसा कि उपयुक्त हो, प्राप्त किया जाना चाहिए।

  1. हार्ड टिक्स से बोरेलिया की खेती
    1. वयस्क मादाओं, पुरुषों और / या अप्सरा टिक्स एकत्र करें।
    2. सतह सभी टिक नमूनों को 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में डुबोकर और जैविक सुरक्षा कैबिनेट में हवा में सूखकर निष्फल करें। बाँझ स्केलपेल के साथ व्यक्तिगत रूप से कई टुकड़ों में विच्छेदन करें। टुकड़ों को 2 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें 1.5 एमएल मध्यम होता है, जो एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक होता है।
    3. 34 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें और डार्कफील्ड या फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पाइरोकेट्स की जांच पहले 2 सप्ताह के लिए साप्ताहिक रूप से दो बार और उसके बाद 6 सप्ताह के लिए साप्ताहिक रूप से करें (अक्सर आरएफ स्पाइरोकेट्स के लिए)। एक ही माध्यम के 5 एमएल में उपसंस्कृति संस्कृति-सकारात्मक नमूने।
      नोट: दूषित संस्कृतियों को 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके निस्पंदन द्वारा कुछ हद तक शुद्ध किया जा सकता है; संदूषण को पूरी तरह से हल करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता हो सकती है।
  2. रक्त के नमूनों से बोरेलिया की खेती
    नोट: सामग्री के स्रोत के आधार पर रक्त का नमूना एक योग्य चिकित्सा, पशु चिकित्सा, या अनुसंधान पेशेवर द्वारा लिया जाना चाहिए। आरटी में 24 घंटे से कम समय नमूने के बीच समाप्त होना चाहिए।
    प्रयोगशाला में निष्कासन और आगमन।
    1. एसिड साइट्रेट डेक्सट्रोज (एसीडी) के साथ ग्लास रक्त संग्रह ट्यूबों में एकत्र किए गए 10 एमएल रक्त प्राप्त करें; "येलो टॉप") एक थक्कारोधी के रूप में। कमरे के तापमान पर छोड़ दें। यह अनुशंसा की जाती है कि रक्त संग्रह और टीकाकरण के बीच 24 घंटे से कम समय बीत जाए।
    2. रक्त कोशिकाओं से प्लाज्मा को अलग करने के लिए 200-400 x g पर 10 मिनट के लिए एंटीकोआगुलेंट के साथ रक्त को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. धीरे से ट्यूब से प्लाज्मा निकालें और 1 मिलीलीटर प्लाज्मा को 5 एमएल प्री-हीटेड एमकेपी पूर्ण माध्यम में टीका लगाएं। एमकेपी को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जा सकता है। दैनिक दृश्य निरीक्षण और साप्ताहिक डार्कफील्ड या फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी के साथ 33 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें जब तक कि बोरेलियन विकास नहीं देखा जाता है (अक्सर आरएफ बोरेलिया के लिए), जिसमें 9 सप्ताह तक का समय लग सकता है।
      नोट: यदि बड़े या छोटे टीकाकरण वॉल्यूम का उपयोग कर रहे हैं, तो इनोकुलेंट से मध्यम के 1: 5 अनुपात को बनाए रखें। पूरे रक्त के बजाय सेरा या प्लाज्मा का उपयोग करें।
  3. त्वचा बायोप्सी से बोरेलिया की खेती
    1. सतह त्वचा बायोप्सी को निष्फल करें (आदर्श रूप से 3 मिमी x 3 मिमी x 3 मिमी क्यूब; यानी, 70% इथेनॉल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ)। बायोप्सी के नमूने को शारीरिक लवण में रखें।
      नोट: सामग्री के स्रोत के आधार पर एक बायोप्सी नमूना एक योग्य चिकित्सा, पशु चिकित्सा, या अनुसंधान पेशेवर द्वारा लिया जाना चाहिए। आरटी में 24 घंटे से कम समय नमूना हटाने और प्रयोगशाला में आने के बीच समाप्त होना चाहिए।
    2. शारीरिक लवण में डूबे हुए एक बाँझ ग्लास पेट्री डिश में बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करके नमूने को दो से छह छोटे टुकड़ों में विभाजित करें। सभी नमूनों और ~ 1 एमएल शारीरिक लवण को स्थानांतरित करें जिसमें त्वचा बायोप्सी को एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक 5 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड माध्यम में संग्रहीत किया गया था और 33 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था।
    3. दूषित बैक्टीरिया के अतिवृद्धि के मामले में, ऊपर दिए गए चरण 1.1.10 के अनुसार एंटीबायोटिक्स जोड़ें, या सल्फामेथोक्साज़ोल (23.75 मिलीग्राम; अंतिम एकाग्रता 5 मिलीग्राम / एमएल) + ट्राइमेथोप्रिम (1.25 मिलीग्राम; 0.25 मिलीग्राम / एमएल) या बैक्ट्रीम (न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता >128 μg / mL), एमिकेसिन की दो गोलियां (2 x 30 μg; अंतिम एकाग्रता 12 μg / mL) की दो गोलियां जोड़कर। और फॉस्फोमाइसिन की दो गोलियां (2 x 200 μg; अंतिम एकाग्रता 80 μg / mL)।
      नोट: सभी मामलों में, बोरेलिया प्रजातियों के लिए उस एंटीबायोटिक की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता से नीचे रहना सुनिश्चित करें, जिसके लिए संस्कृति41,42,43 का प्रयास किया जा रहा है।
    4. यदि बोरेलिया के लिए संस्कृति सकारात्मक है, तो संस्कृति को अतिरिक्त 3-4 दिनों के लिए रखें या जब तक कि बोरेलिया की मात्रा 40एक्स उद्देश्य का उपयोग करके माइक्रोस्कोप क्षेत्र में 10+ स्पाइरोकेट्स तक न पहुंच जाए। स्थायी भंडारण के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक बनाएं।

6. ठोस मीडिया पर खेती द्वारा तरल संस्कृतियों से बी. बर्गडॉर्फरी सेंसु लाटो स्पाइरोकेट्स और बी. मियामोटोई की मोनोक्लोनल आबादी का अलगाव।

  1. प्लेट बनाने के लिए, 1.5 X MKP पूर्ण माध्यम (जिलेटिन के बिना) के 300 मिलीलीटर गर्म करें। इसके अलावा, 1.7% अगारोस के गर्म 200 एमएल (विआयनीकृत पानी में आटोक्लेव, आरटी में संग्रहीत, और उपयोग से पहले माइक्रोवेव) 55 डिग्री सेल्सियस तक। दोनों तरल पदार्थों को मिलाएं।
  2. इस मिश्रण के 15 मिलीलीटर को 16 गहरे पेट्री व्यंजनों में से प्रत्येक में पिपेट करें ताकि नीचे का एगर ओसेलेयर बनाया जा सके।
  3. पानी के स्नान में 55 डिग्री सेल्सियस पर शेष माध्यम को बनाए रखें।
    नोट: बोरेलिया को शीर्ष अगारोस परत में मिलाया जाता है।
  4. सबसे पहले, हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके बोरेलिया संस्कृति घनत्व की मात्रा निर्धारित करें और एक तरल माध्यम में वांछित घनत्व को पतला करें।
    नोट: 500, 200, 100, और 50 स्पाइरोकेट्स प्रति प्लेट अच्छी तरह से काम करते हैं।
  5. नीचे की प्लेटों के जमने के बाद, शेष अगारोस मिश्रण के 10 मिलीलीटर को 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें जिसमें उचित संख्या में स्पाइरोकेट्स हों।
  6. लेबल किए गए पेट्री डिश में निचले अगारोस पर निलंबन डालें।
    नोट: चूंकि बोरेलिया स्पाइरोकेट्स उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि बैक्टीरिया को विस्तारित अवधि के लिए 55 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में नहीं लाया जाए; माध्यम में बैक्टीरिया कोशिकाओं में जोड़ने पर तुरंत शीर्ष आगर डालें।
  7. प्लेटों के पूरी तरह से जम जाने के बाद, पेट्री व्यंजन ों को बंद करें और उन्हें 2.5% सीओ2 में 34-35 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा रखें।
    नोट: यदि प्रक्रिया सफल होती है तो कॉलोनियां चढ़ाना के 1 सप्ताह बाद दिखाई देंगी।
  8. अलग-अलग कॉलोनियों को स्क्रीन और विस्तारित करने के लिए, प्लेटों से एकल कॉलोनियों का चयन करें और उन्हें बाँझ 2 एमएल कल्चर ट्यूबों में 1.5 एमएल संशोधित तरल एमकेपी, या अन्य उपयुक्त मीडिया में डालें।
  9. 34 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें और डार्कफील्ड या चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा स्पाइरोकेट्स की जांच करें। विश्लेषण या स्टॉक के लिए इन संस्कृतियों का उपयोग करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।

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Representative Results

बोरेलिया कल्चर मीडिया बीएसके और एमकेपी, और वेरिएंट, सामग्री के साथ समृद्ध संस्कृति मीडिया हैं जिन्हें क्रमिक रूप से तैयार और निष्फल करने की आवश्यकता होती है। जब सही ढंग से तैयार किया जाता है, तो बीएसके माध्यम लाल-नारंगी और स्पष्ट होना चाहिए (चित्रा 1)। टर्बिडिटी और वर्षा जो वार्मिंग के बाद बनी रहती है, समस्याग्रस्त सामग्री, मध्यम उत्पादन या संदूषण का संकेत देती है; इस तरह के माध्यम को त्यागना सबसे अच्छा है। यदि जिलेटिन को बीएसके और एमकेपी के साथ जोड़ा जाता है, तो प्रशीतित होने पर माध्यम जिलेटिनस होगा; गर्म होने पर, यह तरल होगा, हालांकि थोड़ा चिपचिपा होगा।

शुद्ध बोरेलिया संस्कृतियों का विकास माध्यम की टर्बिडिटी को नहीं बदलेगा। हालांकि, बैक्टीरिया संस्कृतियों की वृद्धि, बोरेलिया, साथ ही दूषित पदार्थ, पीएच संकेतक के परिणामस्वरूप मध्यम रंग बदल देंगे। अन्य जीवाणुओं द्वारा अतिवृद्धि मैलापन और संकुचित सामग्री का उत्पादन करेगी (चित्रा 2)।

कल्चर ग्रोथ को फेज कंट्रास्ट या डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3 और चित्रा 4) द्वारा मॉनिटर किया जा सकता है। घातीय चरण में बोरेलिया कोशिकाएं आमतौर पर पतली और गांठदार होती हैं, और कुछ हद तक मोटिव होती हैं। जैसे-जैसे संस्कृतियां स्थिर चरण में जाती हैं, गोल शरीर तेजी से स्पष्ट होते हैं (चित्र 5)। नैदानिक या पर्यावरणीय आइसोलेट्स में अक्सर कई बोरेलिया उपभेद और / या प्रजातियां होती हैं। शुद्ध क्लोन को अलग करने के लिए, मोनोक्लोनल कॉलोनियों को अलग करने के लिए तरल संस्कृतियों को चढ़ाया जा सकता है (चित्रा 6); कभी-कभी, कॉलोनी अलगाव के कई दौर की आवश्यकता हो सकती है।

Figure 1
चित्र 1: बीएसके और एमकेपी माध्यम । (ए) बीएसके (एंटीबायोटिक दवाओं के साथ) बोरेलिया बर्गडोरफेरी की शुद्ध संस्कृति के साथ। बर्गडॉर्फेरी माध्यम दृश्यमान टर्बिडिटी के बिना रहता है और नारंगी-एम्बर होता है (रंग सामग्री के साथ थोड़ा भिन्न होता है)। (बी) एमकेपी मध्यम, बिना टीका वाला, पिघलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिस्पर्धी बैक्टीरिया के अतिवृद्धि के साथ दूषित बीएसके और एमकेपी माध्यम। माध्यम बदरंग, विकृत होता है, और समय के साथ प्रतिस्पर्धी बैक्टीरिया मर जाते हैं और ट्यूब के तल तक अवक्षेपित हो जाते हैं। (ए) ओवरग्रोन बीएसके ट्यूब। (बी) अवक्षेपित दूषित बैक्टीरिया के साथ पुरानी बीएसके ट्यूब। (सी) एमकेपी ट्यूब के साथ (बाएं) और बिना (मध्य) संस्कृति और दूषित संस्कृति (दाएं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बोरेलिया विकास की निगरानी के लिए हेमोसाइटोमीटर का उपयोग। बोरेलिया बर्गडॉर्फेरी स्ट्रेन बी 31 (तीर द्वारा इंगित एक उप-समूह) को 200एक्स चरण कंट्रास्ट के तहत हेमोसाइटोमीटर (छोटे ग्रिड की एक पंक्ति को तीर द्वारा इंगित किया जाता है) पर देखा जाता है। यह आवर्धन और प्रक्रिया संस्कृतियों की निगरानी और सेल घनत्व के अनुमान की अनुमति देती है। स्केल बार 10 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: बोरेलिया बर्गडोर्फेरी की डार्कफील्ड छवि। एमकेपी माध्यम (400एक्स आवर्धन) में खेती के 5-7 दिनों के बाद घातीय चरण में उच्च घनत्व पर बोरेलिया बर्गडॉर्फेरी स्ट्रेन एससीडब्ल्यू -53 की डार्कफील्ड छवि। स्केल बार 20 μm है। इस स्ट्रेन को अमेरिका के साउथ कैरोलिना में इकट्ठा किए गए हार्ड टिक इक्सोड्स एफिनिस से अलग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पुरानी संस्कृतियों में बोरेलिया। चूंकि बोरेलिया कोशिकाएं पुरानी संस्कृतियों में स्थिर चरण में जाती हैं, इसलिए स्पाइरोकेटल रूप को बदलने के लिए गोल शरीर के रूपों को तेजी से देखा जाता है। ये निष्क्रिय रूप या मृत कोशिकाएं हो सकती हैं। बाएं पैनल, डाइटरल दाग; मध्य पैनल, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री दाग; और दाएं पैनल, बोरेलिया संस्कृति के फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण (उत्पत्ति के आधार पर बी बर्गडोर्फरी माना जाता है लेकिन प्रजातियों और तनाव को आणविक रूप से पहचाना नहीं गया था) को कुत्ते के मूत्र के साथ टीका लगाया गया था। चित्रा 5 में डेटा का संग्रह एमआरटी एलिसन यूनिवर्सिटी एनिमल केयर कमेटी, अनुमोदन संख्या 16-1 द्वारा अनुमोदित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: बोरेलिया बर्गडॉर्फेरी एक जटिल स्पाइरोकेट्स है। बोरेलिया बर्गडोरफेरी की कॉलोनियां शुद्ध क्लोनल आबादी को अलग करने के लिए ठोस माध्यम पर उगाए जाने वाले जटिल स्पाइरोकेट्स हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

बैक्टीरिया की प्रयोगशाला संस्कृति अनुसंधान के लिए स्प्रिंगबोर्ड है। संस्कृति की क्षमता द्वारा प्रदान किए गए गहन लाभ का उदाहरण संघर्ष से मिलता है, जो एक सदी से अधिक समय तक सफलता में समाप्त हुआ है, संस्कृति ट्रेपोनेमा पल्लीडम, स्पाइरोकेट जो सिफलिस44 का एटियलॉजिकल एजेंट है। बोरेलिया स्पाइरोकेट्स संस्कृति के लिए भी चुनौतीपूर्ण हैं, लेकिन संस्कृति संभव है 23,24,34,44,45,46,47,48,49।

बोरेलिया कोशिकाएं तेज होती हैं और प्रत्येक प्रजाति और तनाव, और यहां तक कि अलग-अलग भी भिन्न होते हैं, आनुवंशिक रूप से और मेजबान के अनुकूलन के माध्यम से जहां से उन्हें अलग किया गया है 51,52,53,54,55। मीडिया बनाते समय, उचित सामग्री का उपयोग बोरेलिया संस्कृति की शक्ति या यहां तक कि संस्कृति की व्यवहार्यता में बहुत बड़ा अंतर बनाता है। बैक्टीरिया के विकास को बढ़ावा देने के लिए ताजा तैयार, अत्यधिक समृद्ध, और ठीक से संग्रहीत माध्यम का उपयोग आवश्यक है और बैक्टीरिया के विकास के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित आवश्यकता है। बोरेलिया के लिए, अच्छे विकास के लिए एनारोबिक या माइक्रोएरोबिक स्थितियों को बनाए रखना आवश्यक है। यह ट्यूबों को शीर्ष पर भरकर सबसे आसानी से प्राप्त किया जा सकता है, इसलिए ट्यूब में कोई हवा नहीं बची है और आंदोलन के बिना संस्कृतियों को बढ़ा रही है; जीन अभिव्यक्ति और संबंधित अध्ययन26,27,28,29,30 के लिए ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड के अधिक कड़े नियंत्रण की आवश्यकता हो सकती है। बैक्टीरियल कल्चर माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा काउंटर-सहज लग सकता है; बोरेलिया माध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं की कम खुराक का उपयोग तेजी से बढ़ते बैक्टीरिया के विकास को हतोत्साहित करना है। यदि संस्कृति को शुद्ध बोरेलिया आइसोलेट के साथ टीका लगाया जाता है, तो एंटीबायोटिक दवाओं के अतिरिक्त की आवश्यकता नहीं होती है; हालांकि, नैदानिक या पर्यावरणीय नमूनों के साथ इंजेक्शन लगाते समय प्रतिस्पर्धी बैक्टीरिया से अतिवृद्धि को हतोत्साहित करने के लिए अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग आवश्यक है। बीएसके माध्यम को 3% -7% जिलेटिन के साथ भी पूरक किया जा सकता है। आरएफ बोरेलिया प्रजाति21 के विकास के लिए इसकी आवश्यकता है। बोरेलिया बर्गडॉर्फेरी सेंसु लाटो प्रजातियों के विकास के लिए बीएसके या एमकेपी का उपयोग आइसोलेट के स्रोत पर निर्भर करता है। दोनों मीडिया स्थापित संस्कृतियों के विकास का समर्थन करते हैं, लेकिन एमकेपी को बोरेलिया कोशिकाओं की कम संख्या के साथ नई संस्कृतियों को बोते समय बेहतर प्रदर्शन करते हुए पाया गया है, जैसे कि नैदानिक या पर्यावरणीय आइसोलेट्स23,24 के साथ होता है। यह माध्यम बी मियामोटोई56,57,58 की संस्कृति की भी अनुमति देता है। अंततः, तेजी से रोगाणुओं को बढ़ाने के विज्ञान के लिए कला का एक तत्व है, लेकिन यह देखभाल और दृढ़ता के साथ संभव है।

बोरेलिया की संस्कृति जैव चिकित्सा अनुसंधान में प्रगति को रेखांकित करती है। बोरेलिया की संस्कृति ने कई बोरेलिया प्रजातियों के पूर्ण जीनोम और प्रोटिओम के निर्धारण की अनुमति दी है, जिसने शोधकर्ताओं को इन स्पाइरोकेट्स 54,58,59 के विकास और जीव विज्ञान को उजागर करना शुरू करने की अनुमति दी है। इसी तरह, बोरेलिया की शुद्ध संस्कृतियों तक पहुंच स्तनधारी मेजबान और आर्थ्रोपोड वेक्टर 61,62,63,64,65 के साथ बोरेलिया की कई जटिल बातचीत की समझ की अनुमति देती है, जिसमें मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली11,65 के साथ बातचीत शामिल है, संचरण के तंत्र को 29,66 का अनुमान लगाने की अनुमति देता है।, और सेलुलर मलबे से कृषि योग्य, इसलिए आवश्यक रूप से जीवित, कोशिकाओं को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण जांच उपकरण प्रदान करता है, एक अंतर जो रोगजनन के तंत्र के साथ-साथ प्रभावी उपचार आहार 8,67,68,69,70,71 को उजागर करने में महत्वपूर्ण है। जबकि इन विट्रो बोरेलिया संस्कृति को पहचान के लिए पर्याप्त रूप से प्रचुर मात्रा में स्पाइरोकेट्स होने में कई सप्ताह लग सकते हैं, नैदानिक नैदानिक अनुप्रयोगों को सीमित करना, बोरेलिया जीव विज्ञान, जीनोमिक्स, मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन और कई और अनुप्रयोगों की मौलिक समझ ने शुद्ध बोरेलिया को अलग करने की क्षमता पर भरोसा किया है। पर्यावरणीय आइसोलेट्स से संस्कृतियां, और जैव रासायनिक और आनुवंशिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त सामग्री का उत्पादन करने के लिए संस्कृति के माध्यम से उन आइसोलेट्स को बढ़ाना। तेजी से निदान और उपचार का समर्थन करने के लिए संक्रमण के लिए तेजी से प्रतिक्रिया के लिए एक सामाजिक धक्का है। इस आवश्यकता का दूसरा घटक, हालांकि, एक ठोस आधार के लिए आवश्यक जैव चिकित्सा और जैविक अनुसंधान है, जिस पर बीमारी का उचित और सफलतापूर्वक इलाज और रोकथाम की जाती है। चुनौतीपूर्ण होने के दौरान, बोरेलिया स्पाइरोकेट्स की इन विट्रो खेती संभव है और इन जरूरतों का समर्थन कर सकती है।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई थी।

Acknowledgments

इस काम को आंशिक रूप से कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद और कनाडाई लाइम रोग फाउंडेशन (एबी और वीएल), स्वीडिश रिसर्च काउंसिल (एसबी, एम-एलएफ और आईएन), टीएसीआर गामा 2 परियोजना - "जीवविज्ञान केंद्र सीएएस में आवेदन संभावित सत्यापन 2.0 का समर्थन" (टीपी 01010022) (एमजी और एनआर), और चेक गणराज्य के स्वास्थ्य मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम चित्रा 4 में छवि के लिए एस व्रांजेस (2021, रुडेंको लैब) और चित्रा 5 में छवियों के लिए जे थॉमस-एब्बेट (2021, लॉयड लैब) को धन्यवाद देते हैं। हम उन सभी शोधकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने क्षेत्र में योगदान दिया है और उन लोगों से माफी मांगते हैं जिनके काम को हम अंतरिक्ष सीमाओं के कारण उद्धृत करने में सक्षम नहीं थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 mL tubes VWR 87003-294 Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter  VWR 28145-501 Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tip Neptune BT10XLS3 Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes  Celltreat 229011B Standard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tip Neptune BT1000.96 Standard item - any supplier will do
15 mL tube Celltreat 188261 Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tip Neptune BT20 Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe  BD 309661 Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tip Neptune BT200 Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture Tubes Fisher Scientific 14-933C Standard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettes Celltreat 229025B Standard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringe BD 309657 Standard item - any supplier will do
35% BSA  Sigma A-7409 Source is important - see note
5 mL Serological pipettes  Celltreat 229006B Standard item - any supplier will do
50 mL tube Celltreat 229421 Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes  Schott Schott Nr. 26 135 115 Standard item - any supplier will do
Amikacine Sigma PHR1654 Standard item - any supplier will do
Amphotericin B Sigma A9528-100MG Standard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole Sigma PHR1126-1G Standard item - any supplier will do
BBL Brucella broth  BD 211088 Standard item - any supplier will do
Biosafety Cabinet Labconco 302419100 Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD) Fisher Scientific BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum]  Darlynn biologicals BB83-500 Standard item - any supplier will do
centrifuge  Eppendorf model 5430 Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrate Sigma C-8532 100 g Standard item - any supplier will do
CMRL Gibco BRL 21540 500 mL Standard item - any supplier will do
CMRL-1066 Gibco 21-510-018 Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene) Fisher Scientific 5000-0020 Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm Sigma P7741 Standard item - any supplier will do
Digital Incubator VWR model 1545 Standard item - any supplier will do
DMSO ThermoFisher D12345 Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilization Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane SCGPU05RE Standard item - any supplier will do
Gelatin Difco BD 214340 500 g Standard item - any supplier will do
Glass Culture Tubes Fisher Scientific 99449-20 Standard item - any supplier will do
Glucose Sigma G-7021 1 kg Standard item - any supplier will do
Glycerol Sigma G5516 Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) Labwissen Model 3220 Standard item - any supplier will do
HEPES Sigma  H-3784 100 g Standard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamine Sigma  A-3286 25 g Standard item - any supplier will do
Neopeptone Difco  BD 211681 500 g Standard item - any supplier will do
Neubauer Hematocytometer Sigma  Z359629 Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope  Leitz Standard item - any supplier will do
Phosphomycin Sigma P5396-1G Standard item - any supplier will do
Phosphomycine Sigma P5396 Standard item - any supplier will do
Pipetboy Integra Standard item - any supplier will do
Precision Standard Balance OHAUS model TS200S Standard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt) Sigma P-8574 25 g Standard item - any supplier will do
Rabbit Serum  Gibco 16-120-032 Source is important 
Rabbit Serum  Sigma R-4505  100 mL Source is important 
Rifampicin Sigma R3501-1G Standard item - any supplier will do
Sodium bicarbonate Sigma S-5761     500 g Standard item - any supplier will do
Sufametaxazole  Sigma PHR1126 Standard item - any supplier will do
TC Yeastolate Difco  BD 255752 100 g Standard item - any supplier will do
Transfer Pipettes VWR 470225-044 Standard item - any supplier will do
Trimethoprim Sigma PHR1056 Standard item - any supplier will do

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 189
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Berthold, A., Faucillion, M. L., Nilsson, I., Golovchenko, M., Lloyd, V., Bergström, S., Rudenko, N. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp. (189), e64431, doi:10.3791/64431 (2022).

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